Epigenetische Faktoren können mit genetischen Programme zu modulieren Genexpression und regulieren die Funktion der B-Zellen interagieren. Durch die Kombination von in-vitro- B-Zell-Stimulation, qRT-PCR, und Hochdurchsatz-RNA-Sequenz und mRNA-Sequenz Ansätze, analysieren wir die epigenetische Modulation von MiRNA und gen-Expression in B-Zellen.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Genomweite Analyse von HDAC-Inhibitor-vermittelten Modulation der Micro-RNAs und mRNAs in B Zellen induziert unterziehen Class-Schalter DNA-Rekombination und Plasma-Zell-Differenzierung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Antikörperreaktionen werden durch mehrere wichtige B-Zell-inneren Prozesse, einschließlich somatische Hypermutation (SHM), Class-Schalter DNA Rekombination (CSR) und Plasma-Zell-Differenzierung durchgeführt. In den letzten Jahren epigenetische Modifikationen oder Faktoren wie Histon Deacetylation und Mikro-RNAs (MiRNAs), nachweislich mit B-Zelle genetische Programme zur Form Antikörperantworten interagieren, während die Dysfunktion des epigenetischen Faktoren gefunden wurde, um zu führen Autoantikörper Antworten. Genomweite MiRNA und mRNA Expression in B-Zellen als Reaktion auf epigenetischen Modulatoren Analyse ist wichtig für das Verständnis der epigenetischen Regulation der B-Zell-Funktion und Antikörper-Reaktion. Hier zeigen wir ein Protokoll für die Induktion B-Zellen zu CSR und Plasmazelle Differenzierung zu unterziehen, behandeln diese B-Zellen mit Histon-Deacetylase (HDAC)-Inhibitoren (HDIs) und Analyse von mRNA und MicroRNA Ausdruck. In diesem Protokoll analysieren wir direkt komplementäre DNA (cDNA) Sequenzen mit mRNA Sequenzierung der nächsten Generation (mRNA-Seq) und MiRNA-Seq Technologien, Zuordnung der Sequenzierung liest, das Genom und quantitative reverse Transkription (qRT)-PCR. Mit diesen Ansätzen haben wir festgelegt, dass in B-Zellen induziert CSR und Plasma-Zell-Differenzierung zu unterziehen, HDI, einen epigenetischen Regulator selektiv MiRNA und mRNA Ausdruck moduliert und CSR und Plasmazelle Differenzierung verändert.
Einleitung
Epigenetischen Markierungen oder Faktoren, z. B. DNA-Methylierung und Histon posttranslationale Modifikationen nicht-kodierende RNAs (unter anderem Micro-RNAs) modulieren Zellfunktion durch Veränderung der gen-Expression-1. Epigenetische Modifikationen regulieren die Funktion von B-Lymphozyten, z. B. Immunglobulin Class-Schalter DNA Rekombination (CSR) und somatische Hypermutation (SHM) Differenzierung zu B-Gedächtniszellen oder Plasmazellen, damit Modulation der Antikörper und Autoantikörper Antworten2,3. CSR und SHM erfordern kritisch Aktivierung-induzierte Cytidin Deaminase (AID, kod....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
das Protokoll erfolgt nach den Richtlinien der Tierpflege die institutionelle Tier Pflege und Nutzung Ausschüsse der University of Texas Health Science Center in San Antonio.
1. Stimulation des Maus-B-Zellen für CSR, Plasma-Zell-Differenzierung und HDI Behandlung
- Vorbereitung der Milz Zellsuspensionen
Hinweis: führen Sie alle Schritte in einer Laminar-Flow-Kapuze mit Ausnahme von Maus Sterbehilfe und Dissektion.- Einschläfern der spezifischen Pathogen-freies C57BL/6J Maus (8-12 Wochen alt) durch CO 2 Inhalation.
- Legen Sie die Maus auf sezierenden Board mit dem Bauch nach oben.....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Mit unserem Protokoll B-Zellen mit LPS platziert gereinigt (3 µg/mL) und IL-4 (5 ng/mL) für 96 h 30-40 % der CSR zu IgG1 und ~ 10 % der Plasma-Zell-Differenzierung induzieren können. Nach der Behandlung mit HDI (500µM VPA), die CSR zu IgG1 auf 10-20 % gesunken, während Plasma-Zell-Differenzierung auf ~ 2 % zurückgegangen (Abbildung 1). HDI-vermittelte Hemmung der CSR wurde weiter bestätigt durch eine verminderte Anzahl von Post-Rekombination Iμ-Cγ1 und Reifen VH
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Dieses Protokoll bietet umfassende Ansätze zur B-Zelle Klasse wechseln und Plasma-Zell-Differenzierung zu induzieren; Ihre Auswirkungen durch epigenetische Modulatoren, nämlich HDI zu analysieren; und die Wirkung von HDI auf mRNA und MiRNA Ausdruck in diesen Zellen zu erkennen. Die meisten dieser Ansätze können auch verwendet werden, um die Auswirkungen der epigenetischen Faktor auf menschlichen B-Zell-Funktion und mRNA/MiRNA Ausdruck zu analysieren. Die qRT-PCR und mRNA-Seq/MiRNA-Seq Ansätze können auch verwendet werden.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Danksagungen
Diese Arbeit von NIH-Stipendien AI 105813 und AI 079705 (auf PC) unterstützt wurde, gewähren die Allianz für Lupus Forschung Zielkennzeichnung in Lupus Grant ALR 295955 (auf PC) und der National Research Foundation Arthritis-Forschung (HZ). TS wurde unterstützt von Kinderheilkunde Medical Center, zweite Xiangya Krankenhaus, Central South University Changsha, China, im Rahmen des Programms Xiangya-UT Schule von Medizin San Antonio Medizinstudent besuchen.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 Mäuse | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X mit L-Glutamin (Größe: 6 x 500mL; Mit L-Glutamin) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotische Antimykotische Lösung 100 mL | Fisher Scientific - Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Zellsiebe | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypanblauer Fleck 0,04 % | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysepuffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line-Zählkammer | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden und Kappe | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Maus B-Zell-Isolationskit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Nadel nur 18 Gauge 1,5 Zoll KURZE ABSCHRÄGUNG 100 / Karton | BD Biowissenschaften | ||
| PE/Cy7 Anti-Maus-CD138 (Syndecan-1) Antikörper | BioLegend | 142513 (25 μg) | |
| PE-Cy7 B220 Antikörper | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC Anti-Maus/humaner CD45R/B220 Antikörper | Biolegend | 103212 | |
| Maus APC-IgG1 200 & Mikro; g | Biolegend | 406610 | |
| FITC Anti-Maus IgM Antikörper | Biolegend | 406506 | |
| FITC Anti-Maus/Mensch CD45R/B220 Antikörper | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Mensch/Maus CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Rinderserumalbumin, Fraktion V, Hitzeschock behandelt | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharide aus Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Rekombinante Maus IL-4 (trägerfrei) | BioLegend | 574302 (Größe: 10 ug) | |
| Valproinsäure-Natriumsalz | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Klasse II Typ A2 Biosicherheitswerkbank | The Baker Company | SG404 | |
| 2 Inkubator mit großer Kapazität | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Wasserbäder mit digitaler Steuerung: Modell 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5 ml Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden | Fisher Scientific Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Zentrifugenröhrchen | Fisher Wissenschaftlich | 05-538-59A | |
| 1,7 mL Mikroröhrchen, klar | Genesee | 22-282 | |
| Easy Reader Kunststoff-Zentrifugenröhrchen mit höherer Geschwindigkeit 50 ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipettierhilfe | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Serologische Pipettenspitzen mit 25 ml | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| Serologische Pipettenspitzen mit 10 ml | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| Serologische Pipettenspitzen mit 5 ml | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-Well-Platten | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Tischzentrifuge, ungekühlt | Beckman Schar | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Schar | 366650 | |
| Allegra 25R Tischzentrifuge, | Beckman Schar | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, fester Winkel | Beckman Schar | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analoger Vortex-Mischer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-Zol RNA MiniPrep Kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (ca. 0,75 % Ethanol als Konservierungsmittel/Molekularbiologie) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-freies Dnase-Set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spektralphotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III Erststrang-Synthesesystem RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well PCR-Platten mit halbem Rand, Karton mit 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Klebedichtungen | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optikmodul | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optisches Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Durchflusszytometrie-Analysator | BD Biosciences | ||
| FACSDiva-Software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalysator | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Fokussierter Ultraschallgerät | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I für Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome | Sequencer Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA-Sequenzierungskit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
Referenzen
- Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
- Zan, H., Casali, P.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
