Ein Protokoll für die Synthese von 1,2-Azaborinen und die Herstellung ihrer Proteinkomplexe mit T4-Lysozym-Mutanten wird vorgestellt.
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Methodenartikel
Synthese von 1,2-Azaborines und die Vorbereitung ihrer Proteinkomplexe mit T4-Lysozym Mutants
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Wir beschreiben eine allgemeine Synthese von 1,2-Azaborinen unter Verwendung von luftfreien Standardtechniken und Proteinkomplexpräparation mit T4-Lysozym-Mutanten durch Dampfdiffusion. Sauerstoff- und feuchtigkeitsempfindliche Verbindungen werden unter inerter Atmosphäre (N2) entweder mit einem Vakuumgasverteiler oder einer Glovebox aufbereitet und isoliert. Als Beispiel für die Azaborinsynthese demonstrieren wir die Synthese und Reinigung des flüchtigen N-H-B-ethyl-1,2-azaborin durch eine fünfstufige Sequenz mit Destillation und Säulenchromatographie zur Isolierung von Produkten. Die T4-Lysozym-Mutanten L99A und L99A/M102Q werden mit dem Escherichia coli RR1-Stamm exprimiert. Standardprotokolle für die chemische Zelllyse, gefolgt von einer Reinigung unter Verwendung einer Carboxymethyl-Ionenaustauschsäule, ermöglichen ein Protein von ausreichend hoher Reinheit für die Kristallisation. Die Proteinkristallisation wird in verschiedenen Fällmittelkonzentrationen in unterschiedlichen pH-Bereichen unter Verwendung der Hanging Drop Vapor Diffusionsmethode durchgeführt. Die komplexe Vorbereitung mit den kleinen Molekülen erfolgt durch die Dampfdiffusionsmethode unter einer inerten Atmosphäre. Die Röntgenbeugungsanalyse des Kristallkomplexes liefert einen eindeutigen strukturellen Beweis für Bindungswechselwirkungen zwischen der Proteinbindungsstelle und 1,2-Azaborinen.
Einleitung
Bor-Stickstoff - haltige Heterocyclen (dh 1,2-azaborines) wurden kürzlich große Aufmerksamkeit als Isostere von Arene gezogen. Diese Isosterie kann zur Diversifizierung der bestehenden Strukturmotive führen die chemischen Raum 2, 3, 4 zu erweitern. Azaborines haben potentielle Brauchbarkeit für die Anwendung in der biomedizinischen Forschung 5, 6, 7, 8, vor allem im Bereich der medizinischen Chemie in denen Chemiker strukturell Synthese vo....
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Protokoll
HINWEIS: Alle sauerstoff- und feuchtigkeitsempfindlichen Manipulationen wurden unter einer inerten Atmosphäre (N 2) entweder Standard luftfreie Techniken oder ein Handschuhfach mit. THF (Tetrahydrofuran), Et 2 O (Diethylether), CH 2 Cl 2 (Dichlormethan), Toluol und Pentan wurden durch Hindurchleiten durch eine neutrale Aluminiumoxidsäule unter Argon gereinigt. Acetonitril wurde über CaH 2 getrocknet (Calciumhydrid) und destilliert unter einer Stickstoffatmosphäre vor der Verwendung. Pd / C (Palladium auf Kohle) wurde 12 h bei 100 ° C unter Hochvakuum erwärmt, vor der Verwendung. Kieselgel (230-400 mesh) wurde unt....
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Ergebnisse
Die schematische Syntheseweg für 1,2-azaborines ist in Abbildung 1 dargestellt. Dieses Protokoll gilt für die Synthese von fünf verschiedenen Bor-Stickstoff-enthaltende Moleküle. 2 stellt 11 B - NMR - Spektren im Verlauf von Schritt 1.3 gemessen , um die Bildung des gewünschten Produkts (3) zu überwachen. Proteinreinigung wurde unter Verwendung von Niederdruck - Chromatographie - System durchgeführt , und ein repräsentatives C.......
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Diskussion
Im ersten Teil dieses Protokolls, beschrieben wir eine modifizierte Synthese von 1,2-azaborines basierend auf zuvor beschriebenen Verfahren 12, 13. Triallylborane 22 wurde als Ersatz für die Strecken verwendet allyltriphenyl Zinn oder Kalium allyltrifluoroborate Verwendung zur Herstellung von N -allyl- N -TBS- B allyl Chlorid - Addukt (1). Diese Methode ermöglicht eine atomökonomische und umwelt.......
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Offenlegungen
Alle Autoren erklären, dass sie an diesem Manuskript keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Diese Forschung wurde von den National Institutes of Health NIGMS (R01-GM094541) und dem Boston College unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Tetrahydrofuran (THF), inhibitorfrei, für HPLC, ≥ 99,9% | Sigma Aldrich | 34865 | |
| Diethylether (Et2O), für HPLC, ≥ 99,9%, inhibitorfreies | Sigma Aldrich | 309966 | |
| Methylenchlorid (CH2Cl2), (Stabilisiert/ACS-zertifiziert) | Fisher | D37-20 | |
| Toluol | Fisher | T290-4 | |
| Pentan, HPLC | Fisher | P399-4 | |
| Acetonitril | Fisher | A21-4 | |
| Calciumhydrid (CaH2), Reagenzqualität, 95% | Sigma Aldrich | 208027 | Pyrophores |
| Palladium auf Aktivkohle (Pd/C), 10 Gew.-% Pd | Strem | 46-1900 | |
| 1,0 M Bortrichloridlösung in Hexan | Sigma Aldrich | 211249 | Hochgiftiges/pyrophores |
| Triethylamin, ≥ 99,5% | Sigma Aldrich | 471283 | |
| Grubbs 1st Katalysator der Generation | Materia | C823 | |
| Acetamid | Sigma Aldrich | A0500 | |
| n-Butanol, wasserfrei, 99,8 % | Sigma Aldrich | 281549 | |
| Ethyllithiumlösung, 0,5 M in Benzol/Cyclohexan | Sigma Aldrich | 561452 | Hochgiftige/ pyrophore |
| HCl-Lösung, 2,0 M in Et2O | Sigma Aldrich | 455180 | |
| 2-Methylbutan, wasserfrei, ≥ 99% | Sigma Aldrich | 277258 | |
| Escherichia coli, (Migula) Castellani und Chalmers (ATCC® 31343™) | ATCC | 31343 | |
| T4-Lysozym WT* (L99A) | Addgen | 18476 | |
| T4-Lysozymmutante (S38D L99A M102Q N144D) | Addgen | 18477 | |
| Ampicillin-Natriumsalz | Sigma Aldrich | A0166 | |
| isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) | Invitrogen | AM9464 | |
| Natriumphosphat monobasisch wasserfrei | Fisher | BP329 | |
| Natriumphosphat dibasisch wasserfrei | Fisher | BP332 | |
| Natriumchlorid | Fisher | S642212 | |
| Ethylendiamintetraessigsäure | Fisher | BP118 | |
| Magnesiumchlorid | Sigma Aldrich | M4880 | Korrosiv |
| Thermowissenschaftliches Pierce DNaseI | Fisher | PI-90083 | |
| GE Healthcare Sepharose Fast Flow Kationenaustausch Medien | Fisher | 45-002-931 | |
| Tris-Base | Fisher | BP152-500 | |
| Natriumazid | TCI | S0489 | Hochgiftiges |
| 2-Mercaptoethanol | Fisher | ICN806443 | |
| Sartorius Vivaspin 20 Zentrifugalkonzentratoren | Fisher | 14-558-501 | |
| Kaliumphosphat monobasisch | Sigma Aldrich | P5379 | |
| 2-Hydroxyethyldisulfid | Sigma Aldrich | 380474 | |
| N-Paraton | Hampton Research | HR2-643 | |
| 4 RC Dialyse-Membranschläuche 12.000 bis 14.000 Dalton MWCO | Fischer | 08-667E | |
| CryoLoop | Hampton Research | Kryoschläuche in Form einer Schlaufe | |
| CryoTong | Thermo Fisher | Kryozange | |
| Coot | Elektronendichtebilder werden von der Software generiert |
Referenzen
- Ducruix, A., Giége, R. Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).
- Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. B-N as a C-C substitute in aromatic systems. Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).
- Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -Y.
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Nachdrucke und Genehmigungen
