Method Article

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

DOI:

10.3791/55148

⸱

March 5th, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biosciences and Nutrition, Karolinska Institutet, 2School of Technology and Health, KTH Royal Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Viele Proteine erfüllen ihre Funktion, wenn sie an Membranoberflächen gebunden sind. Die Bindung von extrinsischen Proteinen an Nanodisc-Membranen kann indirekt durch Transmissionselektronenmikroskopie abgebildet werden. Wir zeigen, dass das charakteristische Stapeln (Rouleau) von Nanodiscs, das durch die Negativfärbung Natriumphosphotungat induziert wird, durch die Bindung von extrinsischem Protein verhindert wird.

Abstract

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Monotope Proteine üben ihre Funktion aus, wenn sie an eine Membranoberfläche gebunden sind, und solche Wechselwirkungen hängen von der spezifischen Lipidzusammensetzung und von der Verfügbarkeit von genügend Fläche ab, um die Funktion zu erfüllen. Nanodiscs werden verwendet, um eine Membranoberfläche mit kontrollierter Größe und Lipidgehalt bereitzustellen. In Abwesenheit von gebundenen extrinsischen Proteinen erscheinen mit Natriumphosphotungat gefärbte Nanodiscs von der Seite mit der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) als Münzstapel. Dieses Protokoll ist daher so konzipiert, dass es das Stapeln absichtlich fördert. Folglich kann die Verhinderung des Stackings als Bindung des membranbindenden Proteins an die Nanodisc interpretiert werden. In einem weiteren Schritt können die TEM-Bilder der Protein-Nanodisc-Komplexe mit Standard-Einzelpartikelmethoden bearbeitet werden, um niedrig aufgelöste Strukturen als Grundlage für höher aufgelöste KryoEM-Arbeiten zu erhalten. Darüber hinaus liefern die Nanodiscs Proben, die entweder für die TEM- oder die nicht-denaturierende Gelelektrophorese geeignet sind. Zur Veranschaulichung der Methode wird die Ca2+-induzierte Bindung von 5-Lipoxygenase auf Nanodiscs vorgestellt.

Introduction

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In der medizinischen Forschung wird viel Aufmerksamkeit auf Membranproteine ​​fokussiert, entweder intrinsisch oder extrinsisch, in einer Vielzahl von Lipid-Wechselwirkungen beteiligt. Arbeiten mit lipidinteragierenden Proteinen enthält entweder einen Ersatz zu den Lipiden der Auswahl wie Detergenzien, amphipols 1 oder kleinen Proteinen 2 oder eine Membran Ersatz zu finden , die das Protein löslich und aktiv hält. Lipoic Membran Ersatzstoffe sind Liposomen und Nanoscheiben (ND) , 3, 4.

Nanoscheiben sind nahezu native Membranplattformen durch Engineering der Proteinteil entwickelt, ApoA-1, der High-Density-Lipoprotein (HDL) natürlich im Blut auftreten. ApoA-1 ist ein 243-Rest-langen Kette von kurzen amphipathische α-Helices und hat eine lipidfreie lösliche Konformation. In vitro , wenn in Gegenwart von Lipiden, zwei Kopien des Proteins Apo A-1 spontan neu ordnen die hydr einzukreisenophobic Acylkette Teil eines Lipid - Doppelschicht - Patch 5. Ausgeführt Versionen von ApoA-1 sind in der Regel Membrangerüstproteine ​​(MSP) genannt, und eine wachsende Zahl sind als Plasmide oder als gereinigte Proteine ​​im Handel erhältlich. Wiederholungen oder Deletionen der α-Helices in ApoA-1 Ergebnis in mehr 6 oder kürzer 7 Membrangerüstproteine. Dies wiederum macht es möglich , Scheiben etwa 6 nm 7-17 nm 8 im Durchmesser zu bilden. Es gibt verschiedene Arten von Anwendungen für den Nanoscheiben 3, 9. Die am häufigsten verwendete Anwendung ist für die Stabilisierung eines integralen Membranproteins 8, überprüft zuvor 3, 9 eine nahezu native Membranumgebung. Ein weniger erforschten Einsatz ist eine nanoskalige Membranoberfläche für die Studie zur Verfügung zu stellenperiphere Membranproteine 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Abschnitt 1 des Protokolls visualisiert unter das Verfahren für die Herstellung von Nanoscheiben, bestehend aus Phospholipiden und Membrangerüstprotein.

Die Probenvorbereitung ist ein Engpass bei den meisten Methoden. Methodenspezifische Proben können bestimmte Informationen hinzufügen, aber sie auch Vergleiche der Ergebnisse schwierig. Daher ist es einfacher, wenn Proben multimodal und kann in verschiedenen Verfahren unmittelbar verwendet werden. Ein Vorteil bei der Verwendung von Nanoscheiben ist die geringe Größe der nanodisc im Vergleich zu Liposomen (zB können die Proben direkt verwendet werden für sowohl TEM und nicht-denaturierenden Gelelektrophorese, wie in dem vorliegenden Protokoll).

Vesikeln und Liposomen sind seit langem verwendet worden, um die Funktion von membraninteragierende Proteine ​​zu verstehen. Für Strukturuntersuchungen und Visualisierung, ein Beispiel für die Strukturbestimmung eines Transmembranproteins in Liposomen verfügbar ist 18. keine hochauflösende 3D-Struktur eines monotopen Membranprotein auf einer Liposomenmembran eingebettet hat sich jedoch noch nicht veröffentlicht worden ist, soweit wir wissen. Gold - Nanopartikel oder Antikörper können verwendet werden , um Proteine zu visualisieren , um Liposomen oder Vesikel Bindung TEM 19. Obwohl diese Sonden sehr spezifisch sind, könnten sie mit membranbindende Proteine ​​stören, indem die Membran-Bindungsstelle Verschleierung oder Bereiche von Interesse mit den flexiblen Teilen maskieren. Gold-markierte Antikörper oder komplexierten Proteine ​​könnten wahrscheinlich auf einem Agarosegel analysiert werden, aber dies würde die Kosten des Experimentes zu erhöhen.

Obwohl Liposomen eine hervorragende Plattform sind, kann man nicht, dass der Pop sicher sein,ulation hat ein bestimmtes Verhältnis Protein pro Liposom, eine Funktion , die 20 durch die Verwendung von Nanoscheiben untersucht werden kann. In einem Liposom, Cofaktoren und Substrate können in dem löslichen Innenraum eingefangen werden. Substanzen, die Membran-löslich sind das gleiche Schicksal für beide Arten von Membran-Mimetika teilen. Dennoch, wie die Doppelschicht-Bereich kleiner in Nanoscheiben ist, wird eine geringere Menge an Substanz erforderlich, um die Membranen nanodisc zu sättigen.

Verständnis der Proteinfunktion durch die Bestimmung der Atomstruktur seit vielen Forschungsgebieten wesentlich gewesen. Verfahren zur Proteinstrukturbestimmung umfassen Röntgen 21; Kernspinresonanz (NMR) 22, 23; und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 24 bei kryogenen Temperaturen, Kryo - EM. Die Auflösung von Kryo-EM hat in letzter Zeit stark verbessert, vor allem durch den Einsatz von direkten Elektronen detektoren 25, 26. Die Makromoleküle werden in dünnen, glasigen Eis 27 in einer nahezu nativen Zustand abgebildet. Jedoch aufgrund der geringen Kontrast von biologischen Molekülen, werden sie hart im Größenbereich von 100 zu erfassen - 200 kDa. Für geeignet bemessene Proben kann die Datenerfassung aus , und das Verfahren der einzelnen Partikels Rekonstruktion werden kann , eine Struktur zu erhalten , 28 angewendet werden.

Jedoch ist die Bestimmung der Proteinstruktur durch TEM ein mehrstufiger Prozess. Es beginnt in der Regel mit der Auswertung der Probe Monodispersität durch negative Flecken TEM 29 Salze von Schwermetallen wie phosphotungsten (PT) 30 oder Uran 31 verwendet wird . Rekonstruktion eines niedrigauflösenden Modell der negativ gefärbten Makromolekül ist in der Regel gemacht und kann wichtige Informationen über die molekulare Struktur 29 erhalten wird . Parallel zu,Datenerfassung mit Kryo-EM starten kann. Es sollte darauf geachtet werden, wenn die negative stain TEM Daten Auswertung der Fehlinterpretation von Artefaktbildung zu vermeiden. Ein besonderes Artefakt ist die Wirkung des PT Fleck auf Phospholipide und Liposomen 32, was zur Bildung von langen Stangen ähnlich Stapeln von Münzen von der Seite 33. Solche "Rouleau" oder "Stapel" (im Folgenden als "Stapel" bezeichnet) wurden für die HDL 34, früh beobachtet und später auch für die 35 - Nanoscheiben.

Die Stapelung und Überarbeitung von Membranen können aus vielen Gründen auftreten. Beispielsweise kann es durch Co-Faktoren wie Kupfer induziert werden, durch TEM - Bildgebung in einem Fleck Ammoniummolybdat 36 gezeigt. Eine Fraktion der Membranlipide in Liposome enthielten eine Iminodiessigsäure Kopfgruppe Metall Komplexierung durch EDTA nachahmt, wodurch Liposomen nach Zugabe von Kupferionen Stapeln 36. Stacking könnte auch durch eine Protein-Protein - Wechselwirkung durch ein Protein in oder auf den Lipid - Doppelschichten (die Beize verwendet wird nicht erwähnt) 37. Die Stapelbildung von Phospholipiden von PT wurde schon früh beobachtet; jedoch hat später Arbeit konzentrierte sich auf die Beseitigung oder die Abschaffung dieses Artefaktbildung 38.

Hier schlagen wir eine Methode Vorteil der NAPT-induzierten nanodisc zu nehmen für die Untersuchung von membranbindenden Proteinen, die durch TEM Stapeln. Kurz gesagt, Protein auf der Nanoscheiben Bindung würde die Nanoscheiben aus Stapeln verhindern. Obwohl die Gründe für die Stapelung nicht klar sind, wurde es 39 vorgeschlagen , dass zwischen den Phospholipiden und der Phosphorylgruppe von PT, wodurch die Scheiben zu kleben aneinander (1A) eine elektrostatische Wechselwirkung ist. Die Hypothese hinter unserem Protokoll ist, dass, wenn ein Protein an ein nanodisc bindet, die meisten der Phospholipid-Oberfläche nicht Availa ist Ble für die Interaktion mit dem PT aufgrund der sterischen Hinderung durch das Protein. Dies würde verhindern , dass der Stapelbildung (1B). Zwei Schlussfolgerungen gezogen werden können. Erstens bedeutet die Verhinderung der Stapelung, dass das Protein von Interesse an die Membran gebunden ist. Zweitens kann das Protein-ND - Komplex mit Standard - Einzelpartikelverarbeitungsverfahren 24, 40 eine grobe Morphologie des Komplexes zu erhalten behandelt werden. Darüber hinaus können Analysen durch Methoden wie nicht denaturierenden Gelelektrophorese oder dynamische Lichtstreuung durchgeführt werden.

Um diese Hypothese zu belegen, haben wir die Membran-bindende Protein 5-Lipoxygenase (5LO), die 41 in vielen Entzündungskrankheiten beteiligt ist, 42. Dieses 78-kDa - Protein erfordert Ionen Calcium zu seiner Membran 43 zu binden. Obwohl diese Membranassoziation ausgiebig unter Verwendung von Liposomen untersucht wurdes = "Xref"> 44, 45, 46 und Membranfraktionen 47, können diese nicht für die TEM - Analyse und Strukturbestimmung verwendet werden.

Die Herstellung von Nanoscheiben beginnt mit MSP mit Lipid in dem Detergens Natriumcholat resuspendiert Mischen. Nach der Inkubation auf Eis für 1 h wird das Detergens aus der Rekonstitution Mischung unter Verwendung eines adsorbierenden Harzes langsam entfernt. Diese Art von Material wird häufig von Polystyrol in kleine Kügelchen geformt gemacht. Sie sind relativ hydrophob und haben eine starke Präferenz für Waschmittel - Bindung im Vergleich zu Lipiden 48. Nachdem die hydrophoben Kügelchen zu entfernen und die Durchführung Klärung Zentrifugation werden die Nanoscheiben durch Grßenausschlußchromatographie (SEC) gereinigt. Die gereinigten Nanoscheiben sind mit einem monotopen Membranprotein gemischt (und ggf. Co-Faktoren) in einem äquimolaren Verhältnis (oder mehrerer Verhältnisse für eine Titration) und an r linksEACT (15 min). Die Analyse mittels TEM wird durch Anlegen ul-Probenmengen auf glow-entladen, mit Kohlenstoff beschichteten Gitter und dann, indem eine negative Färbung mit NAPT durchgeführt. Die gleiche Probe aus, wenn die Aliquots auf die TEM Gitter aufgetragen wurden, können für die Analyse durch nicht-denaturierende PAGE oder SDS-Gelelektrophorese sowie durch verschiedene Arten von Aktivitätsmessungen verwendet werden, wobei keine wesentlichen Änderungen.

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Protocol

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1. Herstellung von Nanoscheiben

  1. Expression und Reinigung des Membrangerüstprotein 8, 35
    1. Express das His-Tag MSP1E3D1 in den E. coli BL21 (DE3) T1R pRARE2 Stamm in Flaschen. Bereiten Sie eine 50-ml-Übernachtstarterkultur mit LB-Medium, ergänzt mit 50 ug / ml Kanamycin bei 37 ° C. Verdünnen Sie die über Nacht Starterkultur in 2 l Terrific Broth-Medium mit 50 ug / ml Kanamycin.
    2. Wachsen die Zellen bei 37 ° C , bis die optische Dichte bei 600 nm (OD 600) erreicht ca. 3 die Proteinexpression bei 18 ° C Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) für 3 h mit 0,5 mM Induce.
    3. Vorbereitung der Lysepuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 100 mM NaCl und 10% Glycerol). 1 mM TCEP unmittelbar vor der Verwendung.
    4. Nach 3 h Induktion bei 18 ° C, Ernte der Zellen durch Zentrifugation für 10 min bei 4500 xgund 4 ° C. Überstand verwerfen, wiegen die geernteten Zellen und resuspendieren sie in Lyse-Puffer bei einem Verhältnis von 2 ml Lysepuffer pro g Zellen.
    5. Lyse der Zellen durch gepulste Beschallung (Wiederholungsrate: 4 s ON, 4 s AUS) für 3 min bei 80% Amplitude.
    6. Zentrifugation der Lysate 20 min bei 49.000 xg und 4 ° C. Entsorgen Sie das Pellet aus dieser Zentrifugation.
    7. Injizieren Sie den Überstand in einen 5-ml - Ni + chelatbildende Säule zu einem automatisierten Flüssigkeits - Chromatographie - System angeschlossen vorzugsweise bei 4 ° C gehalten.
    8. Vor dem Elutionsschritt (Schritt 1.1.9), Waschen der Säule mit Puffer 1-3, um alle Proteine ​​zu entfernen, außer dem His-Tag MSP. Überwachen Sie den Proteingehalt bei 280 nm den Reinigungsprozess zu folgen; die UV-Aufzeichnung bei 280 nm sollte nach jeder Wäsche auf den Ausgangswert zurück.
      1. Waschen mit Waschpuffer 1: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol und 1% Triton, pH 8,0.
      2. Waschen mit Waschpuffer 2: 40 mM Tris-HCl, 300 mMNaCl, 20 mM Imidazol und 50 mM Natriumcholat, pH 8,0.
      3. Waschen mit Waschpuffer 3: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl und 50 mM Imidazol, pH 8,0.
    9. Eluieren die MSP mit 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl und 500 mM Imidazol, pH 8,0.
    10. Ändern des Pufferstandardpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM NaCl und 0,5 mM EDTA) MSP durch Gelfiltration 8, 35; die Ausbeute pro Charge sollte um 7 mg L -1.
  2. Herstellung von Phospholipid-Stammlösung
    1. Hinzufügen 305 & mgr; l von 1-Palmitoyl-2-oleoyl- sn - glycero-3-phosphocholin (POPC) , gelöst in Chloroform bei einer Konzentration von 25 mg / mL in einem Becherglas und verdampfe das Chloroform indem sie mit einem leichten Stickstoffstrom gespült . Trocknen Sie das Lipid über Nacht in einem Vakuumexsikkator. HINWEIS: Dieser Schritt wird durchgeführt, um das Lösungsmittel aus dem Lipid zu entfernen, die sich am Boden des Becherglases eine dünne Lipidfilm verläßt.
    2. Resuspendieren Lipidkuchen in 200 ul MSP Standardpuffer, enthaltend 100 mM Natriumcholat durch Vortexen das Rohr, bis die Lösung transparent wird; Dies wird eine Lösung mit einer Konzentration von POPC 50 mM bereitzustellen.
      HINWEIS: In der Regel sollte das molare Verhältnis von Lipid zu Detergens an dieser Stelle 1: 2 (Lipid: Detergens) 8. Diese Lipid-Detergens-Mischung kann für fast 2 Monate bei -80 ° C gelagert werden.
  3. Herstellung von hydrophoben Perlen für Waschmittel Entfernung
    1. Platz 5 g Perlen (Trockengewicht) in einem 50-ml-Röhrchen.
    2. Waschen der Kügelchen mit 30 ml 100% igem Methanol und dann mit 40 ml Reinstwasser.
    3. Waschen Sie die Perlen mit 10 ml MSP Standardpuffer. Schließlich speichern Sie die Perlen mit 15 ml MSP Standardpuffer bei 4 ° C.
  4. Nanodisc Rekonstitution
    1. Dispense 190 & mgr; l MSP1E3D1 (0,124 mM) in ein Mikrozentrifugenröhrchen und fügen 61,5 ul von Phospholipid-Stammlösung (50 mM POPC) auf das gleiche Rohr. Inkubieren Sie die Rekonstitution Mischung auf nassem Eis für 1 Stunde. ANMERKUNG: Dies entspricht einem molaren Verhältnis von 1: 130 (MSP1E3D1: POPC).
    2. In hydrophobe Kügelchen in einer Konzentration von 0,5 g Kügelchen pro ml Rekonstitution Mischung die Selbstorganisationsprozess zu initiieren. Inkubieren in einem Rotations Inkubator für 16 h bei 4 ° C.
    3. Nach der Inkubation Zentrifuge für 10 min bei 13.000 xg und 4 ° C, um die Ausfällungen und Aggregate zu entfernen. Entsorgen Sie das Pellet und der Überstand speichern.
    4. Äquilibrieren der Grßenausschluß-Chromatographie-Säule (montiert auf einem automatisierten Flüssigkeits-Chromatographie-System) mit Puffer MSP-Standard, bis die Absorption bei 280 nm stabil ist. Injizieren Sie den Überstand in die Kolonne und sammeln Sie die Peakfraktionen.
    5. Messung der Konzentrationen von Nanoscheiben in den Peak-Fraktionen bei 280 nm. Verwenden des molaren Extinktionskoeffizienten von MSP1E3D1 (ε = 29.910 cm -1 M -1) für die Berechnung der Konzentration nanodisc. Beachten Sie dasAnzahl von Lipiden pro nanodisc kann allein durch eine Kombination von radiomarkiertem Lipiden und Phosphatanalyse 4 oder durch Phosphat - Analyse gemessen werden.

2. Herstellung des monotopen Protein 5-Lipoxygenase 35

  1. Bereiten Sie eine Nacht Starterkultur. Supplement 50 ml LB-Medium mit 100 ug / ml Ampicillin. Beimpfen des Mediums mit E. coli BL21 (DE3) , der das Plasmid des 5-Lipoxygenase - Gens (ALOX5) enthält. Verdünne die über Nacht Starterkultur in Expressionsmedium , enthaltend 42 mM Na 2 HPO 4, 24 mM KH 2 PO 4, 9 mM NaCl, 19 mM NH 4 Cl, 1 mM MgSO 4, 0,1 mM CaCl 2, 0,2% D-Glucose, 0,1 %, 5 & mgr; M FeSO 4 und 100 & mgr; g / ml Ampicillin. Die Zellen wachsen , bis die OD 600 ~ 0,5 bei 25 ° C. Induzieren Proteinexpression mit 0,2 mM IPTG für 16 h bei 20 ° C 35.
  2. Ernte durch Zentrifugation für 10 min bei 7000 × g und 4 ° C und den Überstand verwerfen. Wiegen Sie das Pellet am Boden des Röhrchens enthält die geernteten Zellen und Resuspendieren der geernteten Zellen in Lysepuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 100 mM NaCl; 10% Glycerin und 1 mM TCEP), enthaltend Proteaseinhibitor und 0,5 mg / ml Lysozym 35 in einem Verhältnis von 2 ml Lysepuffer pro g Zellen.
  3. Lyse der Zellen durch Beschallung für 5 x 15 s bei 80% Amplitude. Entfernen der Zelldebris durch Zentrifugation für 10 min bei 7000 xg und 4 ° C. Führen Ammoniumsulfatfällung bis 30 - 60% Sättigung 35 , die Proteine in der Lösung auszufällen. Zentrifuge für 15 min bei 16.000 xg und 4 ° C. HINWEIS: Die 5LO Pellet schnell eingefroren und bei -80 ° C gelagert werden kann für bis zu 6 Monate.
  4. Das Pellet mit 20 ml Lyse-Puffer und zentrifugieren für 15 min bei 40.000 xg und 4 ° C.
  5. Inkubieren der Überstand auf eine ATP-Agarose-Säule bei 4 ° C für 30 min. Die Säule wird einmal mit einem Säulenvolumen Lysepuffer enthaltend 0,5 M NaCl. Eluieren die 5LO mit 20 mM ATP in Lysepuffer , enthaltend 10 & mgr; M FeSO 4 und 20 ug / ml Katalase. Führen Gelfiltrationschromatographie , um das ATP 35 entfernen.
    HINWEIS: Die 5LO instabil ist und sollte sofort nach der Reinigung verwendet werden. Ansonsten empfiehlt es sich bei dem Schritt des Ammoniumsulphatfällung zu stoppen (siehe Hinweis nach Schritt 2.1.3).

3. Herstellung der Nanodisc-Protein-Komplex

  1. Bereiten Sie ein Gesamtvolumen von 100 & mgr; l-Komplex. Mischungs 0,8 uM ND und 0,8 uM 5LO mit der 1 mM Ca 2+ in dem MSP Standardpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM NaCl; 0,5 mM EDTA und 1,5 mM CaCl 2) und Inkubation für 10 min auf Eis. ANMERKUNG: Die Probe kann für bis zu einem Monat bei 4 ° C 35 gespeichert werden.
ove_title "> 4. Die Analyse der Proben

  1. Die Gel-Elektrophorese
    1. Nicht-denaturierenden Elektrophorese
      1. Mischungs 15 & mgr; l der Probe mit 5 & mgr; l Ladepuffer (50 mM BisTris, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w / v) Glycerin und 0,001% Ponceau S, pH 7,2) 49 und laden sie auf ein 4 - 16% bis-Tris-Gel-Elektrophorese durchzuführen.
      2. Füllen der Kathodentank mit Lichtkathodenpuffer (50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricin, pH 6,8, und 0,002% Coomassie G-250) und die Anodentank mit Laufpuffer (50 mM Bis-Tris und 50 mM Tricin, pH 6,8). Starten Sie die Trennung durch eine konstante Spannung bei 150 V unter Verwendung von
      3. Stoppen Sie die elektrophoretische Trennung, wenn die Coomassie Front das Ende des Gels erreicht.
      4. Stain das Gel mit einem Standard-Coomassie-Blau-Protokoll.
    2. denaturierende Elektrophorese
      1. Mischungs 40 & mgr; l der Probe mit 10 & mgr; l Beladungspuffer, enthaltend SDS (0,05% (w / v) Bromphenolblau, 0,2 M Tris-HCl,pH 6,8; 20% (v / v) Glycerin; 10% (w / v) SDS; und 10 mM 2-Mercaptoethanol) und laden Sie es auf einem 4 - 20% Tris Glycin-Gelelektrophorese durchzuführen.
      2. Füllt die Kathoden- und Anodentanks mit Laufpuffer (25 mM Tris-HCl, pH 6,8; 200 mM Glycin und 0,1% (w / v) SDS). Starten Sie die Trennung durch eine konstante Spannung bei 150 V unter Verwendung von
      3. Stoppen Sie die elektrophoretische Trennung, wenn der Ladefarbstofffront das Ende des Gels erreicht.
      4. Stain das Gel mit einem Standard-Coomassie-Blau-Protokoll.
  2. Vorbereitung der NAPT-Lösung
    1. Man löst 1 g Phosphorwolframat Natriumsalz in 50 ml Wasser durch Rühren bei Raumtemperatur eine 2% ige (w / v) saure Lösung zu ergeben.
    2. Den pH-Wert auf 7,4 mit 1 M NaOH. Entfernen der Teilchen mit einer 0,22 um-Spritzenfilter. Bewahren Sie die Lösung bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C.
  3. Vorbereitung der Probe für die TEM-Analyse
    1. Glimmentladungsspektrometer Kohlenstoff beschichteten Kupfergitter (400 mesh) für 20 s bei 30 mA die Gitter hydrophilen vor der Adsorption der Probe zu machen. Place 3,5 & mgr; l der Probe (0,8 & mgr; M in Bezug auf die Nanoscheiben) auf dem Gitter und inkubiere für 30 s. HINWEIS: Das Volumen angewendet kann zwischen 2,5 und 5 & mgr; l variieren, in Abhängigkeit von der Probenkonzentration. Ein geeigneter Konzentrationsbereich für Nanoscheiben ist 0,5-1 uM.
    2. Abtupfen überschüssige Lösung Filterpapier.
    3. Unmittelbar färben das Gitter mit einem Rückgang von 2% NAPT für 30 s. Abtupfen überschüssige Lösung und lassen Sie das Gitter an der Luft trocknen.
    4. Bewerten Sie die Gitter durch TEM. Ein Mikroskop mit 120-200 keV Beschleunigungsspannung ausreicht, um das Ausmaß der Stapelung zu schätzen. HINWEIS: Für das vorliegende Protokoll wird ein kalibrierter Transmissions-Elektronenmikroskop verwendet wurde, ausgerüstet mit einem 200 keV Feldemissionsquelle.
    5. Notieren Sie sich die TEM-Aufnahmen. Für die Bilder lange Stapel zeigt, verarbeiten nicht weiter; Bilder zeigen den Komplex von Nanoscheiben, mit extrinsischen Protein, das ein paar enthaltenShort-Stacks, aber die meisten Teilchen sind in der Anlage. Nehmen Sie mehrere Bilder und verarbeiten diese nach Standardmethoden Klasse-Mittelwerte und eine niedrige Auflösung, 3-dimensionale Modell des Komplexes zu erhalten.
      HINWEIS: Für die Sammlung von negativen Fleckdaten, Gitter an mindestens drei verschiedenen Tagen hergestellt wurden. Für jeden Tag, frische Probe Inkubationen (wie in Schritt 3.1) gemacht wurden, bevor die Negativfärbung angewendet wurde.

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Results

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Die Methode, die wir vorschlagen, ist abhängig von der Herstellung von Nanoscheiben Bindung der Membranoberfläche für monotopen Membran-Protein bereitzustellen. Da es keine Transmembranprotein in die Lipid - Doppelschicht nanodisc eingebettet ist, werden die Nanoscheiben hier als "leere Nanoscheiben" (2A) bezeichnet. Diese weisen ein berechnetes Molekulargewicht von 256 kDa für eine Zusammensetzung von zwei MSP1E3D1 Gerüstproteine und etwa 260 Moleküle von POPC

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Discussion

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Das Verfahren kann in drei Teile unterteilt werden: die Rekonstitution von leeren Nanoscheiben, die Herstellung von Protein-nanodisc Komplexe und die negative Färbung für die TEM dieser Komplexe. Jeder Teil wird separat in Bezug auf Beschränkungen der Technik, wichtige Schritte, und nützliche Änderungen gerichtet.

Die Rekonstitution von leeren Nanoscheiben. Kritische Schritte und Einschränkungen in der Herstellung und Verwendung von Nanoscheiben.

Für die Herstellung...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken der schwedischen Research Council, Stockholm County Council, und KI Mittel für ihre Unterstützung. Die Expression und Reinigung von MSP wurde am Karolinska Institutet / SciLifeLab Protein Science Core Facility (http://PSF.ki.se) durchgeführt. Die Autoren möchten sich auch Dr. Pasi Purhonen und Dr. Mathilda Sjöberg für die gemeinsame Nutzung ihrer technischen Know-how und für ihre rechtzeitige Unterstützung zu danken.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Transmissionselektronenmikroskop: JEOL2100FJEOL
CCD-KameraTiez Video and Imaging Processing System GmbH, Deutschland
GlühaustragBaltec
TEM Gitter: 400 meshTAABGM016/C
Größenausschluss Chromatographie: Agilent SEC-5Agilent Technologies5190-2526
Superdex 200 HR 10/300GE Healthcare Life Sciences17-5172-01
Plasmid: MSP1E3D1Addgene20066
Bakterien: BL21DE3NEBC2527H
Bakterien: BL21 (DE3) T1R pRARE2Protein Science Facility, KI, Solna
Aufreinigungsmatrix: ATP AgaroseSigma AldrichA2767
Aufreinigungsmatrix: HisTrap HP-5 mLGE Healthcare Life Sciences17-5247-01
Lipid: POPCAvanti polare Lipide850457C25 mg/ml in Chloroform
Hydrophobe Kügelchen: Bio-Beads, SM-2 ResinBio-Rad1523920
13 mm Spritzenvorsatzfilter: 0,2 μ mPall life sciencesPN 4554T
Färbung: Natriumphosphotungat tribasisches HydratSigma Aldrich31648
2-MercaptoethanolSigma AldrichM3148-250ML
Natriumdodecylsulfat (SDS)Bio-Rad161-0301
Proteaseinhibitor-CocktailSigma Aldrich4693132001
TCEPSigma Aldrich646547
Waschmittel: NatriumcholathydratSigma AldrichC6445-10G
Natriumcholat500 mM Natriumcholat. In milQ-Wasser resuspendieren und bei -20 °C lagern.
Lipid Stock50 mM POPC, 100 mM Natriumcholat, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl. Bei 4 & deg; C für eine Woche; oder
Lager -80 > C für einen Monat, nachdem die Lösung mit Stickstoff gespült wurde.
MSP Standardpuffer20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5 mM EDTA.
Bei 4 μC lagern.
Nicht denaturierender Elektrophorese-AnodenpufferThermo Fisher ScientificBN200150 mM Bis-Tris, 50 mM Tricin, pH 6,8
Nicht denaturierender Elektrophorese-KathodenpufferThermo Fisher ScientificBN200250 mM Bis-Tris, 50 mM Tricin, pH 6,8, 0,002 % Coomassie G-250
Nicht denaturierender Elektrophorese 4x ProbenbeladungspufferThermo Fisher ScientificBN200350 mM Bis-Tris, pH 7,2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10 % (w/v) Glycerin, 0,001 % Ponceau S
Denaturierungselektrophorese LaufpufferInhouse-Rezeptur: 25 mM Tris-HCl, pH 6,8, 200 mM Glycin, 0,1 % (w/v)
5x Probenbeladung PufferInhouse-Rezeptur: 0,05 % (w/v) Bromphenolblau, 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8, 20 % (v/v) Glycerin, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-Mercaptoethanol
Terrific BouillonTrypton - 12,0 g, Hefeextrakt - 24,0 g, 100 mL 0,17 M KH2PO4 und 0,72 M K2HPO4, Glycerin - 4 mL.
Trypton, Hefeextrakt und Glycerin wurden auf 900 mL aufbereitet und separat autoklaviert. KH2PO4 und K2HPO4 wurden separat vorbereitet und autoklaviert. Beide wurden vor der Verwendung des Mediums gemischt.
SDS-Denaturierungselektrophorese

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kleinschmidt, J. H., Popot, J. L. Folding and stability of integral membrane proteins in amphipols. Arch Biochem Biophys. 564, 327-343 (2014).
  2. Frauenfeld, J., et al. A saposin-lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nat Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  3. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat Struct Mol Biol. 23 (6), 481-486 (2016).
  4. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-Assembly of Discoidal Phospholipid Bilayer Nanoparticles with Membrane Scaffold Proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  5. Jonas, A., Steinmetz, A., Churgay, L. The number of amphipathic alpha-helical segments of apolipoproteins A-I, E, and A-IV determines the size and functional properties of their reconstituted lipoprotein particles. J Biol Chem. 268 (3), 1596-1602 (1993).
  6. Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Eng Des Sel. 23 (11), 843-848 (2010).
  7. Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. Optimized phospholipid bilayer nanodiscs facilitate high-resolution structure determination of membrane proteins. J Am Chem Soc. 135 (5), 1919-1925 (2013).
  8. Ritchie, T. K., et al. Methods in Enzymology. Duzgunes, N. ejat 464, Academic Press. 211-231 (2009).
  9. Schuler, M. A., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs as a new tool to examine lipid-protein interactions. Methods Mol Biol. 974, 415-433 (2013).
  10. Nasr, M. L., et al. Membrane phospholipid bilayer as a determinant of monoacylglycerol lipase kinetic profile and conformational repertoire. Protein Sci. 22 (6), 774-787 (2013).
  11. Yokogawa, M., et al. NMR analyses of the interaction between the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) and phosphoinositide embedded in a lipid bilayer. J Biol Chem. 287 (42), 34936-34945 (2012).
  12. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186, 61-67 (2015).
  13. Zhang, P., et al. An Isoform-Specific Myristylation Switch Targets Type II PKA Holoenzymes to Membranes. Structure. 23 (9), 1563-1572 (2015).
  14. Grushin, K., Miller, J., Dalm, D., Stoilova-McPhie, S. Factor VIII organisation on nanodiscs with different lipid composition. Thromb Haemost. 113 (4), 741-749 (2015).
  15. Baylon, J. L., Lenov, I. L., Sligar, S. G., Tajkhorshid, E. Characterizing the membrane-bound state of cytochrome P450 3A4: structure, depth of insertion, and orientation. J Am Chem Soc. 135 (23), 8542-8551 (2013).
  16. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Oncogenic and RASopathy-associated K-RAS mutations relieve membrane-dependent occlusion of the effector-binding site. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), 6625-6630 (2015).
  17. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Membrane-dependent modulation of the mTOR activator Rheb: NMR observations of a GTPase tethered to a lipid-bilayer nanodisc. J Am Chem Soc. 135 (9), 3367-3370 (2013).
  18. Wang, L., Sigworth, F. J. Structure of the BK potassium channel in a lipid membrane from electron cryomicroscopy. Nature. 461 (7261), 292-295 (2009).
  19. Ackerson, C. J., Powell, R. D., Hainfeld, J. F. Site-specific biomolecule labeling with gold clusters. Methods Enzymol. 481, 195-230 (2010).
  20. Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (31), 11509-11514 (2006).
  21. Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. Membrane protein structure determination - the next generation. Biochim Biophys Acta. 1838 (1 Pt A), 78-87 (2014).
  22. Dias, D. M., Ciulli, A. NMR approaches in structure-based lead discovery: recent developments and new frontiers for targeting multi-protein complexes. Prog Biophys Mol Biol. 116 (2-3), 101-112 (2014).
  23. Viegas, A., Viennet, T., Etzkorn, M. The power, pitfalls and potential of the nanodisc system for NMR-based studies. Biol Chem. , (2016).
  24. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  25. Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy (Oxf). 65 (1), 35-41 (2016).
  26. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  27. De Carlo, S., Adrian, M., Kalin, P., Mayer, J. M., Dubochet, J. Unexpected property of trehalose as observed by cryo-electron microscopy. J Microsc. 196 (1), 40-45 (1999).
  28. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nat Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  29. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
  30. Forte, T. M., Nordhausen, R. W. Electron microscopy of negatively stained lipoproteins. Methods Enzymol. 128, 442-457 (1986).
  31. Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J Struct Biol. 141 (1), 43-52 (2003).
  32. Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. J Lipid Res. 52 (1), 175-184 (2011).
  33. Zhang, L., et al. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).
  34. Matz, C. E., Jonas, A. Micellar complexes of human apolipoprotein A-I with phosphatidylcholines and cholesterol prepared from cholate-lipid dispersions. J Biol Chem. 257 (8), 4535-4540 (1982).
  35. Kumar, R. B., et al. Structural and Functional Analysis of Calcium Ion Mediated Binding of 5-Lipoxygenase to Nanodiscs. PLoS One. 11 (3), e0152116(2016).
  36. Waggoner, T. A., Last, J. A., Kotula, P. G., Sasaki, D. Y. Self-assembled columns of stacked lipid bilayers mediated by metal ion recognition. J Am Chem Soc. 123 (3), 496-497 (2001).
  37. Kovacs, E., et al. Analysis of the Role of the C-Terminal Tail in the Regulation of the Epidermal Growth Factor Receptor. Mol Cell Biol. 35 (17), 3083-3102 (2015).
  38. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy. J Vis Exp. (90), e51087(2014).
  39. Zhang, L., Tong, H., Garewal, M., Ren, G. Optimized negative-staining electron microscopy for lipoprotein studies. Biochim Biophys Acta. 1830 (1), 2150-2159 (2013).
  40. Cong, Y., Ludtke, S. J. Single particle analysis at high resolution. Methods Enzymol. 482, 211-235 (2010).
  41. Radmark, O., Werz, O., Steinhilber, D., Samuelsson, B. 5-Lipoxygenase, a key enzyme for leukotriene biosynthesis in health and disease. Biochim Biophys Acta. 1851 (4), 331-339 (2015).
  42. Anwar, Y., Sabir, J. S., Qureshi, M. I., Saini, K. S. 5-lipoxygenase: a promising drug target against inflammatory diseases-biochemical and pharmacological regulation. Curr Drug Targets. 15 (4), 410-422 (2014).
  43. Radmark, O., Samuelsson, B. Regulation of the activity of 5-lipoxygenase, a key enzyme in leukotriene biosynthesis. Biochem Biophys Res Commun. 396 (1), 105-110 (2010).
  44. Noguchi, M., Miyano, M., Matsumoto, T., Noma, M. Human 5-lipoxygenase associates with phosphatidylcholine liposomes and modulates LTA4 synthetase activity. Biochim Biophys Acta. 1215 (3), 300-306 (1994).
  45. Pande, A. H., Qin, S., Tatulian, S. A. Membrane fluidity is a key modulator of membrane binding, insertion, and activity of 5-lipoxygenase. Biophys J. 88 (6), 4084-4094 (2005).
  46. Pande, A. H., et al. Modulation of human 5-lipoxygenase activity by membrane lipids. Biochemistry. 43 (46), 14653-14666 (2004).
  47. Wong, A., Hwang, S. M., Cook, M. N., Hogaboom, G. K., Crooke, S. T. Interactions of 5-lipoxygenase with membranes: studies on the association of soluble enzyme with membranes and alterations in enzyme activity. Biochemistry. 27 (18), 6763-6769 (1988).
  48. Rigaud, J. L., Levy, D., Mosser, G., Lambert, O. Detergent removal by non-polar polystyrene beads. European Biophysics Journal. 27 (4), 305-319 (1998).
  49. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  50. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. J Vis Exp. (90), e51087(2014).
  51. Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).
  52. Hornschemeyer, P., Liss, V., Heermann, R., Jung, K., Hunke, S. Interaction Analysis of a Two-Component System Using Nanodiscs. PLoS One. 11 (2), 0149187(2016).
  53. Degrip, W. J., Vanoostrum, J., Bovee-Geurts, P. H. Selective detergent-extraction from mixed detergent/lipid/protein micelles, using cyclodextrin inclusion compounds: a novel generic approach for the preparation of proteoliposomes. Biochem J. 330 (Pt 2), 667-674 (1998).
  54. Martin, D. D., Budamagunta, M. S., Ryan, R. O., Voss, J. C., Oda, M. N. Apolipoprotein A-I assumes a "looped belt" conformation on reconstituted high density lipoprotein. J Biol Chem. 281 (29), 20418-20426 (2006).
  55. Cerione, R. A., Ross, E. M. Reconstitution of receptors and G proteins in phospholipid vesicles. Methods Enzymol. 195, 329-342 (1991).
  56. Shaw, A. W., McLean, M. A., Sligar, S. G. Phospholipid phase transitions in homogeneous nanometer scale bilayer discs. FEBS Lett. 556 (1-3), 260-264 (2004).
  57. Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
  58. Civjan, N. R., Bayburt, T. H., Schuler, M. A., Sligar, S. G. Direct solubilization of heterologously expressed membrane proteins by incorporation into nanoscale lipid bilayers. Biotechniques. 35 (3), 553-562 (2003).
  59. Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A step-by-step method for the reconstitution of an ABC transporter into nanodisc lipid particles. J Vis Exp. (66), e3910(2012).
  60. Brooks, S. P., Storey, K. B. Bound and determined: a computer program for making buffers of defined ion concentrations. Anal Biochem. 201 (1), 119-126 (1992).
  61. Gilbert, N. C., et al. The structure of human 5-lipoxygenase. Science. 331 (6014), 217-219 (2011).
  62. Radmark, O. 5-lipoxygenase-derived leukotrienes: mediators also of atherosclerotic inflammation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (7), 1140-1142 (2003).
  63. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. 534 (7607), 347-351 (2016).
  64. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers. Protein Sci. 12 (11), 2476-2481 (2003).

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