Murine Aortic Crush Injury: Eine effiziente In vivo Modell der glatten Muskelzellproliferation und Endothelfunktion

Summary

Restenose nach Herz-Kreislauf-Verfahren (Bypass-Chirurgie, Angioplastie oder Stenting) ist ein wichtiges Problem der Verringerung der Haltbarkeit dieser Verfahren. Eine ideale Therapie würde die Proliferation der glatten Muskelzelle (VSMC) hemmen und gleichzeitig die Regeneration des Endothels fördern. Wir beschreiben ein Modell zur gleichzeitigen Beurteilung der VSMC-Proliferation und Endothelfunktion in vivo.

Abstract

Arterielle Rekonstruktion, ob Angioplastie oder Bypass-Operation, beinhaltet iatrogenes Trauma verursacht endotheliale Störung und vaskuläre glatte Muskelzelle (VSMC) Proliferation. Gemeinsame murine Modelle studieren kleine Gefäße wie die Carotis- und Oberschenkelarterien. Hier beschreiben wir ein in vivo- System, in dem sowohl die VSMC-Proliferation als auch die endotheliale Barrierefunktion gleichzeitig in einem großen Gefäß beurteilt werden können. Wir untersuchten die infrarenale Aortenreaktion auf Verletzungen in C57BL / 6 Mäusen. Die Aorta wurde von der linken Nierenvene zur Aortenbifurkation durch 30 transmurale Quetschungen von 5 Sekunden Dauer mit einem Baumwollspitzapplikator verletzt. Morphologische Veränderungen wurden mit konventioneller Histologie beurteilt. Die Aorta-Wanddicke wurde von der Lumenoberfläche bis zur Adventitia gemessen. EdU-Integration und Gegenfärbung mit DAPI und Alpha-Actin wurde zur Demonstration der VSMC-Proliferation verwendet. Die Aktivierung von ERK1 / 2, ein bekannter Moderator der intimalen Hyperplasiebildung, wurde abgebautAbgebaut durch Western-Blot-Analyse. Die Wirkung der Entzündung wurde durch Immunhistochemie für B-Zellen, T-Zellen und Makrophagen bestimmt . En- Gesichtsabschnitte von Endothel wurden mit Rasterelektronenmikroskopie (SEM) visualisiert. Die endotheliale Barrierefunktion wurde mit Evans Blue Färbung bestimmt. Transmurale Verletzungen führten zu Aortenwandverdickung. Diese Verletzung induzierte die VSMC-Proliferation, am deutlichsten bei 3 Tagen nach Verletzung und die frühzeitige Aktivierung von ERK1 / 2 und verringerte die p27- ^kip1- Expression. Verletzung führte nicht zu erhöhten B-Zellen, T-Zellen oder Makrophagen Infiltration in der Gefäßwand. Verletzung verursacht partielle Endothelzell-Entblößung und Verlust von Zell-Zell-Kontakt. Verletzung führte zu einem signifikanten Verlust der endothelialen Barriere-Funktion, die nach 7 Tagen zur Grundlinie zurückkehrte. Das murine transmurale stumpfe Aortenverletzungsmodell bietet ein effizientes System, um gleichzeitig sowohl die VSMC-Proliferation als auch die endotheliale Barrierefunktion in einem großen Gefäß zu studieren.

Introduction

Restenose Nach Herz-Kreislauf-Verfahren (Bypass-Chirurgie, Angioplastie oder Stenting) ist ein erhebliches Problem der Verringerung der Haltbarkeit dieser Verfahren. Alle Revaskularisierungsverfahren werden durch Restenose geplagt. Gegenwärtige Strategien zur Verhinderung von Restenose (Arzneimittel-eluierende Stents und drogenbeschichtete Ballons) hemmen sowohl die vaskuläre glatte Muskelzelle (VSMC) als auch die endotheliale Zellproliferation (EC). Folglich verhindern diese Interventionen eine VSMC-vermittelte Restenose, verhindern aber auch die Regeneration des Endothels. Ohne ein intaktes Endothel sind die Patienten verpflichtet, auf potenten A....

Protocol

Ethik-Statement: Die Protokolle für die Tierhaltung wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Maryland (Protokoll Nr. 0416009) genehmigt und nach AAALAC-International Standards durchgeführt.

1. Chirurgische Vorgehensweise

1. Anästhesietechnik
   1. Sterilisieren Sie alle Instrumente, die in der Überlebenschirurgie verwendet wurden, mit Dampfsterilisation bei 121 ° C für 30 min.
   2. Anästhesie über einen Induktionsbehälter mit 100% O ₂ und 2,5% Isofluran über Präzisionsverdampfer abgeben. Nachinduktion, das Isofluran abbrechen und die Kamm....

Results

Transversale Abschnitte Aorta eingebettet in OCT wurden geschnitten, und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt dann Zähler gefärbt mit Verhoeff-Van Gieson (VVG) Fleck, um die interne und externe elastische Lamina identifizieren ⁷ . Crush-Verletzung induzierte Aortenwand Verdickung im Vergleich zu den Aorta von Tieren mit einem Sham-Verfahren behandelt (Laparotomie und Dünndarm Mobilisierung allein). Die Wanddicke, die durch den Abstand von Adventitia zum Lumen beurtei.......

Discussion

Wir haben die Auswirkungen eines murinen Aortenverletzungsmodells charakterisiert, das zu medialer Hyperplasie und endothelialer Barriere-Dysfunktion führt. Die partielle EC-Ablösung entlang der Aorta intima begleitete den Verlust des Zell-Zell-Kontakts und die Verbesserung der Zellvorsprünge. Entsprechend wurde die endotheliale Barrierefunktion signifikant beeinträchtigt, was die mitogenempfindlichen Signalwege stimulierte, was zur Proliferation von VSMCs und Verdickung der Gefäßwand führte. Die Stärken dieses Modells .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Augenschmiermittel	Dechra	17033-211-38	Pharmazeutische Wirkstoffe
Isofluran	VetOne	502017	Pharmazeutische Wirkstoffe
Carprofen	Zoetis	26357	Pharmazeutische Wirkstoffe
Präzisionsverdampfer	Summit Medical	10675	Chirurgisches Zubehör
Holzkohlefänger	Bickford Inc.	80120	Chirurgisches Zubehör
Isothermisches Pad	Harvard Apparatus	50-7053-R	Chirurgisches Zubehör
Steriler Applikator mit Wattespitze	Fisher Scientific	23-400-124	Chirurgisches Zubehör
4-0 resorbierbares monofiles Nahtmaterial	Ethicon, Inc	J310	Chirurgisches Zubehör
5-0 nicht resorbierbares monofiles Nahtmaterial	Ethicon, Inc	1666	Chirurgisches Zubehör
21 Gauge x 1 Zoll Nadel	BD Biosciences	305165	Chirurgisches Zubehör
25 Gauge x 1 Zoll Nadel	BD Biosciences	305125	Chirurgisches Zubehör
Trockensterilisator	Cellpoint	7770	Chirurgischer Bedarf
Feine Schere	Fine Science Tools	14058-09	Chirurgische Instrumente
Adson-Zange	Fine Science Tools	11006-12	Chirurgische Instrumente
Dumont #5 Feinzange	Fine Science Tools	11254-20	Chirurgische Instrumente
Vannas Federschere 3 mm Schneide	Fine Science Tools	15000-00	Chirurgische Instrumente
Nadeltreiber	Fine Science Tools	91201-13	Chirurgische Instrumente
Skalpellgriff #4	Fine Science Tools	10004-13	Chirurgische Instrumente
Skalpellklingen #10	Fine Science Tools	10010-00	Chirurgische Instrumente
PBS	Lonza	17-516F	Reagenzien für die Gewebeverarbeitung
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129	Reagenzien für die Gewebeverarbeitung
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148	Reagenzien für die Gewebeverarbeitung
Modellierwachs	Bego	40001	Reagenzien für die Gewebeverarbeitung
OCT-Verbindung	Tissue-Tek Sakura	4583	Reagenzien für Gewebeaufbereitung
Mayer'sche Hämatoxylin-Lösung	Sigma-Aldrich	MHS16	Reagenzien für die immunhistologische Analyse
Eosin Y-Lösung alkoholisch	Sigma-Aldrich	HT110316	Reagenzien für die immunhistologische Analyse
Elastin-Färbekit	Sigma-Aldrich	HT25A	Reagenzien für die immunhistologische Analyse
Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit	Invitrogen	C10337	Reagenzien für die immunhistologische Analyse
Anti-Erk1/2-Antikörper	Cell Signaling Technology	4695	Reagenzien für die immunhistologische Analyse
Anti-Phospho-Erk1/2-Antikörper	Cell Signaling Technology	4370	Reagenzien für die immunhistologische Analyse
Anti-p27kip1-Antikörper	Cell Signaling Technology	3698	Reagenzien für die immunhistologische Analyse
Trichloressigsäure	Sigma-Aldrich	T9159	Reagenzien für die immunhistologische Analyse