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Methodenartikel

A Simple Red Blood Cell Lysis Verfahren zur Etablierung von B Lymphoblastoidzelllinien

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DOI:

10.3791/55191

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14. Januar 2017

 ,  , 
1Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, 2Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eine einfache roten Blutkörperchen die Lyse Verfahren zum Aufbau B-LCLs mit hoher Immortalisierung Effizienz entwickelt, eine kleine Menge von Blut benötigt und die Zeit von der Initiierung der Gefrierkonservierung zu speichern.

Zusammenfassung

Es gibt eine Reihe von Methoden zur Umwandlung von B-Lymphozyten durch das Epstein-Barr-Virus in vitro in immortalisierte Zelllinien. Wir haben eine neue Methode mit einer leistungsstarken und einfachen Strategie für die Etablierung von B-LCLs, der Methode zur Lyse roter Blutkörperchen, entwickelt. Diese Methode vereinfachte das PBMC-Trennungsverfahren mit der Entfernung roter Blutkörperchen und verwendete nur 0,5 ml Vollblut für die Etablierung von EBV-immortalisierten Zelllinien, die sich in relativ kurzer Zeit zu großen Zellzahlen mit einer Erfolgsquote von 100 % vermehren können. Die Methode ist einfach, zuverlässig, zeitsparend und für die Behandlung einer großen Anzahl klinischer Proben anwendbar.

Einleitung

Ruhende B-Zellen könnten durch das Epstein-Barr-Virus (EBV) in vitro in aktiv proliferierende B-lymphoblastoide Zelllinien (B-LCLs) umgewandelt werden. B-LCLs ähneln Keimzellen in Differenzierung und Entwicklung, und die somatische Mutationsrate von B-LCLs betrug nur 0,3%1, mit vernachlässigbaren genetischen und phänotypischen Veränderungen. Daher haben B-LCLs als Surrogate für mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) den Fortschritt der Genomik-, Transkriptomik- und Proteomik-Studien zu EBV-assoziierten Erkrankungen erheblich beschleunigt2,3. Darüber hinaus haben B-LCLs auch eine wichtige Anwendung beim Screening monoklonaler Antikörper4,5.

Es wurden mehrere Methoden zur Immortalisierung von B-Lymphozyten durch EBV entwickelt. Zu den wichtigsten gängigen Verfahren gehören die Isolierung von B-Lymphozyten und die Verwendung von B95-8-Zelllinien zur Herstellung von infektiösem EBV. Von der Isolation bis zur Transformation werden diese Methoden in drei Strategien unterteilt. Lymphozyten werden durch Dichtegradientenzentrifugation undEBV-Transformation direkt 6-8 vom frischen Blut getrennt, in dieser Studie als Dichtegradiententrennungsmethode bezeichnet. Andere Techniken überwinden jedoch die Schwierigkeit, frisches Blut zu transportieren, und verwenden ein Verfahren zum Einfrieren gereinigter Lymphozyten und zum anschließenden Auftauen und zurEBV-Infektion 9-11. Kryokonserviertes Vollblut kann auch für die Isolierung von B-Lymphozyten und die Transformation verwendet werden12,13. Neben der Dichtegradientenzentrifugation zur Trennung von B-Lymphozyten verwenden einige Forscher einen magnetischen Zellsortierer, um B-Lymphozytenauszuwählen 12. Die magnetische Trennung ist jedoch ein teurer, komplexer und zeitaufwändiger Prozess. Obwohl diese Methoden nützlich sind, um B-Lymphozyten mit einer hohen Erfolgsrate zu immortalisieren, erfordern die Notwendigkeit, eine große Anzahl klinischer Proben zu behandeln, und das relativ kleine Blutvolumen eine einfachere Methode zur Etablierung einer permanenten Zelllinie.

Eine weitere, weniger häufig verwendete Methode ist die Verwendung von Vollblut als Quelle für kernhaltige Zellen für EBV-Infektionen und die Etablierung von B-LCLs. Diese Methoden vereinfachen die Technik, indem sie das Trennverfahren weglassen. Nur eine kleine Menge Vollblut, entweder frisch14 oder gefroren15,16, reicht aus, um die Zelllinien zu gewinnen. Leider gibt es große Unterschiede im Erfolg der Dokumente15, 16 und einiger unserer Validierungstests. Darüber hinaus werden transformierte Kolonien unter dem Mikroskop wegen der großen kontaminierenden Verunreinigungen kaum erkannt. Daher ist eine zuverlässigere Methode für die Transformation erforderlich.

Basierend auf den obigen Überlegungen haben wir eine neuartige Methode entwickelt, um B-LCLs ohne vorherige Reinigung der Lymphozyten zu etablieren, die sogenannte Methode zur Lyse roter Blutkörperchen. Diese Methode ist bequem, zeitsparend und auf eine große Anzahl von Proben anwendbar. Bereits 0,5 ml Vollblut reichten aus, um B-LCLs zu erhalten, die von Säuglingen und älteren Menschen leicht zu erhalten sind, ohne deren Gesundheit wesentlich zu beeinträchtigen.

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Protokoll

Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Instituts für Genetik und Entwicklungsbiologie genehmigt, und das Protokoll folgt den Richtlinien des Instituts für das Wohlergehen der Menschen.

1. Herstellung von EB-Virus

  1. Am Tag 1 auftauen B95-8 Zellen und der Kultur in 6 ml komplettem RPMI-1640-Medium, das mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und Antibiotika (100 ug / ml Streptomycin, 100 U / ml Penicillin) in einem ergänzten T25 Kulturflasche. Legen Sie die Kulturflasche in 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C.
  2. Am Tag 2 werden die Zellmorphologie unter einem Mikroskop zu beobachten. Die Zellen sind in einem guten Zustand, wenn sie hell und rund sind. In 10 ml komplettem RPMI-1640-Medium.
  3. Am Tag 4, 10 ml frisches vollständiges RPMI-1640-Medium, und dann in einen T75-Kulturkolben übertragen.
  4. Am Tag 8 20 ml komplettem RPMI-1640-Medium.
  5. Pflegen Sie die Zellen für 8 Tage ohne Zugabe von frischem Medium, das heißt, Hunger.
  6. Am Tag 16, beobachten Zellenunter dem Mikroskop beobachtet. Sammle die Zellen in einem 15 ml-Zentrifugenröhrchen wurden 12 ml / Röhrchen.
  7. für 1 h bei -80 ° C Cryo-bewahren, und dann bei 37 ° C schnell aufgetaut. 3-mal wiederholen, bis die Viruspartikel aus den Zellen freigesetzt werden.
  8. Zentrifuge bei 240 × g für 10 min bei Raumtemperatur.
  9. Filtern Sie die Überstand durch ein 0,22-um-Filter, aliquoten, 12 ml / Röhrchen, und bei -80 ° C.

2. Behandlung von Vollblut mit der roten Blutkörperchen Lysepuffer

  1. 0,5 mL Vollblut durch EDTA antikoaguliertem · K 2 in ein 15 ml Röhrchen.
  2. Geben Sie 1 ml der roten Blutkörperchen Lysepuffer (gefiltert durch 0,22 um Filter und Auftauen auf Raumtemperatur vor dem Gebrauch) mit dem Vollblut und gut mischen. Legen Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 4 min. Dann fügen Sie 5-7 ml 1x PBS schnell auf die Stoppreaktion.
  3. Zentrifuge bei 240 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Weiße Blutkörperchen werden am Boden des Röhrchens auszufällen.
  4. Überstand verwerfen und waschen Sie die Fällung durch Zugabe von 7 ml 1640 Basismedium. Zentrifuge für 5 Minuten bei 240 xg bei Raumtemperatur. Zweimal wiederholen.
  5. Resuspendieren des Zellpellets in 300 & mgr; l Transformationsmedium (RPMI 1640 Medium, 20% fötales Rinderserum und 10 ug / ml Phytohämagglutinin (PHA)).

3. EBV-Infektion

  1. Hinzuzufügen 60 ul 20 ug / ml Cyclosporin A (CsA) zu der Zellsuspension.
  2. Schnell ein Aliquot von EBV auftauen bei 37 ° C. Hinzufügen 240 uL EBV zu der Zellsuspension.
  3. Gut mischen und legen Sie die Zellsuspension auf eine 96-Well-Platte, 200 & mgr; l pro Vertiefung. Verdunstung, 200 ul 1x PBS zu jedem gut um der 96-Well-Platte zu vermeiden. Die Platte wird in einem 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C.

4. Erweiterung und Kryokonservierung von B-LCL

  1. Ändern Sie die Hälfte des Mediums einmal pro Woche im ersten Monat nach der EBV-Infektion. Nur eine dicke Layer von Zellbruchstücke sichtbar ist unter dem Mikroskop am Tag 7 (Abbildung 2). Nach einem Monat der EBV - Infektion sind lymphoblastoiden Zellcluster sichtbar unter einer dicken Schicht von Zellfragmente unter dem Mikroskop (Figur 2).
  2. Ändern Sie die Hälfte des Mediums alle 3 Tage , bis die Zellhaufen deutlich sichtbar unter dem Mikroskop (Abbildung 2) sind. Typischerweise dauert dieser Vorgang 10 bis 20 Tage.
  3. Nach dem Mischen pipettieren die Zellen und Transfer zum 24-Well-Platte. Die doppelte Volumen des Kulturmediums mit komplettem RPMI 1640, während es gelb wird. Dieses Verfahren hängt von der Rate des Zellwachstums.
  4. Anschließend übertragen die Zellen zu T25 Kulturflasche. Die doppelte Volumen des Kulturmediums, wie es gelb wird, bis das Volumen des Mediums auf 10 erweitert - 15 ml.
  5. Ändern Sie Medium 24 h vor dem Einfrieren. Zentrifuge Zellsuspension für 5 min bei 240 x g. Zählen von Zellen mit einem Zellzähler und gefrier bei einer Dichte von von 5 bis 10 x 10 6 / ml in frozen Stammlösung 90% FBS und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) enthält. Einfrieren bei einer Rate von 1 ° C pro min auf -80 ° C und übertragen dann direkt in flüssigem Stickstoff.

5. 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid (MTT) Assay 17

  1. Bereiten Sie eine B-LCL Einzelzellsuspension mit dem 1640-Medium, das 10% fötales Rinderserum enthält. Seed 3 x 10 4 Zellen pro Vertiefung auf 96-Well - Platte, 100 & mgr; l pro Vertiefung.
  2. Die Platte wird in 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C für 12 - 16 Uhr.
  3. In MTT (5 mg / ml) zu den Vertiefungen, in denen Zellen wachsen und halten weg von Licht für 4 h bei 37 ° C.
  4. Zentrifugenzellenplatte für 10 min bei 168 x g.
  5. Überstand entfernen und mit 100 & mgr; l DMSO pro Vertiefung.
    HINWEIS: Seien Sie vorsichtig. Berühren Sie nicht die nadelförmigen Farbstoffkristalle.
  6. Schütteln Sie die Platte für 10 Minuten bei niedriger Geschwindigkeit vollständig um die Kristalle aufzulösen.
  7. Measure Absorption bei 570 nm durchunter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Spektrophotometer.

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Ergebnisse

Während des Prozesses der Transformation werden die morphologischen Veränderungen der Zellen durch Lichtmikroskopie (Abbildung 2) visualisiert. Kleine Gruppen von Zellen waren deutlich sichtbar mit dem Dichtegradienten Trennverfahren nach 7 Tagen nach der Infektion, während nur eine dicke Schicht aus Zellfragmente aus der roten Blutkörperchen Lyseverfahren sichtbar sind. Allerdings sind Lymphoblastoidzelllinien Cluster sichtbar unter der dicken Schicht von Zellfragmente ...

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Diskussion

Wir berichten über die Entwicklung eines neuartigen Verfahrens zum Lysieren von roten Blutkörperchen menschlichen B-Zellen aus Vollblut Immortalisierung und seine Lebensfähigkeit der Zellen von etablierten B-LCLs durch den MTT-Test bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Lebensfähigkeit der Zellen von B-LCLs durch die roten Blut Verfahren Zelllyse eingerichtet ist viel höher als die des Dichtegradienten Trennungsverfahren. Der große Vorteil der roten Blutkörperchen Verfahren der Lyse ist, dass es einfach ist, und erf...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Schlüsselprojekte der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (KFZD-SW-205), strategisches Unterstützungssystem für biologische Ressourcen der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (CZBZX-1).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ZentrifugeTechcompCT6TZentrifugation
Automatisierter ZellzählerZählstern  IC 1000 Für die Zellzählung 
Epoch Mikrotiterplatten-SpektralphotometerBioTek InstrumentsSN263839Zur Messung der Absorption
96-Well-ZellkulturclusterCorning Incorporated3599Polystyrolplatten
24-Well-ZellkulturclusterCorning Incorporated3524Polystyrolplatten
25 cm2 ZellkulturflascheNest707001Polystyrol& nbsp;
FBSGibco10270Komponente von B-LCLs mittel
RPMI Medium 1640Gibco31800-022Für B-LCLs medium
L-Glutamin   Amresco0374Bestandteil von B-LCLs medium
100x Streptomycin Penicillinlösung BioRoYeeBRY-2309BioRoYeeBRY-2309Bestandteil von B-LCLs medium
Ficoll paque plusGE  Gesundheitswesen17-1440-03Zur in vitroIsolierung von Lymphozyten
PHA-MSigmaL8902Zur Stimulierung der Lymphozytenproliferation
Cyclosporin ACayman  Chemikalie12088Zur Hemmung der Zytotoxizitätswirkung von T-Zellen
ErythrozytenlysepufferTiangenRT122-01Zur Lyse roter Blutkörperchen
MTTAmresco0793Zum Nachweis der Zellviabilität
DMSOSigmaD2650Zum Einfrieren von Zellen

Referenzen

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