Methodenartikel

Live Cell Imaging und 3D-Analyse von Angiotensin-Rezeptor-Typ 1a Handel Transfizierte humane embryonale Nierenzellen mittels konfokaler Mikroskopie

DOI:

10.3791/55177

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27. März 2017

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1Department of Biochemistry, Georgetown University Medical Center, 2Department of Medicine, Georgetown University Medical Center, 3Department of Physics, Georgetown University Medical Center, 4Department of Oncology, Georgetown University Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir ein Protokoll zu Bild-Zellen, die das grün fluoreszierende Protein-markierten Angiotensin Typ 1a-Rezeptoren während der Endozytose durch Angiotensin-II-Behandlung eingeleitet werden. Diese Technik beinhaltet die Kennzeichnung Lysosomen mit einem zweiten Fluoreszenzmarker, und dann Software die Co-Lokalisierung des Rezeptors und Lysosom in drei Dimensionen über die Zeit zu analysieren, verwendet.

Zusammenfassung

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Bildgebung lebender Zellen wird verwendet , um gleichzeitig Zeitrafferbilder von Angiotensin Typ 1a - Rezeptoren erfassen (AT 1a R) und intrazelluläre Kompartimente in transfizierten humanen embryonalen Nieren-293 (HEK - Zellen) nach Stimulation mit Angiotensin II (Ang II). HEK - Zellen werden transient transfiziert mit Plasmid - DNA AT 1a R enthält , mit Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) markiert. Lysosomen sind mit einem roten Fluoreszenzfarbstoff identifiziert. Live-cell Bilder werden auf einem Laser-Scanning-Mikroskop nach dem konfokalen Ang II Stimulation erfasst und analysiert durch Software in drei Dimensionen (3D, Voxel) über die Zeit. Bildgebung lebender Zellen ermöglicht Untersuchungen zur Rezeptor-und vermeidet verwechselt mit Fixierung verbunden sind, und insbesondere der Verlust oder artifizielle Verschiebung von EGFP-markierten Membranrezeptoren. Somit ist, wie einzelne Zellen über die Zeit verfolgt werden, kann die subzelluläre Lokalisierung von Rezeptoren abgebildet und gemessen werden. Die Bilder müssen sufficientl erworben werdeny schnell schnellen Vesikel Bewegung zu erfassen. Doch bei schnelleren Belichtungsgeschwindigkeit wird die Anzahl der Photonen gesammelt reduziert. Kompromisse müssen auch bei der Auswahl der Abbildungsparameter wie Voxelgröße um Abbildungs ​​erfolgen Geschwindigkeit zu gewinnen. Bedeutende Anwendungen von Live-Cell-Imaging sind Proteintransport zu untersuchen, Migration, Proliferation, Zellzyklus, Apoptose, Autophagie und Protein-Protein-Wechselwirkung und Dynamik, um nur einige zu nennen.

Einleitung

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Das Gesamtziel ist mit einem Rezeptor-Agonisten mit spezifischen subzellulären Organellen nach der Behandlung quantitative Nachweis in Zeit und Raum von Rezeptor Kolokalisation zu erhalten. Hier ist also das unmittelbare Ziel ist Zeitraffer konfokale Bilder von Lysosomen und ein Transmembranrezeptor in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK) nach der Transfektion und anschließend zusammenstellen und analysieren, um die Bilddaten in 3D zu erfassen, um quantitativ die Lieferung von Rezeptor messen Lysosomen. Die Untersuchung der gleichzeitigen Handel eines Transmembranrezeptor mit Lysosomen oder anderen Organellen während der Endozytose, wenn sie von Rezeptor-Ligand aktiviert kann helfen, festzustellen, wie die Transmembranrezeptor unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen reguliert wird.

AT 1a R wird angenommen , daß in Modellzellen - Systeme mit Ang II in Lysosomen nach der Behandlung abgebaut zu werden, in erster Linie HEK293 1 , obwohl die Mehrheit der receptors sind in multivesikulären Recycling Endosomen zur späteren Rückführung in die Plasmamembran , während die Masse des Liganden Ang II hauptsächlich lokalisiert, im Lysosom abgebaut wird 2, 3, 4, 5. In jüngerer Zeit, Li et al. mit Förster - Resonanzenergietransfer (FRET) und Fluorescence Lifetime Imaging - Mikroskopie (FLIM) Techniken gezeigt , dass AT 1a R kolokalisiert (auf ~ 10 nm - Skala) mit LAMP1, Protein eine lysosomale Membran darauf hindeutet , dass zumindest ein Teil des Rezeptors gerichtet ist und abgebaut von Lysosomen 6. Diese Autoren stellten fest , dass der lysosomalen Inhibitor Chloroquin AT 1a R-LAMP1 Assoziation blockiert , die mit früheren Berichten konsistent ist darauf hindeutet , dass eine Wirkung von Chloroquin ist die Fusion von späten Endosomen oder Autophagosomen mit Lysosomen zu blockieren. Andere indirekte Ansätze AT 1a R l zu bestimmen ,ocalization in Lysosomen wurden verwendet Bafilomycin, einen lysosomalen Inhibitor AT 1a R Anwesenheit in Lysosomen 3, 4, 5, 6, 7, 8 zu schließen.

Bildgebung lebender Zellen vermeidet mögliche Auswirkungen der Fixierung auf das Zellvolumen und Verlust / Dimmen / Umverteilung von GFP-chimären Rezeptors. Frühere Studien haben auf fixierten Zellen verlassen Kolokalisation oder Co-Auftreten des Rezeptors mit Lysosomen oder unter Verwendung von lebenden Zellen mit Rezeptorbindungs Surrogate wie β-Arrestin - 1, 2, 3, 4, 5, 6 markiert zu bestimmen. Abbildung lebender Zellen von anderen GPCRs mit Kreiselscheibenapplikators konfokalen oder Laserpunktabtastung confOcal Mikroskope mit GaAsP oder HYD Detektoren aktiviert Ermittler die Internalisierung und den Handel von Rezeptoren in einzelnen Zellen in z-Stacks bei 30 s Intervallen 9, 10 abgebildet zu beobachten. Jedoch selbst wenn Lebendzell z-Stapel schnell gesammelt werden, die Analyse nur innerhalb jedes Stapels nach der Auswahl einer einzigen Ebene auftritt, dh in 2D 10. Während dies für die Untersuchung der internalisierten GPCR oder Tyrosin - Kinase - Rezeptor in Frage ausreichend sein, akkumuliert die AT 1a Rs in Vesikeln , die Größe und die Position mit der Zeit ändern und somit von Natur aus schwieriger zu ausreichend zu jedem Zeitpunkt unter Verwendung eines repräsentativen Einzelschicht abzutasten. Um gründlich die Strecke von der AT 1a R durch die Zelle markiert bestimmen und jede Subpopulation von Vesikeln in Größe und Position unterschiedlich zu erkennen, haben wir ein Verfahren zur 3D - Bildgebung und 3D - Analyse entwickelt , um diese Änderungen zu verfolgen und zu sein in Verbindung mit der Kennzeichnung von verschiedenen intrazellulären Kompartimenten, wie beispielsweise Lysosomen verwendet.

Die Ermittler können dieses Protokoll für Live-Cell - Imaging verwenden , um direkt die Bewegung der AT 1a R in die Zelle und ihre Übertragung auf subzellulärer Kompartimente folgende Ang II Stimulation zu visualisieren. Subzellulärer Kompartimente sind mit fluoreszierenden Protein-Chimären oder anderen fluoreszierenden Markern markiert. Dieses Protokoll kann auch als ein erster Ansatz verwendet werden Rezeptoren in subzellulären Organellen mit einer Auflösung von mindestens 200 nm, um zu lokalisieren, im Vergleich zu Wildtyp-Rezeptoren mutiert zu vergleichen oder Veränderungen nach pharmakologischen Behandlungen zu erkennen. Die Technik ist zugänglich, da es für die Bildgebung lebender Zellen ausgestattet auf jedem konfokalen Mikroskop durchgeführt werden kann. Die relative Leichtigkeit dieses Ansatzes im Gegensatz zu ihr Fachwissen und Ausrüstung zur Durchführung von FRET / FLIM / BRET Techniken benötigt , die 6 molekularen Wechselwirkungen erkennen,"xref"> 11. Diese Messungen definieren Protein-Protein-Wechselwirkungen mit hoher Auflösung (~ 10 nm) und Lokalisierung innerhalb subzellulärer Organellen geschlossen wird. Diese fortgeschrittenen Techniken werden verwendet , um zu verfolgen und weiter zu definieren molekularen Wechselwirkungen von Interesse, anstatt die Passage von Rezeptoren durch subzellulärer Kompartimente, und sie direkt von Protein-Protein - Interaktionen zu bestimmten Zeiten und Orte innerhalb der Zelle 11 zu demonstrieren. FLIM, eine FRET-Technik unabhängig von Akzeptorkonzentration, wird am häufigsten auf festen Proben durchgeführt, da die Bildaufnahme ist langsamer. Im Gegensatz dazu stellt Verhältnis FRET schnelle Bildgebung und hoher Auflösung Kolokalisation von interagierenden Proteinen. Der Nachteil Verhältnis FRET ist , dass Bildgebung Weitfeld- Epi-Fluoreszenz nutzt Bildgebungsgeschwindigkeit zu gewinnen und die gesamte Zelle zu schließen, was zu einer geringeren Auflösung und Kontrast von Organellen 12. Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET) ist ein weitererfortgeschrittene Technik, die GPCRs angewendet wurde 11 die Erfassung molekularer Nähe über der Zeit zu messen. Bei dieser Technik ist ein Protein Fluorophor molekular geteilt und jede Hälfte auf einen von zwei Proteine ​​in Frage verknüpft. Wenn die beiden Proteine ​​von Interesse binden einander die Teile des chimären Tag wieder zusammenbauen Fluoreszenz und die erhöhte Fluoreszenz über die Zeit quantifiziert zu erwerben.

Hier präsentieren wir eine einfache Technik für Live-Cell - Imaging in Verbindung mit Bild Quantifizierung Handel von AT 1a R zu studieren in der Zelle auf Ang II Stimulation und der möglichen Änderung der Lieferung von internalisierten AT 1a R zu Lysosomen folgende Ang II - Stimulation. Die ultimative Anwendung für diese Technik ist es, Unterschiede in der Membranhandel Vergleich Wildtyp zu charakterisieren und mutierten Rezeptoren. Diese Unterschiede werden dazu beitragen , den Mechanismus (n) , die Auswirkungen physiologischen Aktivitäten von AT 1a R leadi zu identifizierenng der Regulierung des Blutdrucks.

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Protokoll

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Tag eins

1. Zell Seeding

  1. Bereiten vollständige Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM). 50 ml fötalem Rinderserum, 5 ml Penicillin / Streptomycin, 5 ml L-Glutamin zu 450 ml DMEM 500 ml komplettem DMEM mit fötalem Rinderserum (10%), Penicillin / Streptomycin (1%) ergänzt, um und L-Glutamin (1%).
  2. Seed menschliche embryonale Niere (HEK-Zellen), Passage-Nummer 6-11 bei 50.000 / Vertiefung in einem 8 gut chambered Abdeckglas System in komplettem DMEM.
  3. Aufrechterhaltung der gekammert slide bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für 24 h.

Tag zwei

2. Liposome Transfection

  1. Machen Frisch AT 1a R-GFP - Plasmid und Liposom - Lösungen unter Verwendung von sterilen Bedingungen mit einem Biosicherheitsstufe 2 Schrank.
  2. Verdünnen Sie 2 ul von Plasmid-DNA bei 900 ng / ul Stammlösung in 178 & mgr; l reduziert Serum Medien ein Konzentrat zu erreichenIonen von Plasmid-DNA von etwa 10 ng / & mgr; l.
  3. Verdünnen Sie 4,5 ul Liposomenstammlösung in 175,5 ul reduziert Serum Medien eine Verdünnung von 1:40 der Aktie zu schaffen.
  4. Fügen Sie die Liposomen-Lösung für das Plasmid-Lösung und mischen durch eine 1 ml-Pipette mit pipettiert nach oben und unten 20-mal die Transfektion Lösung zu mischen.
  5. Inkubieren der Mischung für 30 min bei Raumtemperatur (25-27 ° C).
  6. Während diese Mischung inkubiert wird, entfernen das Medium langsam mit einer 1 ml Pipette und langsam 400 ul 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hinzufügen, die auf 37 ° C vorgewärmt ist.
  7. Sie vorsichtig die PBS mit 200 & mgr; l / Vertiefung reduziert Serum Medien vorgewärmt auf 37 ° C zu entfernen und zu ersetzen.
    HINWEIS: bei allen Schritten Vorsicht beim Waschen der Zellen Ablösung von Zellen aus dem Deckglas aufgrund durch Pipettieren induzierte Scherbeanspruchung zu vermeiden.
  8. Pflegen der Zellen bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für 30 min.
  9. Sobald derInkubationszeit beendet ist, fügen 80 ul Transfektionsgemisch in jede Vertiefung und Inkubieren der Zellen für 4,0-4,5 h , aber nicht mehr als 5 h bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2.
  10. Nach der Transfektion Inkubationszeit abgeschlossen ist, entfernen Sie langsam den Medien aus den Kammern eine 1 ml - Pipette verwenden und vorsichtig mit 300 & mgr; l / Vertiefung von kompletten DMEM und inkubieren Zellen für 24 h bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 ersetzen .

Tag drei

3. Serumaushungerung

  1. Entfernen Sie die Medien vorsichtig mit einem 1 ml-Pipette verwenden und langsam ersetzen mit 300 & mgr; l Serum-freiem DMEM ohne Phenol rot.
  2. Aufrechterhaltung der Kammer bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für 10-12 h.

Vierter Tag

4. Live Cell Imaging

  1. Stain intrazellulären Kompartimenten (Lysosomen in diesem Fall).
    1. About 30 min vor Lysosomen in Zellen zu Abbilden, fügen 22,5 & mgr; l von einer 1 uM fluoreszierender Farbstoff-Vorratslösung (0,5 & mgr; l von 1 mM Fluoreszenzfarbstoff in 499,5 & mgr; l serumfreiem DMEM verdünnt ohne Phenolrot) in jede Vertiefung für eine endgültige Farbstoffkonzentration von 75 nM.
    2. Inkubieren für 25-30 Minuten bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 und dann den Farbstoff sanft entfernen und langsam 300 & mgr; l frisches serumfreies DMEM ohne Phenolrot hinzufügen.
  2. Bereiten Sie das Mikroskop für die Bildgebung.
    1. Stellen Sie die Bühne, um Schäden an der Linse bei der Inbetriebnahme eines automatisierten Mikroskop zu vermeiden.
    2. Schalten Sie das Mikroskop Leistung, Scanner Leistung, Laserleistung und dann Laseremission und schließlich die Metallhalogenlampe für die visuelle Beobachtung (siehe Konfokalmikroskop Anweisungen des Herstellers).
    3. Öffnen Sie die Imaging-Software-Programm und in der Software wiederum auf dem Argon (488 nm) Laser und Leistung von bis zu 30-50%. Beachten Sie die Leistung hängt davon ab,Alter des Lasers. In Experimenten ist es entscheidend, konstante Einstellungen beizubehalten.
    4. Schalten Sie rot emittierenden Laser (zB 568 nm oder 594 nm).
    5. Set Imaging-Format auf 12-Bit-Tiefe.
    6. Stellen Sie die Pinhole für die Argonlaserlinie 488 nm und für die 568 nm oder 594 nm Laser auf 1 Airy Platteneinheit. Wenn die GFP sehr schwach ist, um eine Einstellung von 2 Airy Platteneinheiten verwenden, aber die Kanäle entsprechend anzupassen.
    7. Wenn dichroitische Filtersätze verwenden, wählen Sie die entsprechenden Emissionswellenlängen für GFP und dem Fluoreszenzfarbstoff. Oder stellen Sie die Emissionswellenlänge (Em) bei 499-580 nm für GFP und Em 599-680 nm für die rot-emittierenden Fluoreszenzfarbstoff.
    8. Überprüfen Sie, ob bluten durch und Crossover treten nicht auf. Drehen Sie jeden Laser wiederum aus und prüfen Sie beide Emissionskanäle für jeden. Wenn die Argon-Laser ausgeschaltet ist, sollte die grüne Emission Null sein. Wenn die grün emittierenden Laser ausgeschaltet ist, sollte die rote Emissionskanal Null sein.
      HINWEIS: Die sicherste Methode ist zu Bild jeweils in getrennten Spuren (sequential).
    9. wenn gewünscht Fügen Sie ein Hell- Kanal. Vermeiden Differentialkontrastbildgebung (DIC), weil es Kolokalisierung Messungen verzerren können.
    10. Für die Live-Darstellung, wählen Sie zeilensequenziellen anstatt Frame-Sequential.
  3. Markieren Sie die Zellen für die Bildgebung.
    1. Nutzen Sie eine 1,4 numerische Apertur (NA) Ziel, wie ein 63X / 1.4 NA Öl-Objektiv zur Bildzellen (oder 40X / 1.4 NA). das Ziel-Center und einen Tropfen mit hoher Viskosität, geringe Autofluoreszenz Sionsöl auf das Ziel hinzuzufügen.
    2. Übertragen, um die Kammer mit den transfizierten Zellen aus dem Inkubator auf die Bühne des Mikroskops. Achten Sie darauf, die Folien flach zu halten und sicherzustellen, dass die Kammer fest sitzt und aus der Bewegung zurückgehalten.
    3. Bewegen Sie das Ziel, bis der Tropfen Öl nur den unteren Rand der Folie berührt; die richtige Brennebene in der Nähe dieser Position. Bei der automatischen Mikroskope, speichern Sie diese Position sowie die abgesenkte Position für die rem verwendenainder des Abbildungsexperiment zu erleichtern Proben verändert.
    4. Wählen Sie dim Zellen. Die Zellen AT 1a R-GFP überexprimierenden den Rezeptor in der Zelle misdirect und die normale Funktion stören.
    5. Bestätigen, dass der Umriss der Zelle durch die Plasmamembran definiert ist, ist sichtbar und vorzugsweise nicht mit anderen Zellen überlappen.
    6. Fokus und die Zelle im Sichtfeld zentriert.
    7. Wechseln Sie in den konfokalen Modus.
    8. Wählen Sie eine schnelle Bildgebungsmodus. Mit einer Hand auf der Fokussteuerung und die andere auf der XY-Steuerstufe, konzentrieren und die Zelle von Interesse auf dem Monitor sichtbar gemacht zentrieren.
    9. Bestätigen Sie, dass die Zelle von Interesse ist gut verteilt und seinem Boden oder Bauchseite eng mit dem Deckglas nebeneinander durch die Konzentration auf und ab durch die Zelle.
  4. Stellen Sie die z-Stufe Parameter Bild eine Zelle in 3D.
    1. Markieren Sie die Taste für den Z-Stapel oben und unten Dialog (oder gleichwertig) und konzentrieren sich auf den Boden der cell und drücken Sie "beginnen". Dann konzentrieren sich auf die Oberseite der Zelle und drücken Sie "Ende". Nachprüfen, daß die gesamte Zelle wird in der z-Stapel enthalten sind.
    2. Stellen Sie die Z-Schrittweite bis 1,0 um.
  5. Stellen Sie Imaging - Einstellungen.
    1. Wählen Zoom 2, in Abhängigkeit von der Linse, so dass die endgültige Pixelgröße etwa 0,279 & mgr; m x 0,279 um bis 0,14 um x 0,14 um in der XY-Dimension.
    2. Für HEK-Zellen in diesem Experiment, Scan-Geschwindigkeit auf etwa 1 & mgr; s pro Voxel gesetzt und wählen Sie 2 Lungs oder 2 Ansammlungen von Linie, je nach Helligkeit der Zellen.
    3. Passen Laserintensität und gewinnen für die Abbildung GFP und den Fluoreszenzfarbstoff. Im Allgemeinen wird Gegenfärbemittel viel heller und somit Photomultiplier-Detektor (PMT) und nicht Galliumarsenidphosphid (GaAsP) oder Hybrid-Detektoren (HYD) sollte für diesen zweiten Farbkanal genutzt werden, während Keuchen und Hyd Detektoren für den GFP-Kanal erforderlich sind. Wenn die hy oder GaAsP erkennenors werden für den Fluoreszenzfarbstoff, üben Vorsicht und beginnen mit dem Laser, der bei einer extrem niedrigen Leistung.
    4. Legen Sie Dauer - Scan und die Häufigkeit der Abtastung, beispielsweise alle 30 bis 60 s über 25 Minuten oder länger zu sehen von AT Targeting 1a R-GFP zu Lysosomen.
    5. Stellen Sie den Autofokus Fokusebene Stabilität im Laufe der Zeit zu halten.
  6. Beginnen Sie mit der Imaging - Experiment.
    1. Bereiten Sie im Voraus 100x Ang II Lager bei 5 ug / ul (4,7793 mM) und fügen 2,1 ul dieser zu 998 & mgr; l Medium (10 & mgr; M).
    2. Beginnen Ligandenstimulation durch die Zugabe von 3 ul einer 100x-Stammlösung des Liganden (Ang II) an die Vertiefung mit 300 & mgr; l unmittelbar vor der Bildgebung (Endkonzentration 100 nM).
    3. Klicken Sie auf Start und Bild in 3D für die gewünschte Zeit und Frequenz.
    4. Vor der Arbeit am Mikroskop Finishing, sammeln, um eine Z-Stapel für die spätere Verwendung in Untergrundsubtraktion während der Analyse. In Photonenzählung Modus ist dies nichtnotwendig, da der Hintergrund gedreht wesentlichen 0. Mit Beleuchtung eingeschaltet ist und alle weiteren Abbildungsbedingungen die gleichen sind, aber ohne Probe ein Probenbild aufzunehmen. Siehe Untergrundsubtraktion (unten) unter Analyse.

Fünfter Tag

5. Bildanalyse

  1. Export Bilder im TIFF - Format.
    1. Rechtsklick auf die Bilddateinamen Menüs zu sehen, und wählen Sie Exportieren oder klicken Sie auf Datei | Export | einführen.
    2. Export zu tiff für nachfolgende Analysen sicherstellen, dass die RAW, 12-Bit-Daten zu exportieren [nicht die "Rot Blau Grün '(RGB) Umwandlung zur Veröffentlichung hochwertige Bilder verwendet]. Sie nicht auf JPEG-Format exportieren.
    3. Beachten Sie die X, Y, Z Voxel Abmessungen und die z-Schrittgröße für die spätere Verwendung während Bildanalyse. Zum Beispiel mit einem 40x / 1.4. NA Objektiv diese Werte könnten 0.138 & mgr; m x 0,138 & mgr; m mit 1 & mgr; m z-Schrittgröße (siehe Daten in den repräsentativen Ergebnissen Abschnitt) sein.
  2. .
    1. Bild öffnen Quantifizierungssoftware (Abbildung 2)
    2. Verwenden Sie "Aktion | Neu erstellen | Bilder von ausgewählten Sequenz" eine einzelne Datei Bild aus importierten Einzelsequenzen zu erzeugen (Abbildung 2, Pfeil # 1).
    3. Geben die Anzahl der Kanäle, die Anzahl der z-Bereichen, und die Anzahl der Zeitpunkte.
    4. In Abhängigkeit von der Struktur der * TIFF-Dateien, auswählen, beispielsweise Kanäle, z-Ebene und die Zeitpunkte der Reihenfolge der Bildebenen. Überprüfen Sie, ob die endgültige Bildstapel richtig die Farbkanäle darstellt, Z-Stapel und Zeitpunkte des Originalbildes.
    5. Wählen Sie den Bildnamen (Abbildung 2, markierte Dateiname auf der linken Seite, Pfeil # 2). Rechtsklick auf das Bild und / oder das Bildfeld und aus den Optionen am unteren Ende der Liste wählen Sie "Eigenschaften". In der um Pixel für (X) (Y) und (Z) Größe, geben Sie die richtige Bildeigenschaften oben erwähnt.
  3. Subtrahieren Hintergrund vor der Bildanalyse. Hintergrundkorrektur kann in jeder Bildanalyse - Software durchgeführt werden. Subtrahieren Hintergrund eine von zwei Optionen.
    1. Option 1: Wählen Sie "Aktion | Neu erstellen | Untergrundsubtraktion" (Abbildung 2, Pfeil # 1). Verwenden Sie die erworbenen Hintergrundbild am Ende der Imaging-Sitzung erhalten oben beschrieben als "Dark Reference" Bild unter "Extras | Hintergrund subtrahieren".
    2. Option 2: Überprüfen Sie die dunkelsten Bereiche in den Bildern, wo es keine Probe vorhanden ist, finden die mittlere oder maximale Helligkeit von Pixel in diesem Bereich, keine ungewöhnlich helle Pixel zu ignorieren, die unechte Fluorophor sein könnte, ein zufällig helles Pixel oder ein anderes Phänomen. Wählen Sie "Aktionen | Neu erstellen | Untergrundsubtraktion". Verwenden Sie diese Pixelhelligkeit (negativ gemacht) als Offset.
  4. Überprüfen Sie, ob die Farbregistrierung und ggf. korrigieren.
    1. eine positive Kontrolle wie abgebildet Mikrokügelchen, oder, colocalized GFP-enthaltenden Vesikeln und Fluoreszenzfarbstoff (Abbildung 3) zur Korrektur der Bewertung der Notwendigkeit von entweder den roten oder grünen Farbkanal Aus- und Einschalten. Optisch wenn die Registrierung von sogar 1 Pixel aus ist, ist es für das Auge sichtbar.
    2. Generieren Sie eine Registrierung Korrektur durch die Auswahl von "Aktionen | Neu erstellen | Registrierung Correction" (Abbildung 2, Pfeil # 1) und verwenden Sie das Dialogfeld Einstellungen vornehmen können . Nach Abschluss erscheint ein neuer Ordner Punkt "Registration-Korrektur" berechtigt.
    3. Tragen Sie die Anmeldung an einen oder mehrere der Bilder von Interesse durch den Bildnamen klicken (Abbildung 2, markierte Dateiname auf der linken Seite, Pfeil # 2) und dann "Extras | korrekte Registrierung" (Tool - Taste neben Actions).
  5. Erstellen Messsequenz AT 1a R-GFP - Vesikel und ganze Zelle Intensität zu analysieren folgendeBehandlung mit Ang II.
    1. Wählen Sie ein Bild (Abbildung 2, hervorgehoben Dateinamen auf der linken Seite, Pfeil # 2) und eine Region of Interest (ROI) ziehen um eine einzelne Zelle , die Freestyle - Region - Werkzeug (Abbildung 2, Pfeil # 3). Verwenden Sie den erweiterten Fokusmodus (2D, Drop-Down-Menü in der oberen linken), um die Zelle zu beobachten, wie das Zuschneiden Werkzeug nur in 2D-Visualisierung arbeitet.
    2. Rechtsklick auf das Bild und wählen "Auf Auswahl zuschneiden" und ein neues Bild Element erzeugt wird.
    3. Wählen Sie die beschnittene Zelle , indem Sie auf den Namen klicken und wählen Sie dann die "Messung" Tab oben (Abbildung 2, Pfeil # 4).
    4. Zur Definition und internalisiert Vesikel für GFP messen, ziehen "Find Objects" unter "Suchen" (Abbildung 2, Pfeil # 5) in Folge Feld (Abbildung 2, Pfeil # 6).
    5. Set "Find Objects" Kanal auf dem GFP-Kanal.
    6. Einstellungen öffnen (Rad-Symbol im Dialogfeld, Pfeil # 6) und setzen4; Ansprechschwelle: "SD und" untere Grenze "bis 6. Set" Minimale Objektgröße "auf 0 & mgr; m 3.
      HINWEIS: Die SD-Untergrenze für einzelne Experimente ab. Visuelle Bestätigung , dass die richtigen Objekte gethresholdeten durch Untersuchen verschiedenen Zeitpunkten (2, Pfeil # 7) hergestellt ist. Die "Mess | Feedbackoptionen" Dialogfeld wird verwendet , um die Art und Weise zu wählen , die schwellen Objekte ausgewählt werden visualisiert (Abbildung 2, Pfeil # 8).
    7. Klicken Sie auf "Messen" in "Suchen von Objekten" Dialogfeld (Abbildung 2 Pfeil # 6) und wählen Sie die Kanäle und die Art der Messungen. Normalerweise wählen Sie "Alle Kanäle" und "Intensität und Volumenmessungen".
    8. Um die Schwellwertbildung und Filter zur Identifikation der gesamten Zelle definieren und die Gesamt GFP Intensität zu messen, wiederholen Sie die obigen Schritte (5.5.4 - 5.5.8) mit den folgenden Parametern: SD 0 und "Mindestobjektgröße" bis 2 μ; m 3 in der zweiten "Find Objects" Dialogfeld Zellen mit GFP (Abbildung 2, Pfeil # 9) zu identifizieren
    9. Ziehen "Filter Bevölkerung" unter "Filter" , um die Sequenz - Box unter Population 2 (die zweite "Find Objects" Feld, Bild 2, Pfeil # 9). Wählen Sie "Volume (um 3> 100).
    10. Optisch sicherzustellen, dass nur ein Objekt identifiziert wird. Die gesamte Zelle sollte Schwellwertbildung und alle anderen Objekte weggefiltert werden. Der "Filter" Parameter (n) muss möglicherweise angepasst werden, wenn die Zelle klein ist, zum Beispiel.
    11. Nachdem die Messung standardisiert wurde, speichern Sie das Protokoll, das von rechts auf das Bild klicken, und wählen Sie "Protokoll speichern", um wieder zu verwenden ( "Restore-Protokoll"). Das Protokoll kann auch eine Aufzeichnung im gleichen Unterverzeichnis wie das Bild zur Verfügung zu stellen exportiert werden.
    12. Fahren Sie mit "Make Measurement" durch Auswahl von "Messungen | Make Mess Item" (Abbildung 2 , Pfeil # 8) oder rechts das Bild klicken und mit "Make Measurement" und "allen Zeitpunkten".
    13. Geben Sie den richtigen Messnamen (kopieren und einfügen aus dem Bild ist praktisch) und Analyse-Code oder Datum (eine hilfreiche Ergänzung für die Aufzeichnung) und wählen Sie "allen Zeitpunkten". Ein neues Arbeitsblatt-Eintrag wird unter dem Bild erstellt werden. Halten Sie die Dateinamen prägnant.
  6. Analysieren und die Daten exportieren.
    1. Klicken Sie auf das Arbeitsblatt Dateinamen und wählen Sie die "Analyse" aus. Bestimmen Sie, ob gesättigt Voxel vorhanden sind, indem man zuerst die Auswahl "Beschränken Analyse zu:" wählen Population 2 (die Zelle).
    2. Rechtsklick auf das Feld unter dem "Registerkarte Analysieren" und im Dialogfeld unter "Analysieren dieser Daten:" die Option "Max ([GFP Farbkanal])"; unter "Verdichtete von:" select "Mean ([GFP Farbkanal]", und unter "Organisieren der Daten durch:" und "Row" wählen Sie "Timepoint" und click "OK".
      HINWEIS: Wenn Daten gesättigte Pixel (zB 65536 für 16-Bit oder 4.096 für 12-Bit) enthält, wird die Analyse nicht genau sein (es wird Gehalt unterschätzen Vesikel). Außer Acht lassen, dass die Zellen für die Analyse. Wenn nicht gesättigt ist, mit dem nächsten Schritt fortzufahren.
    3. Als nächstes unter der "Raw" und dann unter "Analyse" klicken und einen Rechtsklick auf die Daten finden "Analyse Einschränken auf:" und wählen Sie dann Population 1 für Vesikel oder Bevölkerung 2 für die gesamte Zelle.
    4. Unter "Analysieren dieser Daten:" wählen Sie "Sum" (GFP Farbkanal); unter "von fasste zusammen:" wählen Sie "Sum"; und unter "Organisieren der Daten durch:" und "Row" wählen Sie "Timepoint" oder "Relative Zeit" und klicken Sie dann auf "OK". Analyse Auswahlen können gespeichert und wiederverwendet werden.
    5. Auswählen und Kopieren / Einfügen direkt von der Bildquantifizierungssoftware auf eine leere Tabelle oder exportieren Sie die Tabellendaten nach rechts, um die dat klickenein und die Auswahl speichern als CSV-Datei. Die ganze Zelle Intensitätsmessung wird mit Messungen der einzelnen Bläschen in der Bevölkerung aufgenommen werden, so sicher sein, es zu identifizieren und getrennt von den Bläschen.
      Hinweis: Nachdem der grafischen Darstellung von Daten, die Zunahme der Fluoreszenz Gesamt GFP in Vesikeln enthalten sind schnell ansteigt. Photobleaching, wenn sie auftritt, wird als Verlust von Gesamtzell GFP Intensität über die Zeit nachgewiesen.
  7. Erstellen Messsequenz GFP in Lysosomen zu analysieren.
    1. In den Find Objects (Population 1), stellen Sie "Find Objects" Kanal auf den roten Kanal und in den Rad - Symbol in der durch den Pfeil # angezeigt Dialogfeld 6 (Abbildung 2) Satz "Threshold mit:" SD und "untere Grenze" zu 6. Stellen Sie "Minimale Objektgröße" bis 0,017 & mgr; m 3.
      HINWEIS: Die SD-Untergrenze für einzelne Experimente ab. Visuelle Bestätigung, dass die richtigen Objekte werden Schwellwertbildung werden, sollten durch Prüfung gemacht werdenining verschiedenen Zeitpunkten. Die "Mess | Feedbackoptionen" Dialogfeld wird verwendet , um die Art und Weise zu wählen , die schwellen Objekte ausgewählt werden visualisiert (Abbildung 2, Pfeil # 8).
    2. Klicken Sie auf "Messen" in "Suchen" Objekte "Dialog (Abbildung 2 Pfeil # 6) und wählen Sie die Kanäle und Arten von Messungen. In der Regel" Alle Kanäle "und" Intensität und Volumenmessungen "ausgewählt.
    3. Für Bevölkerung 2, dass die Verwendung Einstellungen identisch verwendet , um die gesamte transfizierten Zelle exprimiert AT 1a R-GFP (5.5.9) zu identifizieren.
    4. Wenn mehrere Zellen (einschließlich nicht-transfizierten Zellen mit Fluoreszenzfarbstoff-positive Vesikel) vorhanden sind, in der ersten Stufe der Analyse des Zell Beschneiden ist kritisch. Alternativ sollte die Verwendung von "compartmentalize" verwendet werden , Identifizierung von Lysosomen in der transfizierten Zelle zu begrenzen AT 1a R-GFP exprimieren. Lysosomen darf nur innerhalb der GFP Zelle identifiziert werden undnicht aus der Nähe, untransfizierten Zellen.
    5. Analyse und Export wie oben Daten.
      HINWEIS: Ein Beispiel für eine Schwellwertbildung Zellen und Vesikel ist in Abbildung 4 dargestellt.

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Ergebnisse

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In dieser repräsentativen Reihe von Experimenten wurden HEK - Zellen mit Angiotensin - Typ 1a - Rezeptor transfiziert (AT 1a R-GFP) konstruieren (E1,2,3-AT 1a R) in das Plasmid pEGFP-N2 geklont 13. Zeitraffer-Bilder von HEK wurden erworben und spielte als Film (Siehe Live Cell Imaging 1 und Live Cell Imaging 2 Filme). Die Filme und Standbilder zeigen , dass nach Ligand - Stimulation, AT 1a R-EGFPs ...

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Diskussion

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Vorversuche hier vorgestellten zeigt , dass über einen ziemlich kurzen zeitlichen Verlauf von 24 min, keine nennenswerte Veränderung der Lieferung von AT 1a R-GFP zu den Lysosomen aufgetreten. Im allgemeinen Lieferung von internalisierten Rezeptoren Lysosomen könnte bereits 15-20 Minuten auftreten. Dieses Experiment ist in Einklang mit der Hypothese , dass der Großteil der AT R 1a internalisierte zu groß, perinukleären Endosomen ausgerichtet ist. Hinweise darauf , dass zumindest einige AT 1a

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

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Die Forschungsarbeiten in diesem Manuskript präsentiert wurde von Grant R01 HL121456-01A1 Kathryn Sandberg unterstützt. Diese Arbeit wurde zusätzlich durch die Verfügbarkeit eines Leica SP8 AOBS in der Mikroskopie und Imaging Shared Resource (MISR) an der Georgetown University Medical Center unterstützt, die zum Teil von P30-CA051008 von den National Institutes of Health der Vereinigten Staaten von Amerika finanziert wird. Wir danken SP8 Imaging-Unterstützung Leica von Peter Johnson, und die Verwendung des Zeiss LSM880 im Labor von Thomas Coate, Institut für Biologie an der Georgetown University mit Hilfe Bildgebung durch Alma Arnold von Carl Zeiss Mikroskopie LLC zur Verfügung gestellt. Der Inhalt in diesem Manuskript ist allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Position der National Institutes of Health vertreten.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Angiotensin II (Ang II)Sigma-AldrichA9525 
Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x)Gibco -ThermoFisher Scientific11960-044Warm in 37 > C Wasserbad vor dem Gebrauch 
Fötales Rinderserum (FBS)Sigma-AldrichF2442Warm in 37 °; C Wasserbad vor Gebrauch
Penicillin Streptomycin (Pen Streptomycin)Gibco -ThermoFisher Scientific15140-122Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch
L-Glutamin 200 mM (100x)Gibco (life technologies)25030-081Warm in 37 &Grad; C Wasserbad vor dem Gebrauch
Menschliche embryonale Niere (HEK)-293 ZellenAmerican Type Culture Collection (ATCC)  CRL-1573Passage Nummer 5 - 12
Nunc Lab-Tek II gekammert 1,5 Deutsches DeckglassystemSigma-Aldrich155409
Lipofectamine 2000 TransfektionsreagenzThermoFisher Scientific11668019Bei 4 > C 
Opti-MEM, reduziertes SerummediumGibco- ThermoFisher Scientific31985-070Warm in 37 °; C Wasserbad vor Gebrauch
PBS 10x Fisher BioReagentsBP3994Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch
Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x)  Gibco -ThermoFisher Scientific31053-028Warm in 37°; C Wasserbad vor Gebrauch
LysoTracker Rot DND-99Molekularsonden -ThermoFisher ScientificL7528Aliquote dunkel bei -20 & Grad lagern; C . 
Volocity Ver. 6.3 BildanalysesoftwarePerkinElmerVisualisierungs- und QuantifizierungsmoduleFür die 3D-Bildanalyse von Bildstapeln
Leica SP8 AOBSLeica MicrosystemsKonfokales Laserscanning-MikroskopFür die Bilderfassung
Zeiss LSM 880Carl Zeisskonfokales Laserscanning-MikroskopFür die Bildaufnahme

Referenzen

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Schlagwörter

Angiotensin Rezeptor TraffickingHEK 293 ZellenGFP markierte RezeptorenLysosomen Kolokalisation3D BildanalyseZeitraffer ImagingRezeptor InternalisierungFluoreszenzmikroskopie

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