ein GFP-markierten TMEM184A Verwendung für die Bestätigung der Heparin-Rezeptor Identität Construct

Zusammenfassung

Ein Konstrukt Codierung TMEM184A mit einem GFP-Tag am Carboxy-Terminus für eukaryotische Expressions entworfen wurde in Assays entwickelt, um zu bestätigen die Identifizierung von TMEM184A als Heparin-Rezeptor in vaskulären Zellen eingesetzt.

Zusammenfassung

Wenn neue Proteine ​​identifiziert werden durch Affinitäts-basierte Isolierung und Bioinformatik-Analyse, sind sie oft weitgehend uncharacterized. Antikörper, die gegen spezifische Peptide innerhalb der vorhergesagten Sequenz einige Lokalisierungs Experimente erlauben. Jedoch können auch andere mögliche Wechselwirkungen mit den Antikörpern oft nicht ausgeschlossen werden kann. Diese Situation bot die Möglichkeit, eine Reihe von Tests, abhängig von der Proteinsequenz zu entwickeln. Insbesondere ist ein Konstrukt, das das Gen-Sequenz am C-terminalen Ende des Proteins an das GFP-codierende Sequenz gekoppelt enthielt, wurde für diese Zwecke gewonnen und eingesetzt. Experimente Lokalisierung, Ligandenaffinität zu charakterisieren, und die Verstärkung der Funktion wurden ursprünglich entworfen und ausgeführt , um die Identifizierung von TMEM184A als Heparin - Rezeptor ¹ bis bestätigen. Zusätzlich kann das Konstrukt für Studien Adressieren Membrantopologie Fragen und detaillierter Protein-Ligand-Wechselwirkungen eingesetzt werden. Der vorliegende Bericht stellt arange der experimentellen Protokolle auf der Basis der GFP-Konstrukt TMEM184A in vaskulären Zellen exprimiert, die leicht für andere neue Proteine ​​angepasst werden könnte.

Einleitung

Identifizierung von Kandidatenproteine ​​für neuartige Funktionen hängt oft von Affinität basierende Isolation Protokolle durch partielle Sequenzbestimmung gefolgt. Jüngste Beispiele für neu identifizierten Proteine sind Transmembranprotein 184A (TMEM184A), eine Heparin - Rezeptor identifiziert nach Heparin - Affinität Wechselwirkungen ¹ und TgPH1, eine pleckstrin Homologie - Domäne - Protein , das Phosphoinositid PI (3,5) P ₂ ² bindet. Andere neuartige Proteinidentifikation beinhaltet direkte Sequenzanalyse von Peptiden , wie sie von Vit, et al. die verwendeten Trans Peptide Proteinprodukte von bisher nicht charakterisierte Gene ³ zu erkennen. In ähnlicher Weise kann die Identifizierung neuer Proteinsequenzen erreicht werden Bioinformatik unter Verwendung von zuvor charakterisierten Proteinfamilien suchen, wie Identifizierung neuer 4TM Proteine ^4. Die Prüfung der Aquaporinfamilie Gensequenzen hat also ergab die Identifizierung neuer Mitglieder mit neuen Funktionen ^5. Nach der Identifizierung, Analyse der Proteinfunktion ist typischerweise ein nächster Schritt, die manchmal einen spezifischen Assay von Protein-Funktion, wie beispielsweise in dem Aquaporin Fall untersucht werden können.

Wenn möglich, die Funktion eines neu identifizierte Protein kann mit spezifischen enzymatischen oder ähnlichen in vitro - Assays Funktion untersucht werden. Da viele Funktionen der neuen Proteine in komplexen Wechselwirkungen abhängen , die nur in intakten Zellen oder Organismen auftreten, in - vitro - Tests sind nicht immer wirksam. Jedoch müssen die in - vivo - Tests in der Weise ausgebildet sein , dass sie auf der Gensequenz abhängen. In Zellkultur und / oder einfachen Modellorganismen, kann Knockdown Nachweise für sorgen für die Protein / Funktion Identifizierung ^6. Mit neuartigen Proteine ​​identifiziert, wie oben erwähnt, ist es oft nicht einfach ein Protein abreißen zu Funktion bestätigen, eind die Gestaltung der in vivo funktionelle Assays , die auf Gensequenz abhängen wird zur Charakterisierung von neuen Proteinen wichtig.

Die kürzliche Identifizierung von TMEM184A als Heparin - Rezeptor (die Proliferation in der glatten Gefäßmuskulatur und Entzündungsreaktionen in Endothelzellen moduliert) unter Verwendung von Affinitätschromatographie und MALDI - MS - ^{1, 7} versehen , die Möglichkeit , eine Sammlung von Assays zu entwickeln , nach dem Zuschlags Ergebnisse erzielt , die mit der Identifizierung . Eine aktuelle Überprüfung bestätigt , dass Heparin spezifisch mit vielen Wachstumsfaktoren in Wechselwirkung tritt, ihre Rezeptoren, extrazellulären Matrixkomponenten, Zelladhäsion Rezeptoren und anderen Proteinen ^8. Im Gefäßsystem, Heparin und Heparansulfat - Proteoglykane (enthaltend Heparansulfatketten ähnlich in Struktur zu Heparin) interagieren mit mehreren hundert Proteine ^9. Um funktionell bestätigen that TMEM184A wurde mit Heparin-Aufnahme beteiligt und Bindung, Techniken, die das Genkonstrukt für TMEM184A eingesetzt wurden entwickelt. Der vorliegende Bericht enthält eine Sammlung von Assays auf Basis eines GFP-TMEM184A zur Verwendung konstruieren in die Identität von TMEM184A als Heparin-Rezeptor bestätigt.

Protokoll

1. Aufbau eines GFP-Protein-Construct

1. Kauf oder Design und Build ein GFP-markierten Konstrukt basiert auf dem Protein in Frage.
   HINWEIS: Bei einem gekauften Konstrukt Standardvektoren sind von kommerziellen Laboratorien, die einige oder alle der folgenden Vorschläge sind: Für ein Membranprotein, wählen Sie einen C-terminalen Position des GFP, weil es weniger wahrscheinlich ist, mit Membranprotein Handel zu stören. Betrachten wir eine Erweiterung zwischen dem Gen von Interesse und dem GFP wenn Grund ist der C-Terminus des Proteins in Frage, zu glauben, kompakt in einer Domäne des Proteins gefaltet ist. Wählen Sie das Konstrukt für die allgemeine eukaryotische Zelle Ausdruck, sondern ermöglichen die Produktion in bakteriellen Systemen konstruieren. Umfassen eine Spaltstelle (wie für die TEV-Protease), durch die GFP entfernt werden kann, wenn für einige Experimente erwünscht, wo das GFP mit der Proteinaktivität stören könnten. In anderen Einsätzen wie einem zusätzlichen Tag für die Lokalisierung oder Affinität inWechselwirkungen (zB His6). Dies war nicht erforderlich, dass die hierin beschriebenen Assays, könnten aber andere Assays zu erleichtern, oder unmittelbar benachbart zu dem Gen, vor dem GFP, wenn die Entfernung von GFP gewünscht nützlich sein.

2. GFP-TMEM184A Expression in Gefäßzellen

1. Kultur Endothel- oder vaskulären glatten Muskelzellen auf 0,2% Gelatine beschichteten Gewebekulturschalen , wie zuvor berichtet , ^{1, 6, 7.}
2. 5 mL Zellkultur Trypsin-Lösung (0,5% w / v) auf einen abgespült 100 mm oder größer, konfluente dish von Zellen. bei 37 ° C inkubieren, bis Zellen von der Platte nur freigegeben werden, und die Zellen in ein steriles Polypropylenzentrifugenröhrchen übertragen.
3. Fügen Sie einen Trypsin - Inhibitor (beispielsweise ein gleiches Volumen regulären Kulturmedium), wie in Routinekultur verwendet, um die Zelle / Trypsin - Lösung zur Trypsin - Aktivität begrenzen. Pelletieren Sie die Zellen für 5 min bei approximzüglich 600 · g (oder andere geeignete Geschwindigkeit und Zeit zu pelletieren nur die Zellen für Standard-Gewebekultur). Den Überstand aspirieren.
4. Die Zellen in 1 ml HeBS (Hepes-gepufferte Saline) Elektroporationspuffer, sind in dem Pellet oder Suspension die Menge an Zeitzellen zu begrenzen. Legen Sie die Zellsuspension auf Eis und führen verbleibenden Schritte auf dem Eis.
   HINWEIS: Pellet kann einmal mit HeBS vor der Resuspension gewaschen werden.
5. Gebe ausreichend Volumen von GFP-markiertem TMEM184A Plasmid zu den Zellen in einer Endkonzentration von 20 ug / ml DNA zu erreichen. Verwenden Sie ein identisches Protokoll für eine GFP-Konstrukt.
6. Es werden ca. 0,4 ml der Zelllösung in HeBS in einer Elektroporationsküvette. Pre-Chill die Küvetten vor der Verwendung.
7. Elektroporation der Zellen unter den folgenden Bedingungen: Exponential Decay, 500 & mgr; F, ∞ Ohm und 170 V.
   HINWEIS: Die Spannung für einen gegebenen Zelltyp sollte optimiert werden. Vorläufige Studien mit endothelialen und glatten Muskulatur cell Typen wurden mit einem GFP-vinculin Konstrukt erreicht hier angemerkt , den optimalen Spannungswert , um zu bestimmen, zB ^10.
   1. Zur Elektroporation zu optimieren, den Empfehlungen des Geräteherstellers starten (die Bedingungen für einige Standardzelltypen enthalten). Verwenden Sie das gewünschte Konstrukt oder ein fluoreszierendes Kontrollprotein in Größe und fluoreszierenden Eigenschaften auf die gewünschte Konstrukt ähnlich konstruieren.
      HINWEIS: Kleine erscheinen Nukleinsäuren in Zellen eindringen leichter als größere Konstrukte, so ein Konstrukt mit nur einem fluoreszierenden Protein kann einfacher sein, zum Ausdruck bringen, als eine größere.
   2. Verwenden der Fluoreszenzmikroskopie die Lebensfähigkeit der Zellen, den Prozentsatz der Zellen, in denen das Fluoreszenz exprimierende Konstrukt wird nach 24 und 48 h, und die Intensität der Expression zu bestimmen.
      HINWEIS: Verringern Sie die Spannung und / oder Zeit leicht, wenn das Überleben gering ist. Ziel ist es für möglichst kurzer Zeit zwischen Freisetzung von Zellen aus der Kulturoberfläche und RückkehrZellen zur Kultur Überleben zu verbessern. Ein leichter Anstieg in der Zeit oder einen zweiten Impuls kann Konstrukt Aufnahme verbessern, wenn das Überleben hoch ist und Ausdruck ist gering. Optimale Bedingungen und Ausdruck wird zwischen Zelltypen variieren. Wenn der Prozentsatz der Zellen, die das Konstrukt exprimieren, ist hoch, aber Intensität niedrig ist, die DNA-Konzentration zu erhöhen und die transfizierten Zellen über die Zeit für eine optimale Intensitätsüberwachung, die auf Proteinhalbwertszeit basierend variieren sowie Expression, Intensität verbessern. Färbungsintensität kann für einige Assays falls vergrößert werden, durch Immunfärbung von GFP mit Anti-GFP-Antikörpern
8. Nach der Elektroporation Samen der Zellen in sechs 30-mm-Gewebekulturschalen mit Deck für die Bildgebung oder in Gewebekulturschalen. Kultur die Zellen unter Verwendung von Standard-Zellkulturverfahren.
9. Optional: Ersetzen Sie das Kulturmedium nach 24 Stunden jede HeBS Elektroporationspuffers zu entfernen.

3. Visualisierung von GFP-TMEM184A Localization

1. Spülen der Zellen mit PBS und vorsichtigem Schütteln nach mindestens 24 h zur Kultivierung. Begrenzung der Exposition gegenüber hellem Licht GFP Schwund zu vermeiden.
2. Fix-Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 15 min bei RT unter leichtem Schütteln. Vermeiden Sie methanolhaltige Reagenzien, die die Zellen permeabilisiert kann. Fixierung mit Methanol verwendet werden, wenn es nicht notwendig ist, Liganden-Wechselwirkungen zu bewerten.
   Achtung: Paraformaldehyd ist giftig. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung. Verwenden Sie in einem Abzug, mit Sorgfalt, und entsorgen Sie richtig.
3. Spülen, wie oben mit PBS. Für Antikörper basierte Färbung, siehe 3.6 unten.
4. Berg Deckgläser auf Objektträger Mowiol oder einem anderen geeigneten Befestigungsmedium.
5. Bildobjektträger oder ein konfokales Fluoreszenzmikroskop mit entsprechenden Filtersätzen für GFP Anregungs- und Emissionsspektren. Konfokalmikroskopie wird wegen der Fähigkeit bevorzugt, Proben in der z-Ebene zu trennen. Speichern von Bildern in Graustufen für quantitation Zwecke im TIF-Format (zusätzlich zu den Vollfarbbilder für die Illustrationen).
6. Zum Vergleich mit WT TMEM184A von den Zellen exprimiert wird , bereiten anderen Zellen für Immunofluoreszenz unter Verwendung von primären Antikörpern gegen ein Peptid hergestellt (s) von der TMEM184A Sequenz, zB ^1. Identifizierung von GFP-TEMEM184A können auch Antikörper gegen GFP erreicht werden. Bewerten Sie die beiden Zellproben durch identische Mikroskopietechniken.

4. Rhodamin-Bindung von Heparin und Kolokalisation mit GFP-TMEM184A-transfizierten Zellen

1. Behandlung von Zellen mit 100 ug / ml Rhodamin-Heparin hinzugefügt Kulturmedium GFP-TMEM184A-exprimierenden und lassen Zellen für einen bestimmten Zeitraum zu inkubieren, typischerweise weniger als 10 min für A7r5 Zellen. Spülen und beheben, wie in 3.1 und 3.2.
   HINWEIS: Die optimale Zeit und Konzentration des Liganden hängt von Zell-Antwort, die Fluoreszenzintensität des Liganden und Bildintensität erhalten. Dieses KonzentratIonen von Heparin verwendet wurde , weil es in mehr als 50% Reaktion in anderen Assays ¹¹ führt. Diese Konzentration könnte Standard-Fluoreszenzmikroskopie-Techniken sichtbar gemacht werden, so war es nicht notwendig, sie zu erhöhen. Die Verdünnung von Rhodamin-Heparin mit unmarkierten Heparin führt zu einer geringeren Fluoreszenz in den Zellen, so ist schwieriger zu Bild und zu quantifizieren.
2. Um das Rhodamin-Heparin-Bindung aufgrund von GFP-TMEM184A Transfektion quantifizieren, bereiten identische Zellen ohne transfizierten GFP-TMEM184A.
3. Bild die Zellen mit einem konfokalen Mikroskop mit dem entsprechenden GFP unter Verwendung von (488 nm) und Rhodamin (543 nm) Anregung und Emission (500-530 nm für GFP und größer als 560 nm für Rhodamin) Werte Co-Lokalisierung zu bestimmen. Abrufen von Bildern von mindestens 50 Zellen, die aus mindestens drei getrennten Experimenten Statistiken zu erhalten. Pflegen Sie identische Einstellungen in Experimenten und verwenden eine Kontrollprobe (n) (zB Zellen , die mit keiner Behandlung) thbei Daten können verwendet werden, für die Analyse von mehreren Experimenten zu standardisieren.
4. Prüfen, die Bilder eines Computerprogramms unter Verwendung von relativen Rhodamin Bindung / Aufnahme zur Quantifizierung in jeder Zelle der Bindung zu bestimmen.
   HINWEIS: TIF Bilder sollten, da sie bequem sind für die Analyse verwendet werden und kann in Maßstab viele Computerprogramme zu Grau umgewandelt werden, wenn sie nicht von Anfang an in diesem Format gespeichert wurden. Bild J (Freeware) wurde in der vorliegenden Untersuchung verwendet und ermöglicht Bereich und Pixelintensität für jeden benutzerdefinierten Bereich in einem Bild gemessen werden.
   1. Verwenden Sie ein Freihandwerkzeug, eine Zelle in einem Fluoreszenzbild zu umkreisen und das Messwerkzeug verwenden, um die Intensität in diesem Raum zu bestimmen.
      ANMERKUNG: Diese Messungen liefern die benötigten Informationen Gesamtintensität für einen Benutzer-definierten Bereich (ganze Zelle, ein Zellkern, etc.) zu berechnen , einen Weg bietet verschiedene Zellen mit unterschiedlichen Geometrien zu vergleichen. Mittlere Intensität über eine Fläche von Hintergrund gemeldet werden können und dass erleichterns Sammlung von Hintergrundintensität für die Analyse.
   2. Export in eine Tabelle auf den Bereich von der Intensität und subtrahieren Hintergrund für die gleiche Menge an Fläche multipliziert zu berechnen. Der Mittelwert der Fluoreszenz / Zelle genügend Zellen / Experiment statistische Signifikanz zu erhalten.

5. Fluorescence Resonance Energy Transfer von GFP-TMEM184A Rhodamin-Heparin

1. Bereiten Sie transfizierten Zellen und Inkubation mit 200 ug / ml Rhodamin-markierten Liganden, wie in 3.1. Beachten Sie, dass die Inkubationszeit mit fluoreszierenden Ligand Zelltyp abhängig ist. Fix nur mit PFA, und montieren Folien für die Bildgebung.
2. Zunächst erregt bei 405 nm und Bild für Rhodamin-Emission (566-685 nm; FRET). Zweitens bei 488 für GFP (bei 493 Bild - 530) zu erregen, und drittens (- 685 bei 566 Bild) bei 561 für Rhodamin erregen. Kontrollen ohne GFP-TMEM184A oder ohne Rhodamin-Heparin sind kritisch.

6. Live-Cell-Imaging-Rhodamin-Heparin Uptake

1. Same ist das GFP-TMEM184A transfizierten Zellen in einzelne Gerichte entwickelt für Live-Cell-Imaging und zu behandeln, wie in Protokoll 3.
   HINWEIS: Die Anzahl von Zellen erforderlich ist, hängt vom Zelltyp und der Dichte gewünscht. Um die Menge an Zeitzellen in Suspension zu minimieren, keine Zellen zu zählen. Seed-Zellen aus einer 100 mm konfluenten Schale in sechs 35 mm Live-Bildgebung Gerichte Zellen in der Nähe Einmündung in 48 h zu erhalten.
2. Nach 48 h, ersetzen Sie das Medium mit Kulturmedium ohne Phenolrot.
3. Übertragen einer Schale von Zellen zu einem konfokalen Mikroskop mit einer Erwärmung der Bühne Temperatur zu halten, und das Mikroskop konzentrieren.
4. Jeweils 100 & mgr; g / ml Rhodamin-Heparin in die Schüssel und vorsichtig mischen.
5. Ab sofort beginnen, Live-Bilder aufnehmen. Wenn keine Zellaufnahme von Heparin in der Region im Hinblick auf, bewegen Sie die Schale leicht Zellen mit mindestens einer grün-Vesikel mit dem Rhodamin-Markierung zu identifizieren.
   HINWEIS: Imaging Anregungs- und Emissions Besonderheiten sind diegleiche wie für die Heparin-Aufnahme-Protokoll (Abschnitt 5). Die Zeitspanne zwischen den Bildern betrug etwa 16 s. Die Bedingungen des Experiments und dem Mikroskop bestimmt, typischerweise die Geschwindigkeit, mit der Bilder erhalten werden können.

7. Isolierung von GFP-TMEM184A und GFP aus kultivierten Zellen

1. Nach dem Entfernen mit PBS Kulturmedium und Spülen, 2 ml 0,2% (w / v) CHAPS 1x PBS-Lösung mit Protease-Inhibitoren zu einer 150 mm-Platte von Zellen GFP-TMEM184A oder GFP (für Kontrollbindungsassays) exprimieren. Kratzen Sie die Zellen aus der Schale, legen Sie die Zellen / CHAPS-Lösung in einem 15 ml Polypropylen-Röhrchen auf Eis, und mischen Sie gut durch Antippen. Führen Sie alle Schritte in helles Licht, um sicherzustellen, das GFP-Tag für den Bindungsassay unter gebleicht wird.
2. Um speziell GFP-TMEM184A (oder eine entsprechende GFP-Kontrolle) binden, fügen Sie 2 pg / ml biotinyliertem anti-GFP-Antikörper zur Lösung und Inkubation über Nacht bei 4 ° C mit Schaukeln.
3. In 500 ulStreptavidin-Agarose-Kügelchen mindestens 5 ml 0,2% CHAPS / PBS und Zentrifugation bei etwa 600 × g für 3 bis 5 min. Entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie zwei weitere Male mit frischen CHAPS / PBS jedes Mal. Beads an den Antikörper und Zelllösung und Inkubation über Nacht bei 4 ° C unter Schütteln die Perlen zu erlauben, an den biotinylierten anti-GFP-Antikörpers an das GFP oder GFP-TMEM184A gebunden zu binden.
4. Pellet die Perlen durch Zentrifugation (wie in 7.3) und entfernen Sie das ungebundene Material. Fügen Sie mindestens 5 ml 0,2% CHAPS / PBS / Protease-Inhibitoren zu waschen. Wiederholen Sie das Waschen und Zentrifugieren mindestens 3x, um effektiv jegliches ungebundene Protein zu entfernen.
5. Nach dem letzten Waschen entfernen, für 3 min die Perlen mit 1 ml 0,2 M Glycin / 0,2% CHAPS in PBS (pH-Wert auf 2,0 mit HCl) auf Eis inkubieren der Antikörper-GFP-Bindung (was frei GFP-TMEM184A oder frei zu distanzieren GFP). Vorsichtig mischen durch alle 30 s tippen.
6. Zentrifuge bei etwa 600 · g und den Überstand des gereinigten p enthält,rotein auf ein neues 15 ml-Röhrchen durch sofortige Neutralisation gefolgt von 5 ml 1 M Natriumbicarbonat (bringen den pH-Wert auf 7).
7. Konzentrieren Sie die Probe mit einem 10.000 Dalton Molekulargewicht cut-off Zentrifugalkonzentrator (verwenden Zentrifugierungsgeschwindigkeit vom Lieferanten empfohlen). Wenn das Volumen von etwa 0,5 ml erreicht, mit 0,2% CHAPS / PBS. Weiter zu konzentrieren und das Hinzufügen von mehr 0,2% CHAPS / PBS, bis mindestens zehn Volumina (-fache des Ausgangsprobenvolumen) der 0,2% CHAPS / PBS wurden hinzugefügt.
8. Um zu bestimmen, um eine Schätzung der Menge an isolierter GFP oder GFP-markierte Protein, erhalten, die eine Extinktion bei 280 nm zu lesen und vergleichen es mit einer Standardkurve, hergestellt aus Rinderserumalbumin oder andere Kontrollproteins in dem gleichen Puffer.
   HINWEIS: Aufgrund der Extinktionskoeffizient Unterschiede, diese Konzentration ist eine Schätzung, kann aber eine ungefähre Proteinkonzentration liefern weitere Analyse zu erleichtern, ohne Probe zu verschwenden. Die genaue Proteinkonzentration kann abschreckenVerwendung einer Mikro-Lowry-Protein-Assay Herstellung bestimmter verminten das Standardprotein in dem gleichen Puffer wie die Probe herzustellen. Eine weitere Analyse des isolierten Proteins durch Western-Blotting des isolierten Proteins (mittels Antikörpernachweis für GFP) und der Vergleich mit dem vorhergesagten Molekulargewicht erreicht werden. Verwendung der TMEM184A Antikörper sollten alternativ ergeben eine Bande der vorhergesagten Grße Konstrukts, könnte aber auch in einem WT TMEM184A Band führen, wenn Dimere (oder höherer Ordnung Oligomere) in der Probe vorhanden sind. Eine Schätzung der Reinheit kann durch Färben einer blot für Gesamt-Protein aus der isolierten Probe vs Gesamtprotein aus einem Aliquot des Ausgangsmaterials erhalten werden.

8. In - vitro - Heparin - Bindungsassay

1. Bereiten Sie eine schwarze Avidinbeschichtete 96-Well-Platte durch Waschen mit 200 & mgr; l 0,2% CHAPS / PBS dreimal für 5 Minuten unter Schütteln. Bereiten Sie eine identische schwarze nicht-beschichteten 96-Well-Platte die gleiche Waschverfahren verwendet wird. Bereite ein ..... vorLayout für die experimentellen Proben (in dreifacher Ausführung) während des Assays zu folgen. Fügen Sie Brunnen für Standard-Heparin-Konzentrationen, Pufferkontrollen und Vertiefungen mit GFP Proben ohne Bleichen von GFP zu bestätigen Heparin.
   HINWEIS: Wenn optimierte Isolation oder Ligand-Wechselwirkung Puffer für das fragliche Protein verschieden sind, tun alle Plattenzubereitungen und Waschen mit dem optimalen Puffersystem.
2. Je 100 & mgr; l 60 pmol / Well biotinylierter anti-GFP in alle Vertiefungen in der Avidinbeschichtete Platte, wo GFP Bindung erwünscht ist. Die Menge an Antikörper ist ausreichend zu sättigen nur den hochaffinen Avidin in den Vertiefungen.
   1. In Puffer nur zu allen Vertiefungen für Kontrollzwecke verwendet werden (keine GFP oder GFP-TMEM184A gewünschte Bindung). Verschließen Sie die Vertiefungen mit einer Plattenabdeckung Verdunstung verhindern. Inkubieren für 2 h bei RT unter Schütteln.
      HINWEIS: Volumes zu den Vertiefungen und Inkubationszeiten hinzugefügt werden, auf Empfehlungen des Anbieters basiert.
3. Waschen Sie alle Vertiefungen dreimalfür 5 min mit 200 & mgr; l 0,2% CHAPS / PBS.
4. In 100 ul von 5 nmol / Well GFP-TMEM184A oder GFP zu geeigneten Vertiefungen in der Avidinbeschichtete Platte und Inkubation für 1 h bei RT unter Schütteln. Waschen Sie wieder wie in 8.3.
   ANMERKUNG: Diese Proteinkonzentration wurde gewählt, um sicherzustellen, daß alle Seiten mit überschüssigem GFP oder GFP-TMEM184A gesättigt waren. Dies ist wichtig, daß die gleiche Menge an Protein zu gewährleisten, zu jeder Vertiefung gebunden ist. Geringere Mengen an Protein könnte sättigen auch die Stellen, die Möglichkeit, dass durch die Auswertung ungebundene Protein, das nach Inkubation mehrere Konzentrationen des Proteins mit der Platte und den Vergleich ungebundene Protein und Ligand-Bindungs-Assays untersucht werden konnte.
5. Bereiten verschiedener Konzentrationen von Fluorescein-markiertem Heparin, beispielsweise 10, 25, 50, 75, 100, 200 ug / ml, in 0,2% CHAPS / PBS. Tun Sie dies und alle im Dunkeln verbleibende Arbeit.
   HINWEIS: Vor Konzentrationen spezifische Konzentrationen für andere Liganden vorbereiten sollte für die protei bestimmt werdenn Ziel in Frage. Die niedrigste Konzentration sollte in der Plattenleser nachweisbar sein. Deshalb ist es wichtig, zuerst den Bereich bestimmen, die genau in dem Puffersystem eingesetzt detektiert werden kann. Dann bestimmen den Bereich messbare Bindung zu erhalten benötigt. Konzentrationen von Fluorescein-Heparin unter 10 & mgr; g / mL registrieren nicht konsistent in dem Plattenlesegerät unter Pufferbedingungen verwendet werden. In ähnlicher Weise, während Rhodamin-Heparin, wie in den anderen Tests verwendet, könnte in dem Plattenlesegerät sichtbar gemacht werden, in den Pufferbedingungen und bei den Konzentrationen für die Bindung erforderlich waren die Fluoreszenzmesswerte für die Standards nicht reproduzierbar anders mit diesem Fluorophor.
6. Füge 100 & mgr; l Fluorescein-Heparin zu entsprechenden Testvertiefungen in den Avidin-beschichteten Platte und Konzentration Standardvertiefungen in sowohl dem Avidin-beschichteten und der unbeschichteten Platte. Inkubieren für 10 min bei RT unter Schütteln. Halten Platten im Dunkeln (oder Folie abgedeckt).
7. Mit Hilfe einer Platte reader, notieren Sie die anfängliche Fluoreszenzemission aus dem Heparin in den Kontrollvertiefungen der beiden Platten und der anfänglichen Fluoreszenz (gesamt) Emission von Wells mit immobilisiert GFP-TMEM184A oder GFP in der Avidinbeschichtete Platte. Falls erforderlich, stellen Sie die Geräteverstärkung Detektion von Fluoreszenz Heparin zwischen dem niedrigsten und dem höchsten Konzentrationen zu gewährleisten.
   HINWEIS: Stellen Sie die Plattenleser bestimmte liest Brunnen von oben und liest an der optimalen Stelle in den Vertiefungen, wenn diese einstellbar ist. Für die Studie in Frage, war die optimale Lage, ca. 75% unter den Vertiefungen. Informationen zur Verfügung mit dem Plattenlesegerät sollte Vorschläge liefern, die auf die Plattenleser in Frage eindeutig sind für Assays der gebundenen Probe in schwarzen Platten zu lesen.
8. Entfernen ungebundenen fluoreszierenden Heparin aus Brunnen mit immobilisiert GFP-TMEM184A oder GFP aufnehmen und in entsprechende Vertiefungen in der nicht beschichtete schwarze Platte. Unmittelbar lesen Sie die Fluoreszenzemission.
9. 100 l Frisch 0,2% CHAPS / PBS zurück into Brunnen, aus denen das Fluorescein-Heparin wurde entfernt und die Fluoreszenzemission gelesen.
10. Wiederholen Sie die Schritte 8,8-8,9 3x.
    HINWEIS: Diese Messwerte von der beschichteten Platte zeigen Fluorescein Heparin verbleibenden in den GFP oder GFP-TMEM184A Brunnen. Wenn signifikante Fluoreszenz in der dritten ungebundene Probe gefunden wird, sollte eine zusätzliche Wasch auftreten. Wenn Fluoreszenz in jedem Waschen entfernt werden fortgesetzt, der Ligandenbindung könnte eine geringe Affinität sein, und die Bedingungen sollten neu bewertet werden. Die letzte Lesung stellt das gebundene Heparin Lesung.
11. Nehmen Fluoreszenzemission von den entfernten, ungebunden, Proben in der nicht-beschichteten Platte, zu erhalten Nummern für jede Wäsche. Dies sind die "ungebundene" Lesungen.
12. Verwenden Gesamtwerte Heparin Emission in 8.7 erhalten die richtigen Mengen an Heparin zu bestätigen zu jeder Vertiefung gegeben. Subtrahiert durchschnittlichen Hintergrundwerte von den Werten.
    HINWEIS: Wells ohne Fluorescein-Heparin als Hintergrund dienen aufgrund Antikörper, GFP und Puffer. Average der Hintergrund wiederholt den Hintergrundwert zu erhalten. Subtrahieren durchschnittlichen Hintergrundwerte von den gebundenen und ungebundenen Lesungen tatsächlichen Werte zu erhalten.
13. Beschäftigen eine graphische Darstellung der Emission gegen insgesamt Fluorescein-Heparin das Ausmaß der Emission gegen Heparinmenge zu bestimmen, hinzugefügt.
    HINWEIS: Antikörper allein oder Antikörper und Antigen resultiert in einem gewissen Quenchen der Fluoreszenz. Daher wurde die Gesamt-Heparin bezogen auf das Gesamt hinzugefügt Heparin bestimmt, wie in 8.7 festgestellt.
14. Zeichnen Sie die korrigierte gebundenen Heparin gegen den zusätzlichen Heparin für die dreifacher Ausführung sowohl in der GFP-TMEM184A Fall und das GFP-Fall.
15. Bestimmen freier Ligand durch die ungebundenen Messwerte aus allen Waschungen für eine bestimmte Konzentration hinzugefügt wird.

Ergebnisse

Während in der Theorie, die Transfektion von DNA in Zellen jeder konstruieren könnte mit lipophilen Transfektionsreagenzien durchgeführt werden, zeigen früheren Berichten effektiver Transfektion von GFP - Konstrukten in endothelial Elektroporation ¹² unter Verwendung von Zellen. Das Protokoll hier bereitgestellt typischerweise erreicht GFP-Konstrukt die Expression in mehr als 80% der primären abgeleitete Endothelzellen und glatte Muskelzellen verwendet. Entwurf de...

Diskussion

Die Protokolle , die hier berichtet wurden entwickelt ¹ bestätigenden Beweis für die Identifizierung von TMEM184A als Heparin - Rezeptor in vaskulären Zellen. Knockdown Techniken werden als ein Mechanismus zur Bestätigung der Identifizierung neuer Proteine ​​routinemäßig eingesetzt. Allerdings ist einige Funktionsverlust nach Zuschlags typischerweise nicht ausreichenden Nachweis, dass ein Kandidat Protein ist eigentlich die richtige Rezeptor (oder andere funktionelle Protein). Es ist auch wichtig...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
GFP-TMEM184A Konstrukt	OriGene	RG213192
Rhodamin-Heparin	Creative PEGWorks	HP-204	Lichtempfindliches
Fluorescein-Heparin	Creative PEGWorks	HP-201	Lichtempfindliches
Mowiol	EMD Millipore	475904-100GM
Paraformaldehyd (PFA, methanolfrei)	Thermo Sci Pierce Biotech, erhältlich über Fisher Scientific	PI28908 bei Fisher	Use in Fume Hood
Reacti-bind Neutravidin-Platten (Avidin-beschichtete schwarze 96-Well-Schalen)	Thermo Sci Pierce Biotech, über Fisher Scientific	PI15510 bei Fisher	Achten Sie auf die Haltbarkeit
Schwarze 96-Well-Platten	Corning Life Sciences Plastic, gekauft über Fisher Scientific	064432 bei Fisher
A7r5 vaskuläre glatte Muskelzellen Linie	ATCC	CRL 1444	Kann in MEM-Medium1
BAOEC Rinder-Aorten-Endothelzellen	Cell Applications, Inc.	B304-05	Kultur, wie anfänglich empfohlen, kann zur Fortsetzung der Kultur in MEM-Medium ausgetauscht werden1,7
BAOSMC glatte Bauchmuskelzellen der bovinen Aorta	Cell Applications, Inc.	B354-05	Kultur, wie anfänglich empfohlen, kann in MEM-Medium ausgetauscht werden, um die Kultur fortzusetzen1
RAOEC Aorten-Endothelzellen der Ratte	Cell Applications, Inc.	R304-05a	Kultur, wie ursprünglich empfohlen, kann in MEM-Medium ausgetauscht werden, um die Kultur fortzusetzen7
Biotinyliertes Anti-GFP	Thermo Sci Pierce Biotech, über Fisher Scientific	MA5-15256-BTIN
Streptavidin-beschichtete Kügelchen	Sigma	S1638
HeBS	Erhältlich von Bio-Rad		Kann im Labor hergestellt werden. Der pH-Wert beträgt 6,8
TMEM184A Antikörper gegen den N-Terminus	Santa Cruz Biotechnology	sc292006	Einziger bekannter TMEM184A Antikörper gegen die N-terminale Region.
TMEM184A Antikörper gegen den C-Terminus	Gewonnen von ProSci Inc., Poway, CA	Pro Sci 5681	ProSci verwendet in Abbildung 1
GFP Antikörpern	Santa Cruz Biotechnology	sc9996	Verwendet in Abbildung 5
Sekundärantikörpern, markiert mit TRITC oder Cy3	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA	711 025 152 (Esel Anti-Kaninchen, TRITC) 715 165 150 (Esel Anti-Maus, Cy3)	Minimale Kreuzreaktivität zur Minimierung unspezifischer Fleckenbildung.
CHAPS	Erworben von Sigma	C5849	Bitte beachten Sie, dass diese Katalognummer nicht mehr hergestellt wird. Der Lieferant wird über den Ersatz informieren.
Live-Bildgebung 35-mm-Schüsseln	MatTek (Ashland MA)	P35G-1.0 – 20 mm - C
Konfokales Mikroskop	Zeiss	LSM 510 Meta mit einer 63-fachen Öl-Immersionslinse	Wird für Bilder und Live-Aufnahmen in Bildern 1, 2 und 3
Konfokalmikroskop	Nikon	C2+ konfokal mit einer 60-fachen Öl-Immersionslinse	Wird für Bilder in Abbildung 5
Konfokalmikroskop	Zeiss	Zeiss LSM 880 mit einer 63-fachen Öl-Immersionslinse	Wird für Bilder in Abbildung 2C
Elektroporationsgeräten	verwendet Bio-Rad	Gene Pulser X-Cell System
Elektroporationsküvetten	Erhältlich bei MidSci	EC2L	Kann auch vom Gerätelieferanten bezogen werden
Plattenleser	TECAN	TECAN Infinite® m200 Pro Plate Reader	Messwerte in der Mitte der Vertiefungen und nicht an der Oberfläche.
Computerprogramm zur Messung der Färbeintensität	Bild J	https://imagej.nih.gov/ij/ Programm und Informationen sind online verfügbar	Jedes geeignete Programm kann verwendet werden. Weitere Informationen finden Sie https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html
Zellkultur-Trypsin-Lösung	Sigma	T4174	als 10x-Lösung erworben