A Simple Red Blood Cell Lysis Verfahren zur Etablierung von B Lymphoblastoidzelllinien

Summary

Eine einfache roten Blutkörperchen die Lyse Verfahren zum Aufbau B-LCLs mit hoher Immortalisierung Effizienz entwickelt, eine kleine Menge von Blut benötigt und die Zeit von der Initiierung der Gefrierkonservierung zu speichern.

Abstract

Es gibt eine Reihe von Methoden zur Umwandlung von B-Lymphozyten durch das Epstein-Barr-Virus in vitro in immortalisierte Zelllinien. Wir haben eine neue Methode mit einer leistungsstarken und einfachen Strategie für die Etablierung von B-LCLs, der Methode zur Lyse roter Blutkörperchen, entwickelt. Diese Methode vereinfachte das PBMC-Trennungsverfahren mit der Entfernung roter Blutkörperchen und verwendete nur 0,5 ml Vollblut für die Etablierung von EBV-immortalisierten Zelllinien, die sich in relativ kurzer Zeit zu großen Zellzahlen mit einer Erfolgsquote von 100 % vermehren können. Die Methode ist einfach, zuverlässig, zeitsparend und für die Behandlung einer großen Anzahl klinischer Proben anwendbar.

Introduction

Ruhende B-Zellen könnten durch das Epstein-Barr-Virus (EBV) in vitro in aktiv proliferierende B-lymphoblastoide Zelllinien (B-LCLs) umgewandelt werden. B-LCLs ähneln Keimzellen in Differenzierung und Entwicklung, und die somatische Mutationsrate von B-LCLs betrug nur 0,3%¹, mit vernachlässigbaren genetischen und phänotypischen Veränderungen. Daher haben B-LCLs als Surrogate für mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) den Fortschritt der Genomik-, Transkriptomik- und Proteomik-Studien zu EBV-assoziierten Erkrankungen erheblich beschleunigt^2,3. Darüber hinaus haben B-LCLs auch eine wichtige Anwendung beim Screening monoklonaler A....

Protocol

Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Instituts für Genetik und Entwicklungsbiologie genehmigt, und das Protokoll folgt den Richtlinien des Instituts für das Wohlergehen der Menschen.

1. Herstellung von EB-Virus

1. Am Tag 1 auftauen B95-8 Zellen und der Kultur in 6 ml komplettem RPMI-1640-Medium, das mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und Antibiotika (100 ug / ml Streptomycin, 100 U / ml Penicillin) in einem ergänzten T25 Kulturflasche. Legen Sie die Kulturflasche in 5% CO ₂ Inkubator bei 37 ° C.
2. Am Tag 2 werden die Zellmorphologie unter einem Mikroskop zu beobachten. Die Zellen sind in einem guten Zustand, wenn....

Results

Während des Prozesses der Transformation werden die morphologischen Veränderungen der Zellen durch Lichtmikroskopie (Abbildung 2) visualisiert. Kleine Gruppen von Zellen waren deutlich sichtbar mit dem Dichtegradienten Trennverfahren nach 7 Tagen nach der Infektion, während nur eine dicke Schicht aus Zellfragmente aus der roten Blutkörperchen Lyseverfahren sichtbar sind. Allerdings sind Lymphoblastoidzelllinien Cluster sichtbar unter der dicken Schicht von Zellfragmente .......

Discussion

Wir berichten über die Entwicklung eines neuartigen Verfahrens zum Lysieren von roten Blutkörperchen menschlichen B-Zellen aus Vollblut Immortalisierung und seine Lebensfähigkeit der Zellen von etablierten B-LCLs durch den MTT-Test bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Lebensfähigkeit der Zellen von B-LCLs durch die roten Blut Verfahren Zelllyse eingerichtet ist viel höher als die des Dichtegradienten Trennungsverfahren. Der große Vorteil der roten Blutkörperchen Verfahren der Lyse ist, dass es einfach ist, und erf.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zentrifuge	Techcomp	CT6T	Zentrifugation
Automatisierter Zellzähler	Zählstern	IC 1000	Für die Zellzählung
Epoch Mikrotiterplatten-Spektralphotometer	BioTek Instruments	SN263839	Zur Messung der Absorption
96-Well-Zellkulturcluster	Corning Incorporated	3599	Polystyrolplatten
24-Well-Zellkulturcluster	Corning Incorporated	3524	Polystyrolplatten
25 cm2 Zellkulturflasche	Nest	707001	Polystyrol& nbsp;
FBS	Gibco	10270	Komponente von B-LCLs mittel
RPMI Medium 1640	Gibco	31800-022	Für B-LCLs medium
L-Glutamin	Amresco	0374	Bestandteil von B-LCLs medium
100x Streptomycin Penicillinlösung BioRoYeeBRY-2309	BioRoYee	BRY-2309	Bestandteil von B-LCLs medium
Ficoll paque plus	GE  Gesundheitswesen	17-1440-03	Zur in vitroIsolierung von Lymphozyten
PHA-M	Sigma	L8902	Zur Stimulierung der Lymphozytenproliferation
Cyclosporin A	Cayman  Chemikalie	12088	Zur Hemmung der Zytotoxizitätswirkung von T-Zellen
Erythrozytenlysepuffer	Tiangen	RT122-01	Zur Lyse roter Blutkörperchen
MTT	Amresco	0793	Zum Nachweis der Zellviabilität
DMSO	Sigma	D2650	Zum Einfrieren von Zellen