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Methodenartikel

Die Aktivierung Autophagy von Aerobic-Übung bei Mäusen

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DOI:

10.3791/55099

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3. Februar 2017

 , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Northwestern University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Autophagy Aktivierung ist bei der Prävention von einer Reihe von Krankheiten nützlich. Eine der physiologischen Ansätze Autophagie in vivo zu induzieren körperliche Bewegung ist. Hier zeigen wir, wie die Autophagie von Aerobic-Übungen zu aktivieren und die Autophagie Ebenen bei Mäusen messen.

Zusammenfassung

Autophagie ist ein lysosomaler Abbauweg, der für die Homöostase, Funktion und Differenzierung von Zellen essentiell ist. Unter Stressbedingungen wird die Autophagie induziert und zielt auf verschiedene Frachten, wie z.B. Bulk-Cytosol, beschädigte Organellen und fehlgefaltete Proteine, für den Abbau in Lysosomen ab. Die daraus resultierenden Nährstoffmoleküle werden für die neue Proteinsynthese und ATP-Produktion in das Zytosol zurückgeführt. Die Hochregulierung der Autophagie hat positive Auswirkungen auf die Pathogenese vieler Krankheiten, und es wurden pharmakologische und physiologische Strategien zur Aktivierung der Autophagie berichtet. Aerobes Training wurde kürzlich als effizienter Autophagie-Induktor in mehreren Organen von Mäusen identifiziert, darunter Muskeln, Leber, Herz und Gehirn. Hier zeigen wir Verfahren, um Autophagie in vivo zu induzieren, entweder durch erzwungenes Laufbandtraining oder freiwilliges Radlaufen. Wir demonstrieren auch mikroskopische und biochemische Methoden zur quantitativen Analyse von Autophagie-Niveaus in Mausgeweben unter Verwendung der Markerproteine LC3 und p62, die zusammen mit Autophagosomen zu Lysosomen transportiert und dort abgebaut werden.

Einleitung

Autophagy ist ein evolutionär konservierten Abbauweg, die in Reaktion auf verschiedene Stressbedingungen, wie Hunger und Hypoxie 1, 2 induziert wird. Während der Autophagie, Doppelmembranbläschen, die so genannte Autophagosomen, integrieren unnötige oder subzellulären Komponenten beschädigt und transportieren sie in die Lysosomen zum Abbau 3. Basal autophagy ist wesentlich für die zelluläre Funktion und Entwicklung des Organismus und die Beeinträchtigung der basalen autophagy wird in vielen Störungen in Verbindung gebracht, einschließlich Neurodegeneration, Tumorgenese und Typ 2 Diabetes 4, 5, 6.

Die bekannteste physiologischen Autophagie Induktor Hunger. Es hat jedoch zwei wesentliche Beschränkungen. Zuerst nimmt Hunger eine lange Zeit , um effektiv Autophagie bei Tieren, zum Beispiel 48 Stunden von Lebensmitteln Einschränkung bei Mäusen induzierenin den meisten Organen. Zweitens induziert Verhungern kaum Gehirn autophagy, aufgrund einer relativ stabilen Nährstoffversorgung im Gehirn. In der Tat ist es auch autophagy Induktion von kleinen Molekül-Induktoren zu detektieren schwierig, da viele Medikamente die Blut-Hirn-Schranke passieren können. So um besser auf die Funktion der Autophagie Aktivierung in der Pathogenese der Erkrankung zu analysieren, haben wir entdeckt , vor kurzem , dass die Übung ein potenter physiologische Methode ist die Autophagie in einem kurzen Zeitraum 7, 8, 9 zu induzieren. Verglichen mit Hunger wird Autophagie effektiv induziert durch Laufband so schnell wie 30 Minuten läuft. Somit Übung ist eine bequeme und potente physiologische Ansatz, den Mechanismus der Autophagie zu studieren Nutzen für die Gesundheit bei der Vermittlung und Prävention von Krankheiten.

Es gibt mehrere Proteinmarker zum Nachweis von autophagy Aktivität, einschließlich LC3 und p62. LC3 (Mikrotubuli-assoziierten Protein 1A / 1B-Licht chain 3) eine cytosolische Protein (LC3-I bilden), die an PE (Phosphatidylethanolamin), auf autophagy Induktions konjugiert ist. PE-lipidierter LC3 (LC3-II-Form) auf autophagosomalen Membranen rekrutiert und kann verwendet werden, Autophagosomen sichtbar zu machen, wenn sie mit GFP-markierten. Seine Translokation aus dem Cytosol Strukturen Autophagosomen unter Mikroskopie punktiert ist ein Hinweis auf autophagy Induktion. p62 ist ein Fracht Rezeptor für autophagy Substrate (wie Ubiquitinierung Proteine), und wird in Autophagosomen als auch eingearbeitet. Da das Protein in Lysosomen mit Autophagosomen abgebaut wird, kann dessen Ebenen die autophagy Fluss zu messen, verwendet werden. Hier zeigen wir, wie diese Marker zu verwenden, die Autophagie in verschiedenen Geweben der Maus durch Aerobic-Übungen induziert zu quantifizieren, einschließlich Zwangs Bewegung (Laufband) und Kür (Laufräder). Die gleichen Verfahren können auch zur in - vivo - Messung von autophagy nach der Behandlung von anderen Induktoren angewendet werden.

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Protokoll

Alle Verfahren mit Tieren wurden von der Northwestern University Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) zugelassen nach Richtlinien durchgeführt.

1. Mausmodelle

  1. Verwenden Sie 8-12 Wochen alten Mäusen in der Ausübung Ausbildung. Zur Erkennung ausgeübt induzierten Autophagie in vivo, verwenden Sie das GFP-LC3 - transgenen Mäusen (C57BL / 6 Hintergrund) für die Bildgebung Studien und C57BL / 6 - Mäuse für biochemische Analysen.

2. Übung induzierten Autophagie

  1. Laufband - Setup - gezwungen Übung
    1. Akklimatisieren und trainieren, um die Mäuse auf einem 10 ° bergauf offen Tretmühle für 2 Tage. Am Tag 1 üben die Mäuse für 5 min bei 8 m / min, und am Tag 2, üben die Mäuse für 5 min bei 8 m / min um weitere 5 min , gefolgt von 10 m / min 10. Ermutigen Sie die Mäuse durch sanfte Hand Schubs zu laufen.
    2. Am 3. Tag, ließ die Mäuse einen einzigen Anfall von Laufen für 90 Minuten auf 10 ° bergauf Laufband, starti unterziehenng mit der Geschwindigkeit von 10 m / min. Nach 40 min bei einer Geschwindigkeit von 1 m / min alle 10 min für insgesamt 30 Minuten, um die Laufbandgeschwindigkeit zu erhöhen, und erhöhen Sie die Geschwindigkeit mit der Geschwindigkeit von 1 m / min alle 5 min bis 17 m / min erreicht, für insgesamt 90 min von Trainingszeit und 1.070 Meter Distanz.
    3. Stellen Sie den elektrischen Reiz auf einem niedrigen Intensitätsbereich (1,2 Hz), und fördern die Mäuse zu laufen wiederholt Fuß-Schock zu vermeiden.
    4. Für Gewebesammlung, einschläfern die Mäuse durch Isofluran Inhalation, durch Genickbruch folgte unmittelbar nach dem Training. Anderen zugelassenen Euthanasie Methoden können auch verwendet werden, wie beispielsweise CO2 oder IP-Injektion von anderen Anästhetika. Die Höhe der Autophagie scheint nicht durch Methoden der Euthanasie betroffen sein.
  2. Laufen Rad Setup - Kür
    1. Platzieren einer Maus-Laufrad (11,4 cm Durchmesser) in einem Käfig mit einem einzigen untergebracht Maus.
    2. Überprüfen Sie die Lauffähigkeit ein Fahrrad Kilometerzähler verwenden.Richten Sie das Rad Parameter [Abstand (in mm) pro volle Umdrehung des Rades] bei 358 (11,4 * π). Messen Sie die Laufstrecke nach 24 Stunden.
    3. Lassen Sie die Maus freiwillig für 2 Wochen mit dem Laufrad laufen. Für Gewebesammlung, opfern, um die Maus am Morgen nach der Laufzeit.

3. Autophagy Flux Bewertung

  1. Um die autophagischen Fluss unter Ruhe- und Belastungs-Bedingungen behandeln Mäuse mit dem Autophagie Inhibitor Chloroquin für drei Tage messen und vergleichen sie mit Mäusen, die mit PBS behandelt.
    1. Auflösen Chloroquin in PBS (5 mg / ml) und Injizieren Chloroquin in Mäuse intraperitoneal in einer Dosis von 50 mg / kg / Tag für drei aufeinanderfolgende Tage. Sacrifice Mäuse und sammeln Gewebe 3 Stunden nach der letzten Injektion.
    2. Bei ausgeübten Mäusen vorzubehandeln sie mit Chloroquin für zwei aufeinanderfolgende Tage in einer Dosis von 50 mg / kg / Tag. Am dritten Tag spritzen die Mäuse mit der gleichen Konzentration von Chloroquin und nach90 Minuten ließ sie für weitere 90 Minuten auf dem Laufband laufen.
    3. Euthanize die Mäuse durch Inhalation von Isofluran, durch zervikale Dislokation gefolgt. Sammeln Gewebe unmittelbar nach der Ausführung, so daß die gesamte Inkubationszeit von Chloroquin die gleiche wie Kontrolle (Ruhe-) -Mäuse (3 h).
      HINWEIS: Alternativ kann eine einzelne Injektion von Chloroquin verwenden, um die Autophagie Fluss in Mausgeweben zu bestimmen.

4. Gewebe Ernte und Fixierung

  1. Vor Gewebe Ernte vorbereiten phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und frischem 4% Paraformaldehyd (PFA, Vorsicht: Persönliche Schutzausrüstung erforderlich) in PBS bei einem endgültigen pH-Wert von 7,4. Bewahren Sie beide Lösungen bei 4 ° C.
  2. Füllen 30 ml Spritze, die mit 15 bis 20 ml von 4% PFA (für GFP-LC3-Mäuse). Verbinden Sie die Spritze mit einer 20-G-Katheter Nadel.
  3. Nach der Übung, einschläfern die Mäuse durch Isofluran Inhalation, durch Genickbruch folgte.
  4. Legen Sie das Tier auf eine saubere Arbeitsfläche auf seiner back. Schneiden Sie und öffnen Sie die Brusthöhle durch das Zwerchfell schneiden das Herz aussetzen.
  5. Machen Sie einen kleinen Schnitt an der Leber das Blut zu lassen kommen, und die Injektion sollte langsam in den rechten Ventrikel des Herzens über den Katheter insgesamt 15 ml 4% PFA, bis die Lunge und Leber völlig blaß. Perfundieren die Maus unmittelbar nach der Trainingseinheit, eine Spritzenpumpe mit einer konstanten Strömungsgeschwindigkeit von 90 ml / h verwendet wird.
  6. Die Nadel nach der Perfusion, zu entfernen und Gewebe von Interesse (zB Gehirn 11 und Skelettmuskel) sammeln. Für Skelettmuskel, sezieren die vastus lateralis. Kurz gesagt, nach hinten in die Haut des Beins ziehen die Muskeln zu entlarven, die Quadrizeps femoris 12 zu lokalisieren, und vastus lateralis sezieren aus, die der externe Muskel mit dem oberen Teil des Oberschenkelknochens angebracht ist.
  7. Für weitere Fixierung und Dehydrierung, legen Sie die Gewebe von GFP-LC3 Mäuse in 4% PFA für 24 Stunden bei 4 ° C, und sie dann auf 15% übertragenSucrose-PBS bei 4ºC über Nacht oder bis das Gewebe angesiedelt haben, und dann auf 30% Saccharose-PBS bei 4ºC über Nacht oder für längere Lagerung. Halten Sie die Proben im Dunkeln so viel wie möglich, da sie zu stark lichtempfindlich sein.
  8. Für Western-Blot-Analyse lassen Sie die Gewebe von C57BL / 6-Mäuse direkt in flüssigem Stickstoff, und lagern Sie sie bei -80 ° C einfrieren.

5. Imaging Analyse von GFP-LC3 Puncta

  1. Tissue - Prozess
    1. Pre-Behandlung das Gewebe (vorher in PFA fixiert und in 30% Saccharose gespeichert) in Einbettungsmedium, wie beispielsweise "Optimal Cutting Temperatur compound" (OCT) für ein paar Minuten in einem markierten kleine Petrischale.
    2. Übertragen Sie das Gewebe in einem markierten cryomold genügend frisches Oktober mit dem Gewebe zu decken. Richten Sie die Schnittfläche in Richtung der Unterseite des cryomold (Querschnitt für den Musculus vastus lateralis und Sagittalschnitt für den Hemi-Gehirn). Vermeiden Sie die Bildung von Blasen.
    3. freeze die Proben durch die cryomold für ein paar Minuten in einem bedeckten Schaum-Kühler mit Trockeneis gefüllt platzieren, bis die OCT-weiß wird. Wickeln Sie einzelne Proben in markierten Folien, versiegeln sie in eine Plastiktüte, und lagern Sie sie bei -80 ° C über Nacht oder länger.
    4. Verwenden Sie einen Kryostaten Probenabschnitte mit einer Dicke von 10 um, und montieren Sie die Abschnitte auf den Folien zu schneiden. Lagern Sie die Objektträger bei -20 ° C, und halten Sie immer die Dias weg vom Licht, wann immer möglich.
  2. Slide Vorbereitung
    1. Die Objektträger aus dem Gefrierschrank und tauen sie bei Raumtemperatur. Decken Sie den Gewebeschnitt mit einem Tropfen Eindeckmedium mit DAPI. Legen Sie ein Deckglas geeigneter Größe auf und Blasenbildung zu vermeiden.
    2. Verwenden Sie Nagellack die Ränder des Deckglases zu versiegeln, damit Nagellack im Dunkeln bei Raumtemperatur trocknen, und dann speichern Sie die Folien in einem lichtdichten Behälter bei 4 ° C, oder gehen Sie mit Imaging-Erfassung von GFP-LC3 puncta.
  3. Die Quantifizierung von GFP - LC3 puncta durch Fluoreszenzmikroskopie
    1. Führen Sie Epifluoreszenzmikroskopie, Bilder im gleichen Zustand erfassen (Belichtung und Einstellungen) für alle Proben. Für GFP, verwenden Sie eine Emissionswellenlänge von 525 nm; für DAPI, verwenden 490 nm. mindestens zehn Bilder pro Probe Erwerben Sie ein 60X Ziel für vastus lateralis und den frontalen Kortex Region des Gehirns verwendet wird.
    2. Quantifizierung die Anzahl der GFP-LC3 puncta in einem Gewebebereich von 2,500 & mgr; m 2 in jedem Bild für die statistische Analyse, für die experimentellen Gruppen verblindet. Berechnen der durchschnittlichen Zahl von 10 Bilder von jeder Probe, wobei die automatische Messfunktion von "Object Count" verwendet wird. Einstellungen für den Musculus vastus lateralis sind: Schwellenwert L = 10, H = 200; 2X glätten; 1X sauber, und die Einstellungen für das Gehirn frontalen Kortex sind: Schwellenwert L = 11, H = 200; 2X glätten; 1X sauber.

6. Western-Blot-Analyse auf Autophagy Marker

  1. Tissue Prozess
    1. Bereiten Sie die Lysepuffer: 50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% Triton X-100; Protease-Inhibitor und Phosphatase-Inhibitor (frisch hinzugefügt).
    2. Entfernen des Gewebes von C57BL / 6-Mäuse von -80 ° C der Lagerung. Schneiden Sie das Muskelgewebe in kleine Stücke mit einer Rasierklinge vor dem folgenden Prozess. Hinzufügen, 800 & mgr; l (für hemi-Hirn) oder 500 & mgr; l (für vastus lateralis) kaltem Lysepuffer zur Probe. Homogenisieren der Probe bei 4 ° C mit einem Homogenisator bei einer mittleren Geschwindigkeit.
    3. Vollständig lysieren die homogenisierte Mischung für weitere 30 min bis 1 h bei 4 ° C unter Rotation.
    4. Spin down das Homogenat bei 12.000 × g für 10 min bei 4 ° C, verwerfen das Pellet, und sammeln Sie den Überstand in ein neues Röhrchen.
  2. autophagy Analyse
    1. Bestimmung der Proteinkonzentration von Gewebelysaten des BCA-Protein-Assay-Kit nach den Angaben des Herstellers. Normalisieren jede Probeauf die gleiche Konzentration.
    2. Kombinieren Sie die Probe mit dem 2x Laemmli - Probenpuffer bei einem 1: 1 - Verhältnis, kochen sie bei 95 ° C für 5 - 10 min, und fahren Sie mit Western - Blot - Analyse auf Autophagie - Marker 13, 14, wie p62 (anti-p62 - Antikörper, 1: 500 Verdünnung) und LC3 (anti-LC3-Antikörper, 1: 500 Verdünnung). Koche die Proben unmittelbar nach der Zugabe des Probenpuffers, da längere Inkubation auf Eis mehrere abgebauten Banden LC3 erzeugen.
    3. Quantifizieren p62 und LC3 Banden durch Densitometrieanalyse mit ImageJ und normalisieren den Wert auf den entsprechenden Aktin-Band.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt zwei verschiedene Methoden Autophagie in Geweben der Maus durch Aerobic-Übungen zu induzieren: insgesamt 90 min von Zwangs Übung auf einer mehrspurigen Tretmühle von zwei Tagen der Eingewöhnung verlief; oder zwei Wochen nach der Kür auf einem Laufrad durch einzeln untergebracht Mäuse verwendet. In jeder Trainingsprotokoll, können wir die autophagy Fluss durch Fluoreszenzmikroskopie und Western Blot-Analyse in verschiedenen Organen zu messen.

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Diskussion

Autophagie ist ein katabolischen Prozess, der Energie liefert, und reduziert die Zytotoxizität von lysosomalen Abbau von Cytoplasma-Bestandteile oder beschädigte Organellen. Autophagie Studium ist wichtig, dass die Regulation der zellulären Homöostase und die Mechanismen der Stressreaktion zu verstehen. Neue Modelle und Methoden entstehen 15, im Bereich der Forschung zu untersuchen , wie beeinträchtigte Autophagie zu zahlreichen pathologischen Prozessen beiträgt 16,

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Wir danken dem Northwestern University Mouse Histology and Phenotyping Laboratory für die technische Unterstützung und Unterstützung und Noboru Mizushima (Universität Tokio) für die Bereitstellung von GFP-LC3-transgenen Mäusen. A. R. und C. H. wurden durch die Startkapital der Northwestern University und den Zuschuss der National Institutes of Health (DK094980) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
LaufbandColumbus Instruments150-RM Exer 3/6
Maus LaufradSuper Pet100079365Durchmesser 11,4 cm
KilometerzählerGlockeDASHBOARD 100
SpritzenpumpeKD ScientificKDS100
FluoreszenzmikroskopNikonModell: inverses Mikroskop ECLIPSE
KryostatLeicaCM 1850UV
HomogenisatorIKA003737001 / Modell: T10 Basic S1
ChloroquinCAYMAN CHEMICAL COMPANY14194
ParafolmaldehyeSIGMA-ALDRICHP6148Persönliche Schutzausrüstung erforderlich. Dieses Produkt kann Formaldehydgas freisetzen, eine Chemikalie, von der bekannt ist, dass sie Krebs verursacht.
EindeckmedienVector LaboratoriesH-1200
p62 AntikörperBD Biosciences610833
LC3 AntikörperNovus BiologicalsNB100-2220
2x Laemmli ProbenpufferBio-Rad Laboratories161-0737
ImageJNIH

Referenzen

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