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Methodenartikel

Ein Syngenetische Maus-Modell von metastasierendem Nierenzellkarzinom für Quantitative und Longitudinal Beurteilung der vorklinischen Therapien

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DOI:

10.3791/55080

⸱

12. April 2017

 ,  ,  , 
1Department of Urology, University of Minnesota, 2Masonic Cancer Center, University of Minnesota, 3Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, University of Minnesota, 4Department of Medical Microbiology, Immunology and Cell Biology, Southern Illinois University School of Medicine, 5Simmons Cancer Institute

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Umsetzung eines orthotopischen Modell des Nierenzellkarzinoms in immunkompetenten Mäusen liefert den Ermittler ein klinisch relevantes System durch das Vorhandensein einer primären Nierentumor und Lungenmetastasen im gleichen Tiere definiert. Dieses System kann verwendet werden , um präklinisch eine Vielzahl von Behandlungen in vivo zu testen.

Zusammenfassung

Das Nierenzellkarzinom (RCC) beeinflusst> 60.000 Menschen in den Vereinigten Staaten jährlich und ~ 30% der RCC-Patienten hat mehrere Metastasen zum Zeitpunkt der Diagnose. Metastasierendem RCC (mRCC) unheilbar ist, mit einer medianen Überlebenszeit von 18 Monaten. Immune basierte Interventionen (zB Interferon (IFN) und Interleukin (IL) -2) induziert dauerhaft Reaktionen in einem Bruchteil mRCC Patienten, und Multi - Kinase - Inhibitoren (zB Sunitinib oder Sorafenib) oder anti-VEGF - Rezeptor - monoklonalen Antikörper (mAb) sind weitgehend palliativ, als komplette Remissionen sind selten. Solche Mängel in den derzeitigen Therapien für mRCC Patienten bieten die Gründe für die Entwicklung neuer Behandlungsprotokolle. Eine Schlüsselkomponente in der präklinischen Testung neuer Therapien für mRCC ist ein geeignetes Tiermodell. Vorteilhafte Merkmale, die die menschliche Erkrankung sind einen primären Nierentumor, Nierentumor Metastasen und ein intaktes Immunsystem zu untersuchen jede Therapie-driven immune effecto rekapitulierenr Reaktionen und die Bildung von tumorinduzierten immunsuppressiven Faktoren. Dieser Bericht beschreibt eine orthotoper mRCC Mausmodell, das alle diese Eigenschaften hat. Wir beschreiben eine intrarenalen Implantationstechnik der Mausnieren Adenokarzinom-Zelllinie unter Verwendung von Renca, gefolgt von der Beurteilung des Tumorwachstums in der Niere (primäre Standort) und die Lunge (metastatische Stelle).

Einleitung

Das Nierenzellkarzinom (RCC) ist für die Mehrzahl der bösartigen Nieren Neoplasmen und etwa 3% aller Erwachsenen malignen Erkrankungen weltweit 1, 2. Wegen dem Mangel an Symptomen, Fehldiagnose und unzureichende Screening - Tools für RCC, fast 30% der Patienten mit metastasierendem RCC (mRCC) zum Zeitpunkt der Diagnose, mit einem zusätzlichen 20 bis 30% der Patienten mit einem metastasierenden Stadium 2 voran präsentiert. Diese Fälle führen zu ~ 13.500 Todesfällen pro Jahr 1, 3. Obwohl frühere Erkennung und Behandlung von primären RCC verbessert haben, fährt die Rate der RCC-Todesfälle zu erhöhen, was darauf hindeutet , dass metastatische Erkrankung für die Mortalität 3 weitgehend verantwortlich ist. Therapieentwicklung für RCC hat sich in den letzten zehn Jahren mit der Entdeckung und Umsetzung von gezielten Therapien und Immuntherapien fortgeschritten. Leider progressionsfreie survival und das Gesamtüberleben von fortgeschrittenen Fällen sind immer noch gut unter 2 Jahren für die Mehrheit der Patienten 4, 5, 6. Diese Statistiken rechtfertigen die Notwendigkeit für die weitere Forschung in die Identifizierung und Entwicklung von wirksamen Behandlungen für RCC. angemessen zu therapeutischen Interventionen für mRCC, translational-relevanten vorklinischen Modellen der Krankheit voran zunächst erforderlich.

Entwicklung einer relevanten und konsistentes Modell der menschlichen Zustand der fortgeschrittenen RCC rekapitulieren sollte einige wichtige Fragen beantworten: 1) Ist das Modell anatomisch relevant; 2) Ist den Tumorfortschritt ähnlich wie bei der menschlichen Pathologie; 3) Sind Metastasen aus dem Primärtumor entstehen; und 4) Kann primäre und metastatischen Tumorprogression im Laufe der Zeit überwacht werden? In Abhängigkeit von der Art der Behandlung untersucht, Maus RCC Tumorzellinien, menschliche Tumorzelllinien RCC und humanen RCC Patienten stamm xenogFlöße können bei immunkompetenten oder immungeschwächten Mäusen verwendet werden. Ein Wirt , der mit einem intakten und funktionalen Immunsystem ist für jene Studien erforderlich , einige Aspekte der Immuntherapie Auswertung, was die Verwendung der gut beschriebenen Renca Zelllinie aus einem spontanen renalen Adenokarzinom abgeleitet von Balb / c - Mäusen 7. Die meisten Studien injizieren Renca - Zellen subkutan (sc), die einen einfach zu messen lokalen Tumor bildet oder intravenös (iv) in Balb / c - Mäuse Versuch Lunge "Metastasen" zu erzeugen , 8, 9, 10, 11, 12. Verwendung eines sc-implantierten Tumor Renca menschliche RCC Modell hat eine Anzahl von Einschränkungen, einschließlich ungenauer Innervation Vaskulatur 13, Unterschiede in der Mikroumgebung , 14, 15, und ein Mangel an Organ- / Tumorzell Communication 13, 16. Zusätzlich metastasieren viele sc Tumoren (insbesondere Renca) nicht zu distalen Organen, die Untersuchung eines Ereignisses Hemmung , die ein gemeinsames klinisches Merkmal 17 ist. Zur Untersuchung mRCC können Renca-Zellen iv injiziert werden, um Tumorbelastung in der Lunge am primären Ort von Metastasen in RCC Patienten herzustellen. Die IV - Injektionsverfahren metastatischen Tumoren zu initiieren, jedoch erlaubt es nicht , die Untersuchung , wie, wann und warum die Zellen aus dem Primärorgan (dh die Niere) an den entfernten Ort migriert. Ein Modell mit sowohl primärer und metastatischen Krankheit offensichtlich im gleichen Tiere ist entscheidend für die Progression und Behandlung von fortgeschrittener Erkrankung zu untersuchen, besonders wenn man bedenkt, dass Metastasen typischerweise die Ursache für die Sterblichkeit bei diesen Patienten ist.

Unser Labor hat ein Mausmodell für mRCC entwickelt, die oben umrissenen alle Funktionen enthält. Um festzustellen, primary, orthotopischen Tumoren werden Renca-Zellen direkt in die Niere des Tieres durch die transluzente Peritoneum implantiert. Ein kleiner Schnitt in der linken Flanke ermöglicht die Visualisierung der Milz (als Orientierungspunkt) und die linken Niere. Unter Verwendung einer kleinen Nadel, sind Renca-Tumorzellen für orthotopische Implantation direkt in die Niere durch das Peritoneum injiziert. Im Vergleich zu anderen Methoden der Renca - Zellen unter die Nierenkapsel 18 ist diese Methode der Implantation Implantation ermöglicht einen höheren Durchsatz, da es ziemlich nicht-invasive, nicht Vernähen erforderlich ist , ist eine niedrige Schmerz Klasse und ist zeitsparend , wenn geübt.

Diese gut charakterisierten Modellergebnisse in reproduzierbarer Primärtumorbelastung (~ 99% Aufnahmerate) in der injizierten Niere sowie metastatischen Tumorbelastung in der Lunge. Die wesentlichen Vorteile dieses Modells sind seine syngenen Natur, für die Immuntherapie Untersuchungen zu ermöglichen; seine spontanen Metastasen, zu studieren, um eindvanced Krankheit; und seine orthotope Implantation, die anatomische Auswirkungen auf den Krankheitsverlauf und die Behandlung zu modellieren. stark profitieren von der Nutzung dieses Modells während der präklinischen Entwicklung gezielt Therapien RCC auf Targeting würde.

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Protokoll

Das folgende Protokoll beschreibt ein experimentelles Verfahren zum Induzieren und Überwachen des Wachstums von experimentellen orthotopischen Nierentumoren und möglichen spontaner Metastasen. Alle folgenden Verfahren werden in Einklang mit dem institutionellen Richtlinien und anerkannten Verfahren im Hinblick auf die humane Verwendung von Versuchstieren durchgeführt.

1. Wartung von Zelllinien

  1. Pflegen murine renal-Adenokarzinom-Zelllinie, Renca, in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium mit 10% fötalen Kälberserum (FCS) supplementiert, 1% Penicillin-Streptomycin und 1 mM jeweils von nicht-essentiellen Aminosäuren, L-Glutamin und Natriumpyruvat (als komplettes RPMI bezeichnet). Kulturzellen in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2.
    Hinweis: Wie bei jeder etablierten Zelllinie, ist es empfehlenswert, niedrige Passage-Nummer Renca-Zellen für die Transfektion und nachfolgende Implantation zu verwenden, um alle phänotypischen oder genetische Veränderungen zu minimieren, die nach Langzeit Kult auftreten könntenure.
    1. Verwenden, um ein Transposon-System Renca-Zellen zu konstruieren, in stabiler Weise der grün fluoreszierendes Protein (GFP) und Glühwürmchen-Luciferase zu exprimieren.
      1. Verwendung eine kationischen Liposomen basierende Transfektionsreagenz, co-transfizieren Renca-Zellen mit einem Transposase-Expressionsvektor (pPGK-SB11) und eine Transposon-Vektor-Codierung für die Expression der Firefly Luciferase, sowie eine Fusions-Gen-Kodierung für GFP und die Zeocin-Resistenz-Gene , die beide unter der transkriptionellen Kontrolle eines bidirektionalen Promotor (PKT2 / Lubig) 19.
      2. Zwei Tage später Platte der transfizierten Zellen bei einer Grenzverdünnung und damit die Zellen expandieren in komplettem RPMI mit Zeocin ergänzt (300 ug / ml). Bestätigen GFP-Expression in jedem Klon mittels Durchflusszytometrie. Diese Zellen werden Renca-GL bezeichnet.
        HINWEIS: Die Begrenzung Verdünnung Klonen die ausgewählten Zellen erlauben, aus einer einzelnen Zelle abgeleitet werden.
  2. Einzupflanzen i Renca-Zellen intrarenally, bereiten Renca-Zellennto einer Einzelzellsuspension bei 2 x 10 6 Zellen / ml in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS).
    1. Entfernen anhaftende Renca-Zellen aus dem Gewebekulturflasche unter Verwendung von 0,25% Trypsin in HBSS. Nach ~ 5 min, fügen kompletten RPMI in den Kolben um das Trypsin und übertragen Sie die Zellen in ein Zentrifugenröhrchen zum Waschen zu neutralisieren. Zentrifuge die Zellen bei 300 g Relativzentrifugalbeschleunigung Kraft (RCF xg) für 5 min bei 25 ° C.
    2. Man dekantiert den Überstand und die Zellen in HBSS. Zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und die Lautstärke mit HBSS , um 2 x 10 6 Zellen / ml.
    3. Zeichnen Sie die Zellen in eine 1-ml-Spritze, ausgestattet mit einer 18-Gauge-Nadel Scherspannung auf den Zellen zu verhindern. Ersetzen die 18-Gauge-Nadel mit einer 28-Gauge-Nadel vor der Injektion der Tumorzellen. Eine Injektion von 0,1 mL liefert 2 x 10 5 Zellen in der Niere.

2. OP-Bereich Vorbereitung

  1. Vorbereiten eines sterilen chirurgischenGebiet in einem biologischen Sicherheit Kabinett durch ein steriles chirurgisches Abdecktuch über ein Heizkissen platzieren. Sammeln Sie alle Verbrauchsmaterialien, einschließlich Pinzetten, Skalpell, Schere, Augentropfen, 5% Povidon-Jod antiseptisch, und sterile Gaze. Autoclave alle Instrumente vor dem Gebrauch.
  2. Führen Sie die Operation eine aseptische Spitzentechnik. Resterilisieren Instrumente zwischen den Tieren mit einem Wulst Sterilisator. Tragen sterile Handschuhe, einen Laborkittel und eine Gesichtsmaske.

3. Vorbereitung der Tiere

  1. Anesthetize die Mäuse mit Ketamin / Xylazin (87,5 mg / kg und 12,5 mg / kg bzw. ip) nach institutionellen Richtlinien. Bestimmen Sie Narkosetiefe durch eine Zehen Prise durchführen.
  2. Wenn das Tier nicht reagiert , in Betracht gezogen, bereitet die Injektionsstelle (zB linke Flanke) an Balb / c - Mäusen durch Rupfen (mit Fingern) oder Rasieren (mit Clippers) , um das Fell.
  3. Bewegen , um die Mäuse vor der Operation Vorbereitungsbereich (zB der Gehäusekäfig) zu dem Operationsbereich und wenden vet Salbe auf demAugen Trockenheit zu verhindern. Liberally Tupfer die vorbereitete Inzisionsstelle mit 5% Povidon-Jod antiseptisch.
  4. Einzuspritzen Bupivacain-Hydrochlorid (0,1 ml einer 2,5 mg / ml Lösung, sc) in den Bereich, wo der Schnitt wird als präoperative Analgesie durchgeführt werden.
  5. Führe einen einzigen Einschnitt (~ 1,0 bis 1,5 cm) auf der linken Flanke des Tieres ein steriles Skalpell oder eine Schere vorsichtig, um nicht das Peritoneum zu durchdringen. Trenne die Dermis aus dem Peritoneum mit einer sterilen Schere. Dab die Inzisionsstelle mit sterilen Baumwollgaze kein Blut zu entfernen.
  6. Halten Sie die Maus mit beiden Händen, die linke Hand mit dem Kopf und die rechte Hand zu halten, um die Flanke zu unterstützen.
  7. Identifizieren der Milz durch das Peritoneum und mit einem Finger der rechten Hand, palpiert die Maus von unten; sein die Niere sollte nun sichtbar durch das Peritoneum. Halten Sie einen festen Halt des Tieres Spannung durch das Peritoneum und Niere zu liefern.
  8. Eine zweite Person soll den Tumor ce injizierenLLS (hergestellt in Abschnitt 1.2.) durch die intakte Peritoneum in die Mitte der Niere einer 1-ml-Spritze mit einer 28-Gauge-Nadel ausgerüstet werden. Liefert langsam 0,1 ml (2 x 10 5) der Zellen. Sobald die Zellen injiziert werden, hält die Nadel an Ort und Stelle für die von 5 bis 10 s um den Rückfluss von Zellen zu reduzieren. Es ist wichtig, die Notwendigkeit extreme Vorsicht bei diesem Schritt zu beachten, da die Person, die die Zellen injizieren wird die Nadel in unmittelbare Nähe zu den Fingern der Person bringt die Maus hält.
  9. Entfernen Sie die Nadel und Schließen des Einschnitts mit einer dünnen Schicht aus Cyanoacrylatkleber.
  10. Legen Sie das Tier wieder in einen sauberen Käfig mit einem sterilen Papiertuch. Lassen Sie die Tiere auf einem Heizkissen erholen. Lassen Sie nicht die unbeaufsichtigten Tiere während der Erholungsphase. Die Tiere nicht zur Standardwohnbedingungen zurück, bis sie aufrecht und sternalen sind. Folgen Sie Richtlinien des Instituts in allen Verfahren unter Verwendung von Labortieren.

4. BioLeucht Imaging

  1. Überwachen Sie das Tumorwachstum durch Biolumineszenz-Bildgebung.
    HINWEIS: Verfahrensdetails für Biolumineszenz - Bildgebung durchführen können von Lim et al erhalten werden. 20 Das Luciferase - Signal kann bereits 24 h nach der Tumorzellimplantation nachgewiesen werden. Da es kein von außen sichtbarer Tumor in diesem Modell ist, ist es wichtig, das Tumorwachstum regelmäßig zu überwachen. Je nach geplantes Experiment kann orthotopen Tumorwachstum gehen für längere oder kürzere Zeiträume. Ein Vorteil der Verwendung der Luciferase-exprimierenden Renca-Zellen besteht darin, dass das Tumorwachstum kann wiederholt im gleichen Tiere in regelmäßigen Abständen für die Dauer des Experiments überwacht werden, und eine spezifische Abfrage von tumortragenden und tumorfreien Organen kann an einen getan werden definierten Endpunkt.
    1. Einzuspritzen Luciferin (0,1 ml einer 15 mg / ml-Lösung in sterilem PBS) ip und läßt es für 10 Minuten zirkulieren, bevor die Maus in das Biolumineszenz-Abbildungssystem setzt. Legen Sie den mo verwenden, um mit seiner dorsalen Seite nach oben gerollt leicht auf der Seite, um nach oben zeigt die injizierte Niere zu haben.
    2. Messen Sie die Tumorbelastung in Lichtphotonen emittiert pro Sekunde (Photonenfluß) innerhalb eines definierten Bereichs von Interesse (ROI) unter Verwendung der Bildanalyse-Software.
  2. Die quantitative Bestimmung der Tumorlast in einzelnen Organen.
    HINWEIS: Die quantitative Bestimmung kann zu bestimmten Zeitpunkten in einzelnen Organen nach der Entfernung aus eingeschläfert Mäusen durchgeführt werden.
    1. Injizieren Sie die Mäuse mit Luciferin, wie in Schritt 4.1.
    2. Nach 10 min einschläfern die Mäuse ein genehmigtes Verfahren.
    3. Seziert die Organe von Interesse (zB, die Nieren und die Lunge, siehe Abschnitt 5). Übertragen, um das Gewebe zu 35 x 10 mm-Petrischalen und legen sie in das Biolumineszenz-Bilderzeugungssystem.
    4. Messen Sie die Tumorbelastung in Lichtphotonen emittiert pro Sekunde (Photonenfluß) innerhalb eines definierten ROI unter Verwendung von Bildanalysesoftware.
e_title "> 5. Organ-Ernte

  1. Zu einem definierten Endpunkt für das einzelne Experiment euthanize tumortragenden Mäuse gemäß bevorzugte institutionellen Richtlinien (zB CO 2, zervikale Dislokation, Anästhesie - Überdosis). Allerdings vermeiden Zervikaldislokation wenn Lungen nach Tusche Inflation werden gesammelt sind.
  2. Führen Sie eine grobe Bewertung des primären Nierentumorwachstums in der injizierten Niere durch das nasse Organgewicht zu messen.
    1. Um die Tumormasse zu bestimmen (in g), Isolat 21 und wiegt die tumortragenden Niere und die kontralaterale Niere von der gleichen Maus, wo der Unterschied in Nierengewicht die Tumormasse definiert. seziert sorgfältig all Fremd Bindegewebe aus den ausgeschnittenen Nieren entfernt, bevor sie ihre Gewichte zu messen.
  3. Beurteilen Sie den Grad der Tumormetastasierung in die Lunge durch die Lungen mit Tusche Aufblasen vor der Exzision und sofort zur Festsetzung der Lunge in Fekete-Lösunglass = "xref"> 22. Manuelle Berechnung der metastatischen Läsionen auf der Lungenoberfläche kann dann durchgeführt werden.
    1. Machen Sie einen Mittelschnitt mit einer Schere in der Mitte Bauch, durch den Brustkorb, und nach oben durch die Hals / Speicheldrüsen beginnen. den Brustkorb Schere und Pinzette, ohne die Verwendung von Lungengewebe sorgfältig entfernen.
    2. Setzen Sie die Luftröhre durch das Bindegewebe zu entfernen.
    3. Bereiten eine 3 ml-Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel mit 10% Tusche Lösung in HBSS gefüllt.
    4. Mit einer Pinzette vorsichtig fädelt eine Seidennaht unter der Trachea. Dies wird verwendet werden, um die Luftröhre abzubinden einmal aufgeblasen.
    5. Schieben Sie die Nadel nach unten die Luftröhre und drücken Sie langsam die Spritze in die Lunge mit der Tusch Lösung aufzublasen. Etwa 1 bis 1,5 ml Tusch Lösung wird vollständig in die Lunge aufzublasen.
    6. Pinch die Trachea verschlossen durch mehrere Knoten zu binden, mit der Naht unter der Nadel um den Rückfluss der Tinte zu hemmen.
    7. Remove die Nadel und sorgfältig das Bindegewebe wegschneiden die aufgeblähte Lunge zu entfernen.
    8. In einem Laborabzug, legen die Lungen in eine 15 ml konischen Röhre 5 ml Fekete-Lösung enthält (35 ml 95% EtOH, 15 ml dH 2 O, 5 ml Formaldehyd und 2,5 ml Eisessig in eine 100 ml Glasflasche) 23.
    9. Lassen Sie die Lungen beheben / destain für 24 bis 48 h bei Raumtemperatur vor manuell auf den entfärbten Tumorknötchen zu zählen.
    10. Entfernen Sie die intakte Lunge nach Entfärben und sorgfältig die festen Lungen durch Lappens in einem 35 x 10 mm Petrischale sezieren. Zähle die Anzahl der Tumorknoten (weißen Knötchen) auf jeden Lappen unter einem Binokular.

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Ergebnisse

Die erfolgreiche Implantation von Renca-Zellen wird in der Niere und Metastasen in den Lungen der Mäuse bei der Tumorentstehung führen. Nach der Exzision der tumortragenden und den kontralateralen Nieren wurden Feuchttuchgewichte (g) gemessen , um die Tumorbelastung zu demonstrieren , basierend auf einem erhöhten Gewicht (Abbildung 1). Renca - Tumoren können durch Immunhistochemie durch Zytokeratin 8 und 18 Anfärbung (Figur 2) identifiziert werden....

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Diskussion

Wir präsentieren ein Protokoll für ein orthotoper RCC Mausmodell. Implantation von Maus-Nieren-Adenokarzinom-Tumorzellen in der Maus Niere stellt ein klinisch relevantes Modell der mRCC. Dieses Modell führt zu einem Primärtumor in der Niere und die Fernmetastasen in der Lunge, die beiden Merkmale des fortgeschrittenen RCC sind. Die Beschreibung hierin präsentierte ist spezifisch für die Renca-Zelllinie in immunokompetenten Balb / c-Mäusen. Unter Verwendung dieses orthotopische Modell haben wir gezeigt , dass die Renca -...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Cancer Institute (R15CA173657 zu AW und R01CA109446 zu TSG) unterstützt, die Simmons Cancer Institute (AW) und die University of Minnestoa Climb 4 Kidney Cancer Foundation (TSG). Wir danken Dr. Kristin Anderson für die Unterstützung bei der Immunofluoreszenz.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Künstliche Tränen AugensalbeAkornNDC 17478-162-35
Vetbond Gewebekleber3MCBGBIW011019
Betadin-Lösung (Povidon-Jod, 5%)Purdue Products, L.P.NDC 67618-155-32
0,25% Marcain (Bupivavain HCl-Injektion)Hospira0409-1587-50 
HeizkissenSunbeam
SpritzenBD309659
GazeVenture908291
KetaminPhoenix PharmaceuticalsNDC 57319-609-02
Xylazin  AkornNDC 59399-111
Hank' s Ausgewogene SalzeSigma-AldrichH2387
IVISCaliper
D-Luciferin, KaliumsalzGoldBioLUCK-1G
India InkChartpak Inc44201
Schere
Zange
Dornröschen (SB) Transposon-SystemNeuromics
RencaATCCCRL-2947
SBT0200

Referenzen

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