Dieses Manuskript enthält Protokolle , die in utero Elektroporation (IUE) verwenden , um die strukturelle Konnektivität von Neuronen in der Ebene einzelner Zellen und die Erregbarkeit von fluoreszenzmarkierten Neuronen zu beschreiben. Histologie verwendet dendritische und axonale Projektionen zu charakterisieren. Whole-cell recording in akuten Scheiben verwendet Erregbarkeit zu untersuchen.
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Methodenartikel
In Utero Ansätze Elektroporation die Erregbarkeit neuronaler Subpopulationen und Einzelzell - Konnektivität zu studieren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Nervensystem besteht aus einer enormen Bandbreite von verschiedenen neuronalen Typen zusammen. Diese neuronalen Subpopulationen sind gekennzeichnet durch, unter anderen Merkmalen, ihre unterschiedlichen dendritischen Morphologien, ihre spezifische Muster von axonalen Konnektivität und deren selektive Brennen Antworten. Die molekularen und zellulären Mechanismen, die für diese Aspekte der Differenzierung während der Entwicklung sind immer noch schlecht verstanden.
Hier beschreiben wir kombinierte Protokolle für die Kennzeichnung und die Charakterisierung der strukturellen Verbindungen und Erregbarkeit der Neurone. Die Modifikation der in utero Elektroporation (IUE) Protokoll ermöglicht die Kennzeichnung einer spärlichen Population von Neuronen. Dies wiederum ermöglicht die Identifizierung und Verfolgung der Dendriten und Axone der einzelnen Neuronen, die genaue Charakterisierung der laminaren Lage von axonalen Projektionen und morphometrische Analyse. IUE kann auch in der Erregbarkeit zu untersuchen Veränderungen verwendet werden vonWildtyp (WT) oder gentechnisch veränderten Neuronen indem sie sie mit Ganzzell-Aufnahme von einer akuten Scheiben durch Elektroporation Gehirne zu kombinieren. Diese beiden Techniken tragen zu einem besseren Verständnis der Kopplung von strukturellen und funktionalen Verbindungen und der molekularen Mechanismen der neuronalen Steuerung Vielfalt während der Entwicklung. Diese Entwicklungsprozesse haben wichtige Auswirkungen auf axonalen Verkabelung, die funktionelle Diversität von Neuronen und die Biologie von kognitiven Störungen.
Einleitung
Die Entwicklung von dendritischen und axonalen Strukturen ist ein wichtiger Aspekt der Schaltungsregelung im Nervensystem, in der Großhirnrinde einschließlich. Es spielt eine entscheidende Rolle bei der selektiven Verdrahtung der verschiedenen neuronalen Subpopulationen. Eine Anzahl von jüngsten Berichte haben gezeigt, dass, zusätzlich zu Verbindungen, die molekulare Vielfalt von Neuronen wird durch die Übernahme von hochspezifischen Modi des Brennens reflektiert. Die Mechanismen , die Erregbarkeit und Konnektivität der verschiedenen neuronalen Subtypen während der Entwicklung, sowie ihre Koordinationsgrad zu bestimmen, sind jedoch immer noch schlecht verstanden ,
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Protokoll
(; PROEX 331/15 PROEX 118/14) Alle Tier Verfahren wurden von der Gemeinschaft von Madrid Animal Care und Use Committee, in Übereinstimmung mit den nationalen und europäischen Gesetzgebung zugelassen. Aufrechterhaltung steriler Bedingungen während des Verfahrens.
1. In Utero Elektroporation
Hinweis: Dieses Protokoll für IUE wird von den anderen angepaßt , die zuvor veröffentlicht wurden 5, 6, 7. Diese Handschrift beschreibt ein Protokoll für die IUE von E15.5 Embryonen, mit Modifikationen in der Reporter - Strat....
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Ergebnisse
Um die morphologischen Veränderungen von Neuronen im Detail zu charakterisieren und während der Entwicklung ist es wesentlich Neuronen dünn zu etikettieren. Ein Cre-Rekombinase verdünnt System ermöglicht die Expression eines Gens von Interesse in einer spärlichen Population von Neuronen, so dass nur solche Neuronen , die dieses Enzym exprimieren GFP (1A) integrieren. Mit dieser Strategie Schicht II-III wird gezielt und von IUE bei E15.5 gekennzeichnet. CAG-DsRed2 bei 1 u.......
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Diskussion
Dieses Protokoll beschreibt im Detail, wie Neuronen des somatosensorischen Kortex von C75BL / 6-Mäuse zu beschriften, um ihre Verbindungen und ihre Erregbarkeit zu analysieren. In Bezug auf die bestehenden Methoden, visualisiert sie diskriminierende Aspekte der Konnektivität, wie die Anzahl der axonalen Verzweigungen pro Neuron, ihre genaue Topographie und ihrer anatomischen Lage. Durch Veränderung der Position der Elektroden, ist es möglich , andere Neuronenpopulationen, wie beispielsweise die cingulären Cortex zu ziel.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Wir danken R. Gutiérrez und A. Morales für ihre hervorragende technische Unterstützung und LA Weiss für die Bearbeitung. CGB wird von der spanischen Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011 finanziert. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von BBVA-Stiftung und SAF2014-58598-jin (Mineco) M. Navarrete und durch einen Zuschuss aus dem Ramón Areces Stiftung und Zuschüsse SAF2014-52119-R und BFU2014-55738-REDT finanziert (von Mineco) zu M. Nieto.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 | |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 | |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 | |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | |
| Fast | Green Carl Roth | 301.1 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP | |
| Isofluran (IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP | |
| Ketamin (Imalgen) | Merial | 2528-ESP | |
| Xylazin (xilagesisch) | Calier | 0682-ESP | |
| Povidon Jod | Meda | 694109.6 | |
| Augensalbe (Lipolac) | Angelini | 65.277 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco by Life Technologies | 24020-091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Skalpellgriff # 3 - 12 cm | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Skalpellklingen # 10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Adson Pinzette - Gerade 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| Gehärtete Feinschere - Gerade 11 cm | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Schere Mezenbaum-Nelson Gebogen L=14,5 cm | Teleflex | PO143281 | |
| Dünne gebogene Spitzen - Style 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO | |
| Dumont #5 Pinzette-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Mathieu Nadelhalter - Gezahnt | Fein Science Tools | 12010-14 | |
| AutoClip Applier | Braintree scientific, Inc | ACS APL | |
| 9 mm AutoClips | MikRon Precision, Inc. | ||
| Nahtmaterial - Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 | |
| Elektrorasierer | Panasonic | ER 240 | |
| Kapillaren aus Borosilikatglas (100 mm, 1,0/0,58 Außen-/Innendurchmesser) | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| Aspiratorröhrchen für kalibrierte Mikrokapillarpipetten | Sigma -Aldrich | A5177-5EA | |
| Gaze (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 | |
| Wattestäbchen (Star Cott) | Albasa-Nadel | ||
| 25 g (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Saccharose | Sigma -Aldrich | S0389 | |
| Paraformaldehyd | Sigma -Aldrich | 158127 | |
| OCT Compound | Sakura | 4583 | |
| Gewebekulturschale 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| GFP Tag Polyklonaler Antikörper | Thermo Fisher Scientific | A-11122 | |
| Sekundärer Antikörper, Alexa Fluor 488 Konjugat | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Fötales Rinderserum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Elektroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatur | 45-0002 | |
| Platinelektroden 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 | |
| Mikroskop für Fluoreszenzbildgebung - MZ10F | Leica-VIP | ||
| 3000 Isofluoran-Verdampfer | |||
| Laserscanning-System | Leica-Axiovert | ||
| 200 Mikroskop | Zeiss-Kryostat | ||
| - CM 1950 | Leica-P-97 | ||
| Mikropettenabzieher | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Patch-Clamp-Analyse-Softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) | Molecular | Devices-Acquisition | |
| Software (MultiClamp 700B Verstärker) | Molecular Devices | DD1440A | |
| Motorisierter Mikromanipulator + rotierender Sockel | Sutter Instrument | MP-225 | |
| Lufttisch | |||
| WPI | - |
Referenzen
- Dehorter, N., et al. Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch. Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).
- Rodriguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheri....
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Nachdrucke und Genehmigungen
