Kartierung der Bindungsstelle eines Aptamer auf ATP Mit Micro Thermophorese

Zusammenfassung

MicroScale Thermophorese (MST) ist eine empfindliche Technologie zur Charakterisierung von Aptamer-Ziel-Wechselwirkungen. Dieses Manuskript beschreibt ein MST-Protokoll zur Charakterisierung von Aptamer-Kleinmolekül-Wechselwirkungen.

Zusammenfassung

Die Charakterisierung molekularer Wechselwirkungen in Bezug auf grundlegende Bindungsparameter wie Bindungsaffinität, Stöchiometrie und Thermodynamik ist ein wesentlicher Schritt in der Grundlagen- und angewandten Wissenschaft. Die mikroskalige Thermophorese (MST) ist eine empfindliche biophysikalische Methode, um diese wichtigen Informationen zu erhalten. Basierend auf einem physikalischen Effekt namens Thermophorese, der die Bewegung von Molekülen durch Temperaturgradienten beschreibt, ermöglicht diese Technologie die schnelle und präzise Bestimmung von Bindungsparametern in Lösung und die freie Wahl der Pufferbedingungen (von Puffer bis zu Lysaten/Seren). MST macht sich die Tatsache zunutze, dass ein ungebundenes Molekül eine andere thermophoretische Bewegung zeigt als ein Molekül, das sich im Komplex mit einem Bindungspartner befindet. Die thermophoretische Bewegung wird im Moment der molekularen Wechselwirkung aufgrund von Änderungen der Größe, der Ladung und der Hydrathülle verändert. Durch den Vergleich der Bewegungsprofile verschiedener molekularer Verhältnisse der beiden Bindungspartner können quantitative Informationen wie die Bindungsaffinität (pM bis mM) bestimmt werden. Selbst schwierige Wechselwirkungen zwischen Molekülen kleiner Größe, wie Aptameren und kleinen Verbindungen, können mit MST untersucht werden. Unter Verwendung der gut untersuchten Modellinteraktion zwischen dem DNA-Aptamer DH25.42 und ATP bietet dieses Manuskript ein Protokoll zur Charakterisierung von Aptamer-Kleinmolekül-Wechselwirkungen. Diese Studie zeigt, dass MST hochsensitiv ist und die Kartierung der Bindungsstelle des 7,9 kDa DNA-Aptamers auf das Adenin von ATP ermöglicht.

Einleitung

Wechselwirkung zwischen Molekülen ist die Basis der Natur. Daher Wissenschaftler in vielen Bereichen der Grundlagen- und angewandten Forschung versuchen die grundlegenden Prinzipien der molekularen Wechselwirkungen verschiedener Arten zu verstehen. Micro Thermophorese (MST) können Wissenschaftler die schnelle, präzise und kosteneffiziente und qualitätskontrollierte Charakterisierung von molekularen Wechselwirkungen in Lösung durchzuführen, mit einer freien Wahl von Puffern. Es gibt bereits mehr als 1.000 Publikationen MST mit, ab 2016 allein, beschreibt verschiedene Arten von Analysen, einschließlich Bibliothek Vorführungen, Ereignis Validierungen Bindung, kompetitiv....

Protokoll

1. Vorbereitung der Aptamer-Funktion Stock

1. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers und lösen das Oligonukleotid (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, Sequenz aus Referenz ¹⁸⁾ in Wasser, einer 100-uM Endkonzentration zu erreichen.
2. Bereiten Sie die Aptamer - Arbeitslösung durch Verdünnen des Oligonukleotid - Lager auf 200 nM mit Bindungspuffer (20 mM Tris, pH 7,6; 300 mM NaCl, 5 mM MgCl _2; 0,01% Tween 20).
3. Inkubieren Sie die Mischung für 2 min bei 90 ° C, lassen Sie sofort die Probe auf Eis abkühlen, und die Probe bei Raumtemperatur verwenden.

2. Herstellung der Ligand Verdünnungsre....

Ergebnisse

In dieser Studie wurde MST die Bindungsstelle des DNA - Aptamer DH25.42 ¹⁸ an ATP zu charakterisieren aufgetragen. Im Gegensatz zu anderen Studien , die die Wechselwirkung von ATP oder ATP-nachahmt kleine Moleküle mit Proteinen zufällig markiert mit einem oder mehreren Fluorophoren ^38-40 charakterisierenden umfasst diese Studie eine markierte Version des 7,9 kDa ssDNA Aptamer mit einem Cy5 - Molekül am 5'Ende . Verschiedenen ATP-Derivate und verwandte Moleküle, .......

Diskussion

Qualitätskontrollen:

Unspezifische Klebe- / Adsorption von Probenmaterial an Oberflächen sowie Aggregationseffekte, haben einen dramatischen Einfluss auf die Qualität der Affinitätsdaten. Doch nur wenige state-of-the-art Technologien bieten genaue und schnelle Möglichkeiten zu überwachen und diese Effekte zu vermeiden. MST bietet integrierte Qualitätskontrollen, die erkennen und helfen, diese Probleme zu überwinden, so dass für die schrittweise Optimierung der technischen Einrichtung. Wichtige .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Aptamer-Bindungspuffer			20 mM Tris pH 7,6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0,01% Tween-20
Fluoreszenzmarkiertes ATP-Aptamer	IDT, Leuven, Belgien		Sequenz: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3
	ATP Sigma Aldrich, Deutschland	A2383	10 mM Stammlösungen gelagert bei - 20 ° C
ADP	Sigma Aldrich, Deutschland	A2754	10 mM Stammlösungen gelagert bei - 20 ° C
AMP	Sigma Aldrich, Deutschland	A2252	10 mM Stammlösungen, gelagert bei - 20 ° C
Adenine	Sigma Aldrich, Deutschland	A8626	10 mM Stammlösungen gelagert bei - 20 &/�; C
SAM	Sigma Aldrich, Deutschland	A7007	10 mM Stammlösungen gelagert bei - 20 ° C
dATP	Sigma Aldrich, Deutschland	11934511001	10 mM Stammlösungen, gelagert bei - 20 &Grad; C
	CTP Sigma Aldrich, Deutschland	C1506	10 mM Stammlösungen gelagert bei - 20 ° C
GTP	Sigma Aldrich, Deutschland	G8877	10 mM Stammlösungen gelagert bei - 20 ° C
Monolith NT.115	NanoTemper Technologies, München, Deutschland	MO-G008	Blau/Roter Kanal MST-Baustein mit Standarddetektor, Monolith NT115 pico ist ein MST-Baustein mit hochempfindlichem Detektor
Monolith NT.115 Kapillaren Standard	NanoTemper Technologies, München, Deutschland	MO-K002
Eppendorf PCR-Röhrchen	Eppendorf, Deutschland	30124537
Monolith Steuerungssoftware. 2.1.33, vorinstalliert auf das Gerät	NanoTemper Technologies, München, Deutschland
MO.Affinitätsanalyse v2.1.1	NanoTemper Technologies, München, Deutschland
Kaleidagraph 4.5.2	Synergy Software