Methodenartikel

Quantifizierung der Bakterien Histidinkinase Autophosphorylierung eine Nitrocellulose-Bindungsassay unter Verwendung

DOI:

10.3791/55129

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11. Januar 2017

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1Department of Chemistry, Stony Brook University, 2Department of Physiology and Biophysics, Stony Brook University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir berichten und demonstrieren einen optimierten Nitrocellulose-Bindungsassay, der zur Quantifizierung der Autophosphorylierung von gereinigten bakteriellen Histidinkinasen verwendet werden kann. Unsere Methode hat mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen SDS-PAGE-basierten Techniken und stellt eine wertvolle Alternative zur Charakterisierung dieser wichtigen Proteine dar.

Zusammenfassung

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Wir demonstrieren eine nützliche Methode zur Quantifizierung der Autophosphorylierung von gereinigten bakteriellen Histidinkinasen. Histidinkinasen sind bekannt für ihre Beteiligung an der Zweikomponenten-Signaltransduktion, einem allgegenwärtigen System, durch das Bakterien Umweltreize wahrnehmen und darauf reagieren. Die Zweikomponenten-Signalübertragung zeichnet sich durch die Autophosphorylierung einer Histidinkinase aus, gefolgt von einem Phosphotransfer zur Empfängerdomäne eines Antwortregulatorproteins, der schließlich zu einer Ausgangsantwort führt. Die Autophosphorylierung der Histidinkinase reagiert auf das Vorhandensein eines verwandten Umweltreizes, wodurch Bakterien ein Mittel erhalten, Veränderungen in der Umgebung zu erkennen und darauf zu reagieren. Trotz ihrer Bedeutung für die bakterielle Biologie sind Histidinkinasen aufgrund der inhärenten Labilität von Phosphohistidin nach wie vor wenig verstanden. Herkömmliche Methoden zur Untersuchung dieser Proteine, wie z. B. die SDS-PAGE-Autoradiographie, weisen erhebliche Mängel auf. Wir haben einen Nitrocellulose-Bindungsassay entwickelt, der zur Charakterisierung von Histidinkinasen verwendet werden kann. Das Protokoll für diesen Assay ist einfach und leicht durchzuführen. Unsere Methode hat einen höheren Durchsatz, ist weniger zeitaufwändig und bietet einen größeren Dynamikbereich als die SDS-PAGE-Autoradiographie.

Einleitung

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Adaptive Reaktion ist von entscheidender Bedeutung für die bakterielle Überlebenszeit. Um Umweltveränderungen zu erfassen und zu reagieren, können Bakterien, die eine Stimulus-Antwort-System als Zweikomponenten-Signalisierung bekannt. 1,2 In einem typischen Zweikomponentensystem wird die Histidinkinase detektiert einen kognaten Stimulus, autophosphoryliert seinen konservierten Histidinrest, überträgt dann Phosphat zu einem konservierten Aspartatrest auf dem Empfänger - Domäne eines Response - Regulator - Protein. 3 Dieses Ereignis löst eine Veränderung in der Aktivität des Antwortregulator, der ein stromabwärtiges Effekt anregt. 4,5 D....

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Protokoll

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Vorsicht: Dieses Protokoll erfordert eine entsprechende Ausbildung in der Verwendung und Umgang mit radioaktiven Stoffen. Bitte verwenden Sie die erforderliche persönliche Schutzausrüstung bei der Durchführung dieses Tests, einschließlich der Beta-Strahlung Abschirmung. Radioaktive Abfälle müssen sorgfältig behandelt werden, da große Mengen an Abfall während der Waschphase des Experiments erzeugt werden. Stellen Sie sicher, dass die Abfälle in einem aufrechten Behälter wie einem großen Eimer oder Flasche aufbewahrt wird, die nicht leicht umkippen wird oder verschüttet. Sobald das Experiment abgeschlossen ist, übertragen sorgfältig alle flüssigen Abfall radioaktive Abfallbehälter in geeig....

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Ergebnisse

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Eine repräsentative Datensatz wurde ein Bild mit eingefangen mit einer Phosphor - Imager (Abbildung 1), Ponceau S - Färbung der Nitrocellulosemembran (Abbildung 2), und Szintillationszählung Daten (Abbildung 3) erzeugt. 3A zeigt die enzymkinetischen Konstanten in einem Lineweaver-Burk-Diagramm. Diese Ergebnisse wurden unter Verwendung eines gereinigten Histidinkinaseregion aus dem gramnegativen Spezies Vibrio parahae.......

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Diskussion

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Die Nitrocellulose-Bindungstest wir beschrieben haben, hat viele Vorteile gegenüber bisher verwendeten Verfahren Histidin-Kinasen zu charakterisieren. Im Vergleich zu herkömmlichen SDS / PAGE-basierten Autoradiographie, ist unser Verfahren einen höheren Durchsatz und weniger zeitraubend. Die Nitrocellulosemembran ist leichter zu handhaben als SDS-Gelen, und braucht nicht befestigt zu werden. Ponceau-Färbung der Nitrocellulose ermöglicht die Proteinspots visualisiert werden. Dies bietet eine einfache Möglichkeit, jede St.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch das Department of Education durch die Graduate Unterstützung in Bereichen der nationalen Not-Programm (P200A100044) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
PhosphorsäureVWRAAAA18067-APZum Abschrecken von Reaktionen und Waschen von Nitrocellulose
TrisbaseRPIT60040-5000.0Tris-HCl pH 8,0, für Kinase-Reaktionspuffer
KaliumchloridRPIP41000-2500.0Für Kinase-Reaktionspuffer
MagnesiumchloridRPI M24000-500.0Für Kinase-Reaktionspuffer
GlycerinRPIG22020-4000.0Für Kinase-Reaktionspuffer
5'-ATPPromegaE6011Kinasesubstrat
[γ-32P]-5'-ATPPerkin ElmerNEG002Z250UC 6.000 Ci/mmol
96-Well-Dot-Blot-GerätBio-rad1706545Für Schmierblutungsreaktionen
NitrocelluloseWhatman32-10401396-PKFür Schmierblutungsreaktionen
Ponceau SSigma aldrichP3504-50GZum Färben von Nitrozellulose

Referenzen

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  1. Stock, A. M., Robinson, V. L., Goudreau, P. N. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 69, 183-215 (2000).
  2. Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15 (2), 118-124 (2012).
  3. Parkinson....

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Schlagwörter

Histidine Kinase AutophosphorylationNitrocellulose Binding AssayTwo Component SignalingRadioactive Ligand DetectionScintillation CountingGamma 32P ATPPonceau S StainingPhosphoric Acid WashStandard Curve GenerationProtein Phosphorylation Quantification

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