Vorbereitung von Horizontal Scheiben der erwachsenen Maus Retina für elektrophysiologische Untersuchungen

Zusammenfassung

Wir entwickelten eine horizontale Schnittpräparat der erwachsenen Säugetier-Netzhaut mit der Ebene parallel zu der Netzhautoberfläche sectioning. Dendritische Bereichen nonradially orientierte Netzhautneuronen wurden nicht abgeschnitten, so dass die Untersuchung der Signalverarbeitung mit Patch-Clamp-und Imaging-Techniken.

Zusammenfassung

Vertikale Schnittpräparate sind in der erwachsenen Säugetier-Netzhaut zu untersuchen Schaltung und Signalübertragung aufgebaut. Die Ebene der in diesen Zubereitungen sectioning senkrecht zu der Netzhautoberfläche, wodurch es ideal für die Untersuchung von radial ausgerichteten Neuronen wie Photorezeptoren und bipolaren Zellen machen. Jedoch sind die großen dendritischen Dorne von horizontalen Zellen, Weitfeld amacrine Zellen und Ganglionzellen meist abgestumpften, in diesen Zellen merklich verringert synaptische Aktivität zu verlassen. Während Ganglionzellen und Vertriebenen Amakrinzellen in einer ganzen montierten Vorbereitung der Netzhaut untersucht werden können, horizontalen Zellen und amacrine in der inneren Kernschicht befindlichen Zellen sind nur schwer zugänglich für Elektroden in ganzen Retinagewebe.

Um eine maximale Zugänglichkeit und synaptic Integrität zu erreichen, entwickelten wir eine horizontale Schnittpräparat der Maus Retina und untersucht die Signalübertragung an der Synapse zwischen den Photorezeptoren und horizontalenZellen. Horizontal Sektionieren erlaubt (1) eine einfache und eindeutige visuelle Identifizierung der horizontalen Zellkörper für eine Elektrode Targeting, und (2) Erhaltung der erweiterten horizontalen Zelle dendritischen Feldern, als Voraussetzung für eine intakte und funktionelle cone synaptischen Eingang horizontal Zelle Dendriten.

Horizontale Zellen aus horizontalen Schnitten Tonikum synaptische Aktivität im Dunkeln zeigte, und sie reagierten Lichtblitze mit einer Reduktion der nach innen gerichteten Strom und verminderte synaptische Aktivität zu informieren. Immunzytochemische deutet darauf hin, dass fast alle Kegel innerhalb der dendritischen Feld von einer horizontalen Zellsynapsen mit seiner peripheren Dendriten etablieren. Die horizontale Scheibe Zubereitung ist daher gut geeignet, um die physiologischen Eigenschaften von horizontal erweitert Netzhautneuronen sowie sensorischen Signalübertragung und Integration in ausgewählten Synapsen zu studieren.

Einleitung

Visuelle Information wird codiert als dynamisches räumlich-zeitlichen Muster der Photorezeptoraktivierung und die Band Synapse zwischen Photorezeptoren und zweiter Ordnung Neuronen bestimmt die Downstream Übertragung von visuellen Informationen. Die vertikale slice Herstellung der Säugernetzhaut ist ein sehr wertvolles Werkzeug Signalverarbeitung in vertikalen Bahnen zu untersuchen, dh zwischen Photorezeptoren und bipolaren Zellen und zwischen den bipolaren Zellen und einige Arten von amacrine Zelle ^{1, 2, 3, 4.}

Allerdings vertikale Schnitte verursacht immer schwerer Abschneiden der dendritischen Felder vieler retinalen Neuronen, zu erheblichen Verlust an synaptischen Kontakten führt. Vor allem in der äußeren Netzhaut werden horizontale Zellen betroffen aufgrund ihrer seitlich ausbreiten erweiterten dendritischen Felder und Axonterminal Systeme ^5. In einer vertikalenScheibe Vorbereitung, die synaptischen Eingang von Hunderten von Kegel Photorezeptor-Terminals an den Dendriten einer horizontalen Zelle so zu vereinzelten Kontakten reduziert wird. Dies könnte ausreichen, um die Eigenschaften der einzelnen Synapsen zu studieren, aber es funktioniert bei weitem nicht die Signalverarbeitungsfähigkeiten zugrunde liegen die synchronisierte Aktivierung von Photorezeptor-Band Synapsen darstellen.

Wir entwickelten daher eine horizontale Schnittpräparat, die horizontal Zelle Dendriten intakt und funktionsfähig fast alle des Kegels Photorezeptor synaptischen Eingangs verlässt. Die Ebene der Unterteilung läuft an der Oberfläche der Netzhaut parallel, im Idealfall durch die innere Kernschicht zwischen den horizontalen Zellen und amakrinen Zellen zu schneiden. Somit sind horizontale Schnitte der äußeren Netzhaut enthält, erstellt auf der präsynaptischen Ort, Photorezeptoren mit inneren und äußeren Segmente sowie synaptischen Terminals und horizontalen Zellen und bipolare Zellen auf der postsynaptischen Ort. Die Zubereitung ist gut geeignet, to untersuchen koordinierte synaptischen Eingänge in horizontale Zelle Dendriten von allen Zapfen-Photorezeptoren in seinem dendritischen Feld. Es könnte daher als nützlich erweisen, um besser auf die Funktionsweise des Photorezeptors ribbon Synapse verstehen, die für die Übertragung von visuellen Informationen von der Matrix der Fotorezeptoraktivierung in eine postsynaptische Reaktion entscheidend ist.

Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für Tierversuche, herausgegeben von der Bundesrepublik Deutschland durchgeführt.

Hinweis: Da das Netzhautgewebe während längerer Teile dieses Verfahren frei von Sauerstoff sein, alle Schritte so schnell wie möglich durchgeführt werden soll. Mäuse sollte mindestens 3 Stunden vor der Dissektion dunkel angepasst werden. Um Licht Anpassung der Netzhaut, die Vorbereitung zu vermeiden und Schneiden sollte unter dim rotes Licht durchgeführt werden.

1. Herstellung von Druckmedien und anderen Chemikalien

1. Bereiten Sie Ames 'Medium ^6. Netzhautgewebe in Ames 'Medium zu jeder Zeit nach der Sektion, einzutauchen.
   1. Man löst 2,2 g Ames 'Medium und 298 mg HEPES in 250 ml destilliertem Wasser. Die Konzentration von HEPES wird 5 mm betragen. Vorsichtig umrühren, bis alle Partikel gelöst sind.
   2. Blase Ames 'Medium bei Raumtemperatur mit Carbogen (95% Sauerstoff, 5% AutoKohlendioxid) für mindestens 5 min. Versorgungs Carbogen mit einer Glaspasteurpipette zu der Lösung. Schließen Sie das Pasteur-Pipette über entsprechende Schlauch an den Ausgang des Gasregler.
   3. Hinzufügen, 475 mg Natrium-Bicarbonat zur Lösung. Die Zugabe von Bikarbonat nach Sprudeln verhindert die Ausfällung von Calciumcarbonat.
2. Bereiten Sie niedrige Geliertemperatur Agarose. Agarose ist erforderlich für die während Vibratom Schnitte von Netzhautgewebe eingebettet ist .
   1. Man löst 180 mg Agarose in 9 ml Ames 'Medium und 1 ml destilliertem Wasser. Verwenden Sie eine Mikrowelle, um langsam die Agarose-Lösung erhitzen, bis sich alle Feststoffe gelöst sind. Hitze in 5-10 sec-Schritten Überlauf zu vermeiden. Lösung sollte klar und transparent sein.
   2. Aufbewahren bei 37 ° C Agarose in einem Wasserbad für die Dauer des Verfahrens gelöst.

2. Einrichten des Vibratom

HINWEIS: Alle Schnitte wurde mit der durchgeführtVibratom in der Werkstoff-Tabelle aufgeführt. Die angegebenen Einstellungen beziehen sich auf diese Art von Vibratom nur. Weitere Einzelheiten zu Vibratom Schnitte von Nervengewebe entnehmen Sie bitte ⁷ zu verweisen.

1. Setzen Sie Vibratom Injektor Klinge in Klingenhalter.
2. Messen Sie vertikale Auslenkung der Klinge mit der "VibroCheck" Gerät. Verwenden, um die Einstellschraube an dem Klingenhalter die Klinge zu kippen, bis es auf der Schnittebene parallel ist. Die genaue Positionierung der Klinge notwendig Jalousieeffekte auf der Schnittfläche zu verhindern und um einen flachen Abschnitt zu erzeugen, die von lebenden Zellen auf seiner Oberfläche enthält.
3. Stellen Sie Vibratom auf die folgenden Einstellungen: Amplitude, 1,00; Geschwindigkeit, 0,20; Dicke, 180-200 & mgr; m.

3. Dissektion der Maus Retina

1. adult C57BL / 6-Maus durch Verdampfung von etwa 1 ml Isofluran in einem luftdichten Behälter anästhesieren. Wenn Anästhesie abgeschlossen ist, einschläfern Tier durch Genickbruch. DasMaus sollte nicht älter als 3 Monate sein, da sonst die Qualität der Scheiben verschlechtern wird.
2. Entfernen Augapfels durch eine gekrümmte Pinzette unter dem Auge platziert. Ziehen Sie das Auge Ball anheben wird den Sehnerv aus. Schneiden Sie den Sehnerv mit einer Feder Schere und übertragen die Augapfels auf eine 35-mm-Petrischale mit 2 ml Ames 'Medium.
3. Führen Sie alle nachfolgenden Schritte auf der Bühne eines Stereomikroskops. Stellen Sie die Vergrößerung auf einen Wert, der eine optimale visuelle Kontrolle der folgenden Verfahren erlaubt (Schritte 3,4-3,9).
4. Durchstechen der Hornhaut am Übergang zu der Sklera mit spitzen Pinzette oder einer 20 G-Nadel. Während dieses Schrittes stabilisieren das Auge Ball mit einer anderen Zange. Achten Sie darauf, nicht auf die Netzhaut mit dem Stechgerät zu beschädigen.
5. Setzen Sie die Feder Schere in das kleine Loch gemacht in Schritt 3.3 und schneiden Sie die Hornhaut einen Kreis um. Auch hier fest mit einer Pinzette die Augapfels während des Schneidens. Halten Sie den Schnitt sehr nahe an der Oberfläche, um nicht zu cut in der Netzhaut.
6. Entfernen Sie vorsichtig Hornhaut, Linse und Glaskörper mit einer Pinzette. Der Glaskörper umfasst nur eine dünne transparente Schicht auf der Rückseite des Auges. Jedoch ist es für Vibratom sectioning dass der Glaskörper vollständig entfernt wird.
7. In der Petrischale, positionieren Sie die Augenmuschel in einer Weise, dass man durch das Loch nach unten schaut auf die Netzhaut. Der Rand der Öffnung sollte nur von Skleragewebe bestehen. Wenn die Kreisschnitt (Schritt 3.4) wurde zu nahe des Okulars zum Äquator durchgeführt wird, wird Netzhautgewebe auch vorhanden Nähe der Einschnitt sein. Seien Sie vorsichtig, dann nicht auf die Netzhaut zu beschädigen in Schritt 3.8.
8. Besorgen Sie sich die Lederhaut mit einer Pinzette vorsichtig in das Gewebe auseinander reißen. Es ist wichtig, nicht die Netzhaut während dieses Schritts zu bersten. Falls erforderlich, entfernen Sie die Netzhaut von der Ora serrata durch den skleralen Teil des Gewebes mit der Zange Verstetigung und sorgfältig auf die Netzhaut mit den anderen Zangen Abziehen. Halten Sie die Zange geschlossen; nie die Wieder Grifftina mit einer Pinzette, da das Gewebe ist sehr weich und wird sofort Platz geben.
   HINWEIS: Bei diesem Schritt wird die Netzhaut und der Rest des Okulars wird erst am Sehnervenkopf angeschlossen werden.
9. Schneiden Sie die Befestigungsstelle am Sehnervenkopf mit den Feder Schere. Die Netzhaut sollte nun frei als ein einziges Stück Gewebe Medium 'in Ames zu schweben.
10. Schneiden Sie die Netzhaut in 4 - 6 kleine Rechtecke von ca. 23 mm mit einer gekrümmten Skalpellklinge mit von der Netzhaut mit der Zange an den Rändern halten, sie in die richtige Position zu manipulieren. Vermeiden Sie das Netzhautgewebe innerhalb der Rechtecke Kneifen. Nehmen Sie Stücke aus den zentralen Teilen der Netzhaut, nicht weit Peripherie.
11. Übertragen retinalen Stücke mit einem großen Durchmesser Kunststoff Pasteurpipette zu einer 35 mm Kunststoff-Petrischale, deren Boden wurde durch ein Gitter mit Gittergröße von weniger als 1 mm ersetzt. Befestigen Sie die Petrischale im oberen Drittel eines Bechers oder Erlenmeyerkolben und versenken retinalen Stücke in Ames 'Medium bubbled mit Carbogen.

4. Einbettung von Retinal Stück in Agarose

1. Sorgfältig übertragen 2 - 3 Retina-Stücke in eine 35 mm Kunststoff-Petrischale zusammen mit einigen der Ames 'Medium. Es ist sehr bequem, einen großen Durchmesser Kunststoff Pasteurpipette für die Übertragung zu verwenden. In diesem Schritt wichtig die genaue Ausrichtung der retinalen Stücke nicht.
2. Entfernen Sie so viel wie möglich von der restlichen Ames 'Medium mit einem Glas Pasteur Pipette. Sobald die Flüssigkeit entfernt wurde, mit dem Schritt 4.3 fort. Sie nicht das Netzhautgewebe trocknen lassen.
3. Unmittelbar bedecken retinalen Stücke mit 2 ml Agarose gelöst (37 ° C). Einsatz der genannten Größe in Schritt 3.10, werden die Stücke nicht in der Agarose einrollen.
4. Innerhalb der flüssigen Agarose, drücken Sie vorsichtig retinalen Stücke auf den Boden der Petrischale. Die Ganglienzellschicht sollte nach unten zeigen . Verwenden Sie ein Stereomikroskop zur Beurteilung der exakten Position. Zur Positionierung Griff retinalen piECES mit einem kleinen Spachtel. Positionieren Sie die Netzhaut so schnell und präzise wie möglich, da die Agarose schnell verfestigt.
   1. Vereinbaren retinalen Stücke auf den Boden der Glasschale parallel; sonst werden Abschnitte tangential oder schräg sein. Einzelne Stücke sollten einander nicht berühren, aber auch nicht zu weit auseinander liegen. Versuchen Sie, retinale Stück mehr oder weniger auf der gleichen horizontalen Ebene platzieren.
5. Setzen Petrischale aus Glas mit eingebetteter retinalen Stücke in den Kühlschrank (4-6 ° C) für mindestens 2 min. Dies wird schnell die Agarose zur weiteren Bearbeitung aushärten. Sobald die Agarose wurde mit dem nächsten Schritt fortzufahren polymerisiert.

5. Montage von Retinal Pieces

1. Entfernen Sie vorsichtig die Agaroseblock retinalen Stücke aus der Petrischale enthält. Verwenden Sie einen Spatel oder eine ähnliche Vorrichtung, die Agarose-Block aus dem Glas zu heben. Durch Adhäsionskräfte, kann dies sehr schwierig erweisen. Vermeiden Sie jedoch das BrechenAgaroseblock. Führen Sie diese und alle folgenden Schritte bei Raumtemperatur.
2. Legen Sie die Agarose-Block auf einem Deckglas und passen Sie seine Größe mit einem Skalpell. Lassen 1 bis 2 mm aus Agarose auf jeder Seite der Netzhautstücken. Die endgültige Größe des Blocks sollte um 1,066 mm (10 mm bezieht sich auf die Höhe des Blocks, 6 mm auf seine Kantenlänge).
3. Kleben die Agarose-Block an den Probenhalter des Vibratom eine Sofortkleber. Retinal Stücke sollten im oberen Bereich der 10 mm hohen Block und parallel zu dessen Oberfläche angeordnet sein, während der Boden an der Halterung befestigt ist.
4. Decken Sie den Block unmittelbar durch die zuvor sprudelte Ames 'Medium in die Pufferwanne des Vibratom Gießen.

6. Herstellung von Horizontal Vibratom Abschnitte

1. Starten Sie sectioning. Zuerst stellen Sie die Dicke des Schneidens manuell bis Fragmente von Netzhautgewebe in der Scheibe erscheinen. Ändern Sie dann auf die Einstellungen in Schritt 2.3. Seit derMaus Netzhaut ist nur etwa 200 & mgr; m dick ist, wird es nicht mehr sein als 2 - 3 Scheiben pro Agaroseblock.
2. Entfernen Sie Abschnitte aus dem Pufferwanne mit einem Glasstab und sie auf 2 ml Ames 'Medium in einer 35 mm Petrischale.
3. Speicherabschnitte unmittelbar in einem Brutschrank bei 37 ° C (5% CO _2/55% O _2). Die Agarose die Abschnitte umgeben wird im Inkubator solide bleiben und verwendet werden können, um die Abschnitte zu behandeln, ohne die Netzhaut schädigen. Bessere Schichtqualität erzielt wird, wenn bei 37 ° C innerhalb der jeweiligen Atmosphäre gegenüber oxygenierten Ames 'Medium bei RT lagern. Abschnitte können sofort verwendet werden oder kann mit einer guten physiologischen Ergebnisse zu 4 Stunden im Inkubator gelagert werden.
4. nächste retinalen Stücke in Agarose und wiederholen Sie den Abschnitten Einbetten 4 - 6.

Ergebnisse

In horizontalen Schichten der Netzhaut der Maus konnte horizontal Zellkörper leicht nach ihrer einzigartigen Morphologie mit mehreren primären Dendriten von einer polygonal Zellenkörper (1A) austretende identifiziert werden. Horizontal Zellkörper in der Nähe der Oberfläche der Scheibe angeordnet wurden routinemäßig zugänglich für Patch-Clamp-Elektroden. Während der Aufnahmen wurden die Zellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff gefüllt, ihre komplizierten dendriti...

Diskussion

Im Gegensatz zu den vertikalen Scheiben wird die dendritische Morphologie von radial ausgerichteten Neuronen wie horizontale Zellen und Amakrinzellen gut erhalten. Im Vergleich zum gesamten Netzhaut Präparate sind diese Zelltypen leicht zugänglich für Mikroelektroden und kann sowohl von elektrophysiologischen und bildgebenden Verfahren untersucht werden. Hier konzentrieren wir uns auf der äußeren Netzhaut; jedoch ein ähnlicher Ansatz wurde insbesondere berichtet für amakrinen Zellen der inneren Retina ^...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ames' Medium	Sigma	A1420
Natriumbicarbonat	Sigma	S5761
Hepes	Sigma	H3375
Carbogen	Air Liquide
Agarose	Sigma	A9045
35 mm Petrischale (Kunststoff)	Nunc Thermofisher	150318
Glas Petri Schale	Chemoline	50-1470-40
Isofluran	Dispensary Universitätsklinikum
Vibratome Injektorklinge	Biosystems	39053250
Vibratome	Leica Microsystems	VT1200
Vibrocheck	Leica Microsystems
Mikrowelle
Wasserbad
Pinzette
20 G Nadeln
Federschere
Gebogene Skalpellklingen
Stereomikroskop
Kunststoff-Pasteur-Pipette
Glas-Pasteur-Pipette