Eine einfache Ein-Schritt-Dissection-Protokoll für Whole-mount Vorbereitung von Adult Drosophila Brains

Zusammenfassung

Der erwachsene Drosophila Gehirn ist ein wertvolles System zur Untersuchung der neuronalen Schaltkreise, höhere Hirnfunktionen und komplexe Erkrankungen. Eine effiziente Methode ganze Hirngewebe von der kleinen Fliegenkopf zu sezieren werden Gehirn basierte Studien erleichtern. Hier beschreiben wir eine einfache, one-step-Dissektion Protokoll von erwachsenen Gehirn mit gut erhaltenen Morphologie.

Zusammenfassung

Es gibt ein zunehmendes Interesse Drosophila im Umgang mit menschlichen Gehirn degenerative Krankheiten zu modellieren, neuronale Schaltkreise in erwachsenen Gehirn abbilden und untersuchen die molekularen und zellulären Grundlagen der höheren Hirnfunktionen. Eine ganze Montage Vorbereitung von erwachsenen Gehirn mit gut erhaltenen Morphologie ist von entscheidender Bedeutung für eine solche ganze Gehirn-basierte Studien, kann aber technisch anspruchsvoll und zeitaufwendig sein. Dieses Protokoll beschreibt eine einfach zu erlernende, Ein-Schritt-Dissektion Ansatz eines erwachsenen Fliege Kopf in weniger als 10 s, während das intakte Gehirn zum Rest des Körpers angebracht halten nachfolgende Bearbeitungsschritte zu erleichtern. Das Verfahren hilft die meisten der Augen- und tracheale Gewebe entfernen, die normalerweise mit dem Gehirn verbunden, die mit dem späteren Abbildungsschritt stören kann, und stellt auch weniger Anforderungen an die Qualität der Pinzette. Zusätzlich beschreiben wir eine einfache Methode, die auf einem Deckglas praktisch Umklappen der montierten Gehirnproben ermöglicht, die zum Abbilden auf beiden Seiten der b wichtig istRegen mit ähnlichen Signalstärke und Qualität. Als ein Beispiel des Protokolls, wir eine Analyse der dopaminerge (DA) Neuronen in Gehirnen von erwachsenen WT präsentieren (w ¹¹¹⁸⁾ fliegt. Die hohe Wirksamkeit der Dissektion Methode macht es besonders nützlich für große erwachsenen Gehirn-basierte Studien in Drosophila.

Einleitung

Der Modellorganismus Drosophila, die gemeinhin als die Fruchtfliege bekannt ist , hat für seine eleganten genetischen Werkzeuge, kurze Fortpflanzungszeiten, geschätzt und hoch konservierten molekularen und zellulären Wege lang sind. Die Fruchtfliege wurde erfolgreich eingesetzt grundlegende Signalwege zu sezieren, die Strukturierungsmechanismen von mehrzelligen Organismen, sowie die Mechanismen der neuronalen Entwicklung, Funktionen zugrunde liegen, und Krankheiten ^1,2. Mit den jüngsten Fortschritten in Zellmarkierung und Imaging - Technologien, hat die Fruchtfliege Gehirn besonders mächtig geworden in Feinkartierung der neuronalen Schaltkreise und in der molekularen und zellulären Grundlagen der höheren Hirnfunktionen zu sezieren, wie Lernen und Gedächtnis, und zirkadianen Rhythmus ^{1,3, 4,5,6,7,8.}

Ein besonderer Vorteil des Drosophila - Systems ist seine relativ kleine Größe, so dass ganze Montage Vorbereitung und Untersuchung des Gehirns eine regelmäßige Verbindung oder konfokalen Mikroskop. This-Funktion ermöglicht eine detaillierte anatomische und funktionelle Analysen der neuronalen Schaltkreise, oder auch nur ein einziges Neuron, auf zellulärer und subzellulärer Ebene im Rahmen einer ganzen Hirngewebe, so dass sowohl eine ganzheitliche Sicht des untersuchten Subjekts und seiner exakten Geometrie innerhalb der gesamten Bereitstellung Gehirn. Doch die eher geringen Größe des Gehirns gegeben, es stellt auch eine technische Herausforderung bei der effizienten ein intaktes Hirngewebe aus dem Schutz Exoskelett Kopf Fall bei einem erwachsenen Fliege sezieren. Verschiedene wirksame und relativ einfache Dissektion Methoden wurden im Detail beschrieben , die in der Regel vorsichtig beinhalten und stufenweise Entfernung des Kopfgehäuses und die damit verbundenen Gewebe , einschließlich der Augen, der Trachea und Fett aus dem Gehirn richtigen ^{9, 10.} Diese mikrochirurgische Dissektion Methoden oft legen eher hohe Anforderungen an die Qualität der Präparation einer Pinzette, mit feinen gut ausgerichteten Spitzen auf einer Pinzette verlassen, die leicht beschädigt werden können. Außerdem ist, wie die Gehirne seziert sind oft separatwegen ihrer geringen Größe und ihrer Transparenz im Verarbeitungspuffer ed von dem Rest des Körpers, kann die Gehirne leicht während der nachfolgenden Färbung und Waschverfahren verloren. Hier beschreiben wir eine relativ einfache und leicht zu erlernende, Ein-Schritt-Dissektion Protokoll für die erwachsenen Gehirn, die die seziert Gehirne an dem Rumpf hält. Die Dissektion Prozess löscht oft leicht die meisten der Gehirn-assoziierten Gewebe wie das Auge und die Luftröhre entfernt und verringert die Nachfrage nach guter Qualität Dissektion Pinzette.

Zusätzlich wird, wenn das Gehirn unter dem Fluoreszenzmikroskop Verbindung oder konfokalen Mikroskop Bildgebung, die Seite des Gehirns, die von der fluoreszierenden Lichtquelle weg erzeugt oft ein schwächeres Signal und weniger klare Bilder aufgrund der Dicke des gesamten Montage Gehirn. Hier haben wir auch eine einfache Montage-Methode beschreiben, die leicht Umklappen der Gehirnproben ermöglicht, so dass bequem Bildgebung von beiden Seiten des Gehirns mit ähnlichen Signal intensiviertenty und Qualität.

Als proof-of-concept für die Anwendung dieses Verfahrens das adulte Gehirn zu untersuchen, untersuchten wir ferner die Anwesenheit von DA - Neuronen im Gehirn von w ¹¹¹⁸ Fliegen; ein Genotyp , die oft als die Elternlinie verwendet wird transgenen Fliegen und die Wildtyp - Kontrolle in vielen Drosophila Studien zu erzeugen.

Protokoll

1. Verwendete Lösungen für Gehirnsezierung und Immunfluoreszenzanfärbung

1. Präparieren der erwachsenen Fliegen Gehirne in künstlichen zerebraler spinaler Flüssigkeit (aCSF): 119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO _3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH ₂ PO _4, 1,3 mM MgCl ₂ und 10 mM Glukose. Vor der Verwendung der Gas aCSF mit 5% CO _2/95% O ₂ für 10 bis 15 min und Spitze mit 2,5 mM CaCl _2. Sterilisieren der aCSF Lösung durch Filtrieren durch ein 0,22-um-Membranfilter.
   Hinweis: Bewahren aCSF bei 4 ° C eine bakterielle Kontamination zu verhindern. Fliegen Gehirn kann auch in einem Phosphat-gepufferter Saline (PBS) Lösung präpariert werden, obwohl detaillierte Vergleiche der Wirkungen der beiden dissection Lösungen auf die endgültige Bildqualität der sezierten Gehirne wurden nicht durchgeführt.
2. Verwenden 4% Paraformaldehyd (PFA), hergestellt in 1x PBS als Fixierungslösung, die normalerweise in Aliquote aufgeteilt und bei -20 ° C gelagert.
   Caution: PFA ist giftig und ätzend und sollten mit Vorsicht behandelt werden.
3. Verwenden Sie 1x PBS die PFA aus dem Gehirn und nach dem letzten Waschschritt während der Immunfluoreszenzanfärbung der sezierten Gehirne zu spülen. Bereiten Sie die 1x PBS aus 10x PBS - Stammlösung (1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na ₂ HPO ₄ und 18 mM KH ₂ PO _4).
4. Verwenden 0,3% Tween-20 in 1x PBS (1x PBT) für alle nachfolgenden Waschschritte bei Immunofluoreszenz-Färbung der sezierten Gehirnen.

2. Mikro Dissektion der erwachsenen Fliege Heads

Anmerkung: Die Dissektion Verfahren in Abbildung 1 dargestellt ist.

1. Anesthetize die erwachsenen Fliegen mit CO _2. Mit einer Pinzette, wählen Sie eine Fliege und kurz Entwachsen seine Kutikula, indem es in 70% Ethanol für 3 Tauchen - 5 s. Dadurch wird sichergestellt, dass keine Blasen in die Kutikula fly haften, wenn sie in den aCSF oder 1X PBS dissection Lösung eingetaucht.
2. Unter einemBinokular mit einer Lichtquelle in einem Winkel, der nicht durch die Hände blockiert werden, stellen Sie die Objektivlinse eine klare Sicht auf die Fliege (1.2X Vergrößerung) zu erreichen. Verwenden einer Pinzette , mit der nicht - dominanten Hand , um das Tier zu immobilisieren und tauchen die Fliege in die kalte Dissektion Lösung mit ihrem Bauch nach oben, wie in 1A gezeigt.
3. Halten der Zange in einem 160-170 ° -Winkel in Bezug auf die Dissektion Platte, während eine kleine Kraft auf den Bauch der Fliegen ausübt (wie die Pfeile in Figur 1A dargestellt). Mit diesem Schritt wird die Fliege zu immobilisieren und zwingen sie den Kopf nach hinten um 15 zu bewegen - 25 °, während die Rüssel nach oben erstrecken. In dem Verfahren wird eine weiche und lichtdurchlässigen Bereich der Kutikula, unterhalb der Rüssel sollte deutlich werden. Erhöhen Sie die Vergrößerung und stellen Sie die Fokusebene auf diese Region.
   Hinweis: Halten Sie nicht die Zange zu fest, sondern nur fest genug zu stabilisierendie Fliege. Zu viel Kraft führt dazu, dass die inneren Organe in die Lösung zu Bruch.
4. Verwenden Sie die dominante Hand die Pinzette zu drücken, so dass ihre Spitzen geschlossen sind, die eine leichte Widerstandskraft an den Spitzen der Zange erzeugt wird, so dass die Zange aufspringen wird, wenn der Druck von der Halte Hand freigegeben wird. Positionieren Sie die Zange senkrecht zu der Zange die Fliege halten, wie in 1B gezeigt.
   1. Pierce die geschlossenen Spitzen der Dissektion Zange durch die weiche und durchlässigen Bereich der Kutikula unter den Rüssel, wie in 1B durch den roten Pfeil dargestellt ist . Es ist wichtig, nicht die Zange eindringen zu tief, dass es das Gehirn berührt. Das Gehirn besitzt, sollten sichtbar werden. Aufrechterhaltung eines stabilen Griff der Fliege mit der nicht-dominanten Hand.
5. Schnell, aber stetig, lassen Sie die Spitzen der Dissektion Zange durch seine eigene Kraft und setzen auf die Dynamik von dieser Version loszureißen ter Exoskelett rund um das Fliegenkopf. Eine intakte Gehirn richtigen sollte (das weiße Gewebe oberhalb der Spitze des unteren forcep in 1C sofort) sichtbar werden , folgen eine imaginäre Linie , die Dynamik der freiPinzettenSpitzen zu führen (wie die nach außen rote Pfeile in 1C gezeigt dargestellt). Dies entfernt sanft das Exoskelett und die meisten des Gehirns assoziiertes Auge und Trachea vom Gehirn. Der richtige Zeitpunkt und die ausgeübte Kraft das Exoskelett zu öffnen wird auf die Prüfer Erfahrung abhängig sein.
   Anmerkung: Dies ist der wichtigste Schritt bei der Präparation ist. Es ist wichtig, auf die natürliche Kraft von der Dynamik der Öffnung Zange erzeugt verlassen, um die Exoskelett zu entfernen, während die freiliegenden Gehirn verlassen, um den Rest des Körpers befestigt bleibt.
6. Verwenden Sie die Zange in der dominanten Hand sorgfältig die Überbleibsel Zubehör Gewebe, wie zum Beispiel die tracheale entfernen, die als weiße Faserstrukturen erscheint remaining an das Gehirn. Achten Sie darauf, nicht zu ziehen oder das Gehirn die richtige beschädigen.

3. Immunfluoreszenzanfärbung der Gehirne

1. Befestigen Sie die seziert Gehirnproben mit ihren zugehörigen Torsos in etwa 1 ml 4% PFA für 40 - 60 min.
   Hinweis: Für diese und die nachfolgenden Schritte, halten die Rohre oder Platten mit Proben auf einem Nutator richtig die Proben in der Lösung mischen.
2. Spülen mit 1 ml 1x PBS durch die up-Lösung pipettiert und ab 3 mal. Achten Sie darauf, nicht die Gehirne entfernt abzusaugen.
3. Waschen Sie 5-mal mit 1x PBT für jeweils 5 Minuten. Halten Sie die Proben auf der Nutator während der Inkubation.
4. Inkubieren mit primären Antikörpern an geeigneten Verdünnung O / N bei 4 ° C.
5. Am nächsten Tag, entfernen Sie die primären Antikörper und waschen Sie die Proben 5-mal mit 1x PBT. Lassen Sie die Proben 5 - 10 min in der 1x PBT-Lösung zwischen jedem Waschen. Halten Sie die Proben auf der Nutator während der Inkubation.
6. Inkubieren des gewaschenenProben, die in einem geeigneten sekundären Antikörper mit der vorgeschlagenen Verdünnung und Inkubationszeit.
7. Waschen Sie die Proben sechsmal mit 1x PBT mit einer 10-minütigen Inkubation zwischen jedem Waschen.
   Dieser Schritt ist entscheidend für die Entfernung von unspezifisch gebundenen Sekundärantikörper von der Probe.
8. Inkubieren in einer 1: 10000 Verdünnung von 1 mg / ml 4 ', 6'-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in 1x PBT Lösung für 30 min. DAPI ist ein DNA-Farbstoff, der auf die AT Regionen der DNA bindet und verwendet werden kann, die Gesamtmorphologie des Gehirns zu offenbaren.
9. Spülen Sie dreimal mit 1x PBS.
10. Transfer Proben auf eine Dissektion Gericht, und trennen Sie die Gehirne von den Körpern in einer Dissektion Gericht mit einer Pinzette.
11. Nach der Färbung und Waschschritte, montieren Sie die Gehirne zwischen zwei Deckgläser und legen Sie die Deckgläser auf einem Montage Folie. Auf diese Weise können die Gehirnproben leicht umgedreht werden, so dass beide Seiten des Gehirns mit einer ähnlichen Signalintensität abgebildet werden.
    Hinweis. Der Montagevorgang wird im folgenden näher erläutert.
    1. Legen Sie eine 18 x 18 mm Deckglas auf einem Montage Folie. Widen die Eröffnung einer Pipettenspitze mit einer Klinge und es verwenden, um die Gehirne in 1x PBS-Lösung auf die 18 x 18 mm Deckglas zu übertragen.
    2. Legen Sie die Gehirne auf die Mitte des Deckglases, entfernen Sie die Flüssigkeit um das Gehirn mit einer feinen Pipettenspitze, und dann fügen Sie eine weitere 20 bis 40 & mgr; l anti-fade Eindeckmediums (0,2% (w / v) n-Propylgallat in 99,5 % ACS-Qualität Glycerin) über das Gehirn.
       Hinweis: Die Menge an Eindeckmedium geprüft , hängt von der Anzahl der Gehirne hinzugefügt.
    3. verbreiten Sie vorsichtig die Köpfe, während das viskose Eindeckmediums nach außen zu verschieben. Legen Sie eine zweite 18 x 18 mm Deckglas auf der Oberseite des Gehirns, indem man zuerst die Folie von einer Seite absenken, bis es in Kontakt kommt mitdie Oberfläche des Befestigungs slip, und dann senkt sich langsam auf der anderen Seite des Gehirns Kontakt mit Luftblasen zu minimieren.
       Hinweis: Es gibt keine Notwendigkeit besteht , einen Abstandshalter zwischen den beiden Deckplättchen, als das Volumen des Befestigungsmedium zu verwenden und die Gehirne sollte einen Raum ausreichend zu trennen , die beiden Deckgläser bereitzustellen.
    4. Lassen Sie die Folien nach unten absetzen. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, die mit einem Labor Gewebe von den Seiten der Gleiter kommen.
    5. Um die Deckgläser mit den montierten Gehirne nicht fallen die Montageschieber während des Transports ab, verwenden Sie ein kleines Stück Klebeband, um die Deckgläser an der Montage Schlitten zu befestigen.
       Hinweis: Gehirne montiert zwischen den Folien direkt abgebildet werden kann , oder bei 4 ° C aufbewahrt für bis zu einer Woche ohne wesentlichen Verlust an Fluoreszenzsignal, ohne Notwendigkeit , eine Dichtungsmasse zu verwenden , um die Folien zu versiegeln. Für die langfristige Erhaltung der gefärbten Gehirn kann die Seite der beiden schlüpft abgedichtet werden with Nagellack und gelagert in einem -20 ° C Gefrierschrank, obwohl gefärbten Gehirne ihre Signale im Laufe der Zeit verlieren. Dies ist nicht empfehlenswert.
12. Verwenden Sie eine geeignete Verbindung Fluoreszenzmikroskop oder konfokalen Mikroskop das Gehirn abzubilden.
    1. Zuerst erwirbt das Bild von der Seite des Gehirns näher an dem Ziel, und dann vorsichtig die Deckgläser Flip die Proben in der Mitte eingeschoben haben. Dieser Schritt erleichtert das Bild der anderen Seite desselben Gehirns zu erwerben.
    2. Verwenden Sie eine aufrechte Verbindung Fluoreszenzmikroskop und einem 20X Objektiv zur Abbildung des gesamten Gehirns (Beispiele in Abbildung 2) und ein 40X - Objektiv zur Bild kleinere Regionen des Gehirns, wie DA Neuronen im Gekoppelte Anterior Medial (PAM) Clusterregion (Beispiele in Abbildung 3).

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die Hauptverfahren für adulte Gehirn Dissektion, wie oben beschrieben , die Figuren 2 und 3 sind repräsentative Bilder von 3 Tage alten WT. (Genotyp: w ¹¹¹⁸⁾ erwachsenen Gehirnen Fliegen, die mit einem Antikörper gegen Tyrosinhydroxylase (TH costained wurden in rot, in Figur farbigen 2 und weiß in 3), einem Marker allgemein zu bezeichnen DA - Neurone...

Diskussion

Mit zunehmendem Interesse an der Verwendung erwachsenen Drosophila Gehirn menschliche Gehirn Krankheiten zu studieren, neuronale Schaltkreise und höheren Hirnfunktionen, ist es notwendig , eine einfache und schnelle Methoden zu entwickeln , intakte Fliegen Gehirne für ganze-mount zu erhalten Analysen, die für groß besonders wichtig ist , skalieren Gehirn-basierte Bildschirme. Unser Verfahren bietet eine einfache und leicht zu erlernende Ansatz eine Fliege Kopf zu sezieren aus (oft in weniger als 10 s mit Erfahr...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
w*;   parkΔ 21/TM3,  P{GAL4-Kr.C}DC2,  P{UAS-GFP. S65T}DC10,  Sb1	Bloomington Drosophila Stock Center	51652	Balancer wurde an
PBac{WH}parkf01950	Exelixis umgestellt	f01950	Balancer wurde auf TM6C umgestellt
NaCl	Fisher Scientific	S640-500
Natriumbicarbonat (NaHCO3)	Fisher Scientific	02-003-990
Kaliumchlorid (KCl)	Fisher Scientific	BP366-500
Natriumphosphat, monobasisches Monohydrat (NaHCO3)	Fisher Scientific	02-004-198
Magnesiumchlorid (MgCl2)	Fisher Scientific	02-003-265
D-Sorbit	Sigma-Aldrich	S1876-500G	Ersetzt
Glukose-Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670-500G
EMD Millipore  Durapore PVDF-Membranfilter: Hydrophil: 0,22 & Mikro; m Porengröße	Fisher Scientific	GVWP14250
Formalinlösung, 10% (histologisch)	Fisher Scientific	SF98-20
Kaliumphosphat, zweibasisch, Pulver, hochreines Bioreagenz	Fisher Scientific	02-003-823
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Excelta Präzisionspinzette mit sehr feinen Spitzen	Fisher Scientific	17-456-055	Das Protokoll erfordert keine sehr feinen Punkte.
Anti-Tyrosin-Hydroxylase-Antikörper	Pel-Freez Biologicals	P40101
Rat-Elav-7E8A10 Anti-Elav	The Developmental Studies Hybridoma Bank	Klon 7E8A10
Ziege Anti-Ratte IgG (H+L) Sekundärer Antikörper, Alexa Fluor 647 Konjugat	ThermoFisher	Scientific A-21247
Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 594 Konjugat	ThermoFisher Scientific	A-11037
DAPI-Lösung (1 mg/ml)	ThermoFisher Scientific	62248
Propylgallat Pulver	Sigma-Aldrich	P3130-100G
Glycerin ACS Reagenz, ≥ 99.5%	Sigma-Aldrich	G7893-500ML
Zeiss Axioimager Z1	Zeiss	Zitat
Zeiss Apotome.2	Zeiss	Zitat
Zen lite software		Zitat