Hier werden optimierte Methoden zur Generierung von in vivo und in vitro Modellen der hepatischen Steatose und zur Analyse der steatotischen Phänotypen und der damit verbundenen physiologischen Parameter beschrieben.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Etablierung eines Systems von Verfahren zur qualitativen und quantitativen Charakterisierung der in vivo und in vitro Lebersteatose ist wichtig für die metabolische Untersuchung in der Leber. Hier werden zahlreiche Assays beschrieben, um den Phänotyp und die Parameter der Lebersteatose in Maus- und Hepatozytenmodellen umfassend zu messen.
Durch die Kombination der physiologischen, histologischen und biochemischen Methoden kann dieses System verwendet werden, um den Fortschritt der Lebersteatose zu beurteilen. In vivo ermöglichen die Messungen des Körpergewichts und der Kernspinresonanz (NMR) ein allgemeines Verständnis von Mäusen auf nicht-invasive Weise. Hämatoxylin- und Eosin- (H&E) und Ölrot-O-Färbungen bestimmen die histologische Morphologie und Lipidablagerung von Lebergewebe unter Nährstoffüberlastungsbedingungen, wie z. B. bei fettreicher Fütterung. Anschließend werden die Gesamtlipidgehalte durch Chloroform/Methanol-Extraktion isoliert, gefolgt von einer biochemischen Analyse auf Triglyceride und Cholesterin. Darüber hinaus werden primäre Maus-Hepatozyten mit hohem Glukosegehalt plus Insulin behandelt, um die Lipidakkumulation zu stimulieren, ein effizientes In-vitro-Modell zur Nachahmung von ernährungsinduzierter Hyperglykämie und Hyperinsulinämie in vivo. Anschließend wird die Lipidabscheidung durch Ölrot-O-Färbung und Chloroform/Methanol-Extraktion gemessen. Die Oil Red O-Färbung bestimmt intuitive hepatische steatotische Phänotypen, während die Lipidextraktionsanalyse die Parameter bestimmt, die statistisch analysiert werden können. Die vorliegenden Protokolle sind für Wissenschaftler auf dem Gebiet der Fettlebererkrankungen, der Insulinresistenz und des Typ-2-Diabetes von Interesse.
Einleitung
Adipositas ist eine wachsende Gesundheitsproblem in den entwickelten und den Entwicklungsländern. Es wurde eines der koexistierenden Bedingungen 1 häufig mit nicht - alkoholische Fettleber (NASH), mit einer Prävalenz im Bereich zwischen 30 und 100 Prozent in NASH Patienten in Verbindung gebracht werden berichtet. Aufgrund der starken Korrelation zwischen Fettleber und Fettsucht, Diät-induzierte fettleibig (DIO) Mausmodelle werden häufig zur Untersuchung der komplexen molekularen Mechanismen im Zusammenhang mit der Entwicklung von NAFLD 2, 3, 4, 5, 6 verwendet. Hepatosteatose ist das früheste Stadium von NAFLD, und es kann zu nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH), Zirrhose fortschreiten und schließlich Leberkrebs 7. Daher ist das allgemeine Ziel dieser Methode Tier- und Zellmodellen der hepatischen steatotic Bedingungen zu erzeugen und zu provide detaillierte Protokolle für die effiziente und genaue Lipidmessung. Diese Modelle und Messungen sind auch geeignet für die Untersuchung von anderen Stoffwechselstörungen, wie Insulinresistenz und Typ-2-Diabetes.
Da Fettleibigkeit identifiziert wird einer der wichtigsten Risikofaktoren für NAFLD, eine fettreiche, High-Saccharose-Diät (HFHS), die den Western-Stil hohen Fett-Diät imitiert sein wird verwendet, Fettleibigkeit bei Mäusen zu induzieren. Anschließend kann der Grad der Lebersteatose verschiedenen Methoden beurteilt werden. Erstens, Körpergewicht und Körperzusammensetzungsanalyse mit Kernspinresonanz (NMR) zeigen die Lipidakkumulation während der Fütterung. Die Fettmasse und Muskelmasse in einem nicht-invasiv und in Echtzeit Weise quantifiziert werden.
Zusätzlich wird die Kernspintomographie (MRI) verwendet, um sowohl die Ganzkörper und die Leber Fettverteilung zu zeigen. Das Graustufensignal des MRI-Analyse kann in einem lesbaren Pseudofarbbild umgewandelt werden, und die Intensität derdie Graustufen- und Farb ist Hemi-quantifizierbar. Diese Technologie bietet einzigartige Vorteile für die Messung der Lipidakkumulation in lebenden Tieren. Zweitens ist die histologische Analyse der Leber am häufigsten verwendete Methode Hepatosteatose zu bestimmen. Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung liefert histologischen Daten wie Hepatozyten Morphologie und Makrophageninfiltration, während Oil Red-O-Färbung, die Größe und Position der Lipidtröpfchen in Hepatozyten zeigt. Drittens ist der Lipidgehalt Analyse Chloroform / Methanol-Extraktion unter Verwendung eine genaue und quantitative Messung von Leberlipiden. Gesamt-Triglycerid-und Cholesterinspiegel kann mit biochemischen Methoden gemessen werden. Wichtig ist, dass Lipid-Extraktionsanalyse und Oil Red O Färbung auch in genetisch manipulierten oder pharmazeutisch behandelten Hepatozyten verwendet werden.
Der Vorteil des vorliegenden Verfahrens ist die Verwendung von mehreren optimiert Ansätze hepatischen steatotic Modelle zu erzeugenund umfassend die Phänotypen charakterisieren sowohl in vivo und in vitro. Die DIO Mausmodelle können die Pathologie und metabolischen Phänotyp der menschlichen Fettleberkrankheit rekapitulieren. Andere Stoffwechselparameter beim Menschen können in diesem Modell als auch 8 repliziert werden. Die Erzeugung des steatotic Hepatozyten-Modell in Reaktion auf hohe Glukose plus Insulin ist effizient, nützlich und überwindet die Begrenzung der kostspielig und zeitraubend Maus funktionieren. Zusammengenommen sind diese Verfahren ausreichend und notwendig für die Untersuchung von Leberlipidstörungen und Insulinresistenz bei Nährstoff Überlastung.
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Protokoll
Alle Tierversuchsprotokolle wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee am Institut für Ernährungswissenschaften, Shanghai Institute für Biologische Wissenschaften, Chinesische Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) zugelassen.
1. DIO Mausmodell
- HFHS Fütterung
- Feed the acht Wochen alten männlichen C57BL / 6-Mäuse mit einem HFHS, die 40 kcal% Fett enthält und 40 kcal% Saccharose. Haus sie in 12 h Hell-Dunkel-Zyklus Bedingungen.
- Halten Sie die Mäuse in HFHS Diät-Fütterung Bedingung für vier bis 16 Wochen. Überprüfen Sie das Körpergewicht pro Woche.
- Analyse der Körperzusammensetzung und Pseudofarbbildanalyse
- Betreff die Mäuse mit einem Körperzusammensetzung Analysator Analyse.
- Sicherung bewußt nicht narkotisierten Mäusen in einem Kunststoffrohr in der. Messen Sie die Körperfettmasse, Muskelmasse und Flüssigkeiten ein NMR - System, wie zuvor beschrieben 2.
- Scannen Sie den ganzen Körper jeder Maus ein MRT-System.
- Anesthetize die Mäuse mit 1% Avertin über intraperitoneale Injektion (25 & mgr; l / g) und die Bildanalyse in Spezialglasröhren durchzuführen.
HINWEIS: Der Prozess der Abbildungs dauert fast 0,5 h für jede Maus. Wenn die Messung abgeschlossen ist, kehren die Mäuse in ihren Käfig.
- Anesthetize die Mäuse mit 1% Avertin über intraperitoneale Injektion (25 & mgr; l / g) und die Bildanalyse in Spezialglasröhren durchzuführen.
- Scannen Sie die ganze Körper der Mäuse in dorsalen, mittleren und ventralen Schichten; Scannen der Leber in der vertikalen Richtung. Verwenden Sie ein 0,55 T-Magneten und die folgenden Geräteparameter: K space = 192 x 256 & mgr; m, Schnittdicke = 3 mm, TE = 14,8 ms, TR = 400 ms, FOVRead = 100 mm, FOVPhase = 100 mm, und die Anzahl der Scans = 8. Scan die gleiche magnetische Zustand für die alle Gruppen von Mäusen.
- Ordnen Sie das Graustufenbild auf ein Pseudofarbbild entsprechend der Signalstärke 9.
- Betreff die Mäuse mit einem Körperzusammensetzung Analysator Analyse.
- Maus - Euthanasie
- Sterilisieren dissecting Werkzeuge, wie Zangen und Scheren.
- Gießen Sie ausreichend Isofluran auf einem Papiertuch und lassen Sie die Isofluran in einem Glas verflüchtigen. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse durch das Isofluran euthanasiert werden.
- Befestigen Sie die Mäuse auf einem Operationstisch. Spray jeden Bauch mit 75% Ethanol, machen einen Einschnitt in der Dermis der Xiphoidbasis Schere und reißen die Dermis der Länge nach durch die Mittellinie mit den Händen das Peritoneum zu belichten.
- Klemmen Sie den Xiphoidbasis mit einer Pinzette und schneiden Sie das Peritoneum der Breite durch den Boden der Rippen die Eingeweide zu belichten.
- Sammeln Sie Blut in EDTA-beschichteten Röhrchen durch Herzpunktion.
- Schneiden Sie die Membran entlang der Leber und entfernen Sie vorsichtig die Leber von den enterocoelia mit einer feinen Schere. Schneiden drei Stücke von Lebergewebe für die folgenden Lipidmessungen: a) 6 x 3 x 3 mm für H & E-Färbung, b) 6 x 3 x 3 mm für Oil Red-O-Färbung, und c) 20-40 mg Leber für Chloroform / Methanol-Extraktion.
- H & E - Färbung
- Fixieren Sie die Leber in 4% phosphatgepufferten Formalin Acetat bei 4 ° C über Nacht und dann binde sie in Paraffinwachs.
- Schneiden Sie Paraffinschnitte (5 & mgr; m) und montieren sie auf Glasobjektträger für H & E - Färbung, wie zuvor beschrieben 3, 10.
- Oil Red - O - Färbung
- Regent Vorbereitung
- Bereiten Oil Red O Arbeitslösung mit 10% Formalin, 60% Isopropanol, Hämatoxylin und Glycerin Gelee. Man löst 0,5 g Oil Red O-Pulver mit 100 ml Isopropanol und erhitzen Sie es in einem 60 ° C-Bad eine 0,5% ige Stammlösung zu machen.
- Verdünnen mit doppelt destilliertem Wasser (ddH 2 O) in einem Verhältnis 3: 2 (3 ml der Stammlösung und 2 ml ddH 2 O). Filtern Sie die Arbeitslösung und lassen Sie für mindestens 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen.
- Betten Sie die Leber in eine optimale Schnitttemperatur (OCT) -Verbindung in aplastic Kastens. Einfrieren bei -20 ° C für 30 min. Schneiden Sie es in 8-um-Schnitte in einem Gefriermikrotom, montieren Sie das Gewebe auf einer Folie, und legen Sie es für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- Legen Sie ein Papiertuch in den Boden einer Anfärbung Wanne und gießen Sie eine kleine Menge von 10% Formalin das Papiertuch zu benetzen. Legen Sie die Folie in der Färbung Badewanne und fixieren die Gefrierschnitten in Formaldehyd Dämpfe für 5 min bei 4 ° C.
- Tauchen Sie die Folie in 60% Isopropanol in der Färbungs Wanne für 3 s; wiederhole einmal.
- Fügen Sie ein paar Tropfen Öl O Red Arbeitslösung auf die Folie alle Gewebe zu bedecken und für 15 min inkubiert. Schützen Sie das Gewebe von Licht bei Raumtemperatur.
- Spülen Sie die Folie in neuen 60% Isopropanol in der Färbungs Wanne für 3 s; zweimal wiederholen.
- Vorsichtig spülen Sie das Wasser um das Gewebe die Folie durch destilliertes Wasser zweimal und zu entfernen. Achten Sie darauf, nicht um das Gewebe zu trocknen.
- Legen Sie die Folie in Hämatoxylin für 1 min und spülen Sie vorsichtig mit Leitungswasser für 5-10Minute Vorsichtig spülen Sie die es in destilliertem Wasser, bis sie bereit auf dem Deckglas die Folie in destilliertem Wasser zweimal und halten zu setzen.
- Erhitzen Sie das Glycerin Gelee in der Mikrowelle und mehrere Tropfen auf dem Gewebe platzieren. Sanft legen Sie das Deckglas auf und kümmern uns nicht um Blasen zu bilden.
- Beachten Sie den Fleck unter dem Mikroskop und erfassen charakteristische Bilder mit 20X und 40X Ziele.
- Regent Vorbereitung
- Die Messung der Leberlipide
- Legen Sie die seziert Lebergewebe in einem neuen 2-mL-Zentrifugenröhrchen. Homogenisieren in 1 ml PBS mit einem Homogenisator und Transfer des Lysats auf ein neues 15-mL Glasrohr.
- 5 ml Chloroform / Methanol (2: 1, v / v) Lösung, vortex die Mischung kräftig für 1 min und ließ für 2 h auf Eis stehen.
- Zentrifuge bei 1.650 xg für 10 min bei 4 ° C; sollte die Mischung in drei Schichten zu trennen: die obere Methanolschicht, die mittlere Protein Scheibe und die untere Chloroform und Lipiden.
- Tran sfer der unteren Phase in ein neues Glasrohr mit einem Glas Pasteur Pipette; es besteht keine Notwendigkeit, jeden Tropfen der Bodenfraktion zu erhalten. Stellen Sie den Schlauch zur Seite auf dem Eis.
- Hinzufügen , 600 & mgr; l von 4 mM MgCl 2 und 1,5 ml Chloroform zu der überstehenden Fraktion nach links in dem vorhergehenden Rohr und kräftig vortexen. Inkubieren auf Eis für 30 min und zentrifugieren bei 1.650 xg für 10 min bei 4 ° C.
- Kombinieren Sie die untere Phase mit dem ersten Bodenphase Rohr mit Pasteur-Pipette. Entsorgen Sie die oberen und mittleren Schichten.
- Verdampfe das Chloroform unter Stickstoffgas in einem 37 ° C-Bad. Waschen Sie die Seiten der Glasrohre gründlich mit 200 ul 1% Triton X-100 / Chloroform (v / v). Man dampft unter Stickstoffgas. Man löst das Lipid mit 200 & mgr; l ddH 2 O und Wirbel auch die endgültige Emulsion zu machen.
- Messen Sie die Gesamt Triglycerid (TG) und Cholesterin (TC) Ebenen durch ein Triglycerid oder Cholesterin-Kit nach Protokoll des Herstellersxref "> 3.
HINWEIS: Die Lipidwerte normalisiert sind , die denen der Proteinkonzentration in dem anfänglichen Homogenisat, wie 3 durch Proteinquantifizierung bestimmt.
2. Primäre Maus-Hepatozyten-Modell
- Isolierung von Maus primären Hepatozyten
- Anesthetize jede Maus mit 6% Chloralhydrat (10 & mgr; l / g intraperitoneal).
- Isolieren primäre Hepatozyten, wie zuvor beschrieben 10. Wachsen Zellen auf Kollagen beschichteten Glasplättchen in einer 6-Well-Platte für Oil Red O Färbung. Für Lipidextraktion, Samen der Zellen auf einer 10 cm Zellkulturschale 10.
- Zellbehandlung und Oil Red - O - Färbung
- Ersetzen Sie das Medium mit 2 ml Hungermedium und Inkubation bei 37 ° C für 24 h. Behandeln Sie es mit 30 mM Glucose und 100 nM Insulin. Inkubieren es in einem 37 ° C Inkubator Kultur für 24 h.
- Saugen Sie das Medium. In 2 ml PBS und vorsichtig schwenken, das Medium zu spülen; wiederhole einmal.
- Befestigen Sie das Deckglas auf den Objektträger mit einem Gummiband. Setzen Sie die an der äußeren Oberfläche anhaftenden Zellen. Führen Sie die Öl-Rot-O-Färbung, wie oben (Schritt 1.5) beschrieben.
HINWEIS: Die Basalniveaus von Lipidakkumulation mit einem hohen Glucose plus Insulin-Behandlung nach Serumentzug stimuliert. Die Lipidtropfen werden von Oil Red-O-Färbung sichtbar gemacht.
- Messung von Lipiden
- Behandeln Sie die Hepatozyten mit hoher Glukose und Insulin im gleichen Zustand (Schritt 2.2.1). 1 ml PBS in jede 10-cm Zellkulturschale. Kratzen Sie die Zellen aus und ernten sie in neue 15-ml-Glasröhrchen, aus denen Teilmengen von 100 ul übertragen werden an die frische 1,5-ml-Röhrchen für die Proteinquantifizierung.
- 4 ml Chloroform / Methanol (2: 1, v / v) an die verbleibenden 900 & mgr; l der Zellen. Beschallen für ca. 20 Pieptöne und dann Vortex kräftig zu lösendas Lipid in den Zellen. Inkubieren Sie die Mischung auf Eis für 2 Stunden. Führen Sie die Lipidextraktion (Schritt 1.6).
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Ergebnisse
Wie in 1A gezeigt ist , wurde die Mauskörpergewicht 45 ± 1,2 g nach 16 Wochen HFHS Fütterung erhöht, was etwa 1,5-fach höher als Chow - Diät Zuführgruppe ist. Die NMR - Körperzusammensetzung analysiert die Fettmasse und Muskelmasse von Mäusen zeigt , sind angegeben (1B). Die Fettverteilung des ganzen Körpers und der Leber wurden durch MRI bestimmt, und repräsentative Pseudo-Farbbilder in Live - bewusste Mäuse werden in 1C-D gezeigt. Das ...
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Diskussion
NASH ist eine Reihe von progressiven Lebererkrankungen, die mit metabolischem Syndrom assoziiert ist, Fettleibigkeit, Insulinresistenz oder Typ - 2 - Diabetes mellitus (T2DM) 11. Das Markenzeichen von NAFLD ist Steatose, die Anhäufung von Lipid in Hepatozyten. Hier wird ein Spektrum von Verfahren vorgestellt, die Phänotypen und die Parameter der Lebersteatose Verwendung DIO Mäuse und Maus primären Hepatozyten zu charakterisieren. Dieses Verfahren könnte hilfreich sein, die molekularen Mechanismen...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Finanzierung: Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (Nr 81270930, 31471129 und 31671224) und die hundert Talente-Programm der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (2013OHTP04) zu YL unterstützt wurde
Danksagungen
Wir danken Feifei Zhang für die hilfreichen Diskussionen. Wir danken Jing Gao und Yixuan Sun für die technische Unterstützung und Zhengshuai Liu und Fengguang Ma für die Tierversuche.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| O.C.T Verbindung | SAKURA | 4583 | |
| Öl Rot O | Sigma | O0625-25G | |
| Infinity Triglyceride Kit | Fisher Wissenschaftliche | TR22421 | |
| Infinity Cholesterin Kit | Fisher Wissenschaftliche | TR13421 | |
| Kollagen Typ I, Rattenschwanz | Millipore | 08-115 | |
| DMEM (niedriger Glukosegehalt) | Invitrogen | 11885-092 | |
| Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 10099141 | |
| PBS | cellgro | R21-040-CVR | |
| HBSS | cellgro | 20-021-CV | |
| Insulin | TOCRIS Bioscience | 3435 | dissolve in PBS, 1 mM for stock |
| Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| Mikroskop | Olympus | BX53 | |
| Peristaltische Pumpe | Longerpump | BT100-2J | |
| 10 cm Zellkulturschale | Corning | 420167 | |
| 6-Well-Platte | Corning | 3516 | |
| BCA Assay | Beyotime | P0010 | |
| Kernspinresonanz | Niumag-Technologie | MiniQMR23-060H-I | |
| Diät mit hohem Fettgehalt (HFHS) | Forschung Diäten | D12327 |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
