Methodenartikel

Lokale Feldfluoreszenzmikroskopie: Imaging zellulären Signalen in Intact Herzen

DOI:

10.3791/55202

⸱

8. März 2017

 ,  ,  , 
1School of Natural Sciences, University of California, Merced, 2Centro de Investigaciones Cardiovasculares, Universidad de la Plata and Conicet, 3Facultad de Ingenieria, Universidad Nacional de Entre Rios, 4Department of Physiology, Midwestern University, 5School of Engineering, University of California, Merced

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Im Herzen koordinieren molekularen Ereignisse, die elektrische und kontraktile Funktion des Organs. Eine Reihe von lokalen Feldfluoreszenzmikroskopie-Techniken präsentiert hier ermöglicht die Aufzeichnung von zellulären Variablen in intakten Herzen. Identifizieren von Mechanismen, um die Herzfunktion zu definieren, ist wichtig für das Verständnis, wie das Herz unter pathologischen Situationen funktioniert.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Im Herzen sind molekulare Signalstudien in der Regel in isolierten Myozyten durchgeführt. Jedoch können viele pathologische Situationen wie Ischämie und Arrhythmien nur vollständig an der gesamten Organebene verstanden werden. Hier stellen wir die spektroskopische Technik der lokalen Feldfluoreszenzmikroskopie (LFFM), die die Messung von zellulärer Signale im intakten Herzen ermöglicht. Die Technik basiert auf einer Kombination aus einer Langendorff perfundierten Herzen und Lichtleitfasern Fluoreszenzsignale aufzuzeichnen. LFFM hat verschiedene Anwendungen auf dem Gebiet der Herz-Kreislauf Physiologie des Herzens unter normalen und pathologischen Bedingungen zu studieren. Mehrere können Herz-Variablen mit unterschiedlichen Fluoreszenzindikatoren überwacht werden. Dazu gehören cytosolischen [Ca 2+], intra-Retikulum [Ca 2+] und Membranpotentialen. Die exogenen Fluoreszenzsonden werden angeregt und die emittierte Fluoreszenz mit drei verschiedenen Anordnungen von LFFM Epifluoreszenz-Technik nachgewiesens in diesem Papier. Die zentralen Unterschiede zwischen diesen Techniken sind die Art der Lichtquelle für die Anregung verwendet, und auf dem Weg das Anregungslicht moduliert wird. Der gepulste LFFM (PLFFM) verwendet Laserlichtimpulse, während eine kontinuierliche Welle LFFM (CLFFM) kontinuierliches Laserlicht zur Anregung verwendet. Schließlich Leuchtdioden (LEDs) als eine dritte Lichtquelle verwendet. Diese nicht-kohärente Anordnung gepulst LED-Fluoreszenzmikroskopie (PLEDFM) genannt.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Herz ist das zentrale Organ des kardiovaskulären Systems. Die Kontraktion des Herzens wird durch eine Erhöhung der intrazellulären initiiert [Ca 2+]. Die Beziehung zwischen der elektrischen Erregbarkeit und Veränderungen der intrazellulären Ca 2+ Freisetzung wurde 1 in enzymatisch dissoziierten Zellen historisch untersucht, 2. Jedoch sind Herzzellen elektrisch, metabolisch und mechanisch gekoppelt 3, 4. Wenn isoliert, sind die Myozyten nicht nur physisch entkoppelt, sondern Myozyten aus verschiedenen Schichten werden während ....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll und alle Mäuse Behandlung wurde von der UC Merced Institutional Animal Care und Use Committee (Nr 2008-201) zugelassen. Experimente mit Sittiche wurden im Jahr 1999 nach den allgemeinen Richtlinien für die Nutzung von Tieren festgelegt von der wissenschaftlichen Kommission des venezolanischen Institut für wissenschaftliche Forschung (IVIC) durchgeführt.

1. Langendorff-Set Up Vorbereitung

  1. Bereiten Tyrode - Lösung die folgenden Konzentrationen an gelöstem Stoff in mM enthält: 140 NaCl, 5,4 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 0,33 Na 2 HPO 4, 10 Glucose, 10 HEPES. Der pH-Wert der T....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AP und Ca 2+ Transienten in Endokard und Epikard

Um Signale über die Ventrikelwand zu vergleichen, eine Faseroptik in das Endokard und das andere in das Epikard angeordnet. Vergleichen der Morphologie eines AP vom Endokard mit einer aus dem Epikard aufgezeichnet ist der beste Weg, um die transmurale Funktion zu beurteilen. Die ventrikuläre Wand ist sehr heterogen, und .......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Papier wird bei der Beschreibung der lokalen Feldfluoreszenztechniken zentriert die Funktion von Herzmuskelzellen zu bewerten ex vivo. Die Untersuchung dieser Zellen in einer gekoppelten Umgebung ist nicht nur physiologisch, sondern ist auch sehr geeignet für die Beurteilung der Organebene Pathologien. Die zelluläre Ereignisse elektromechanischen Kopplung (ECC) zugrunde liegen kann mit dem Einsatz von molekularen Sonden auf der ganzen Organebene ausgewertet werden , die 2+ Dynamik intrazellulä.......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Dr. Alicia Mattiazzi für kritische Diskussion der vorliegenden Arbeit. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von NIH (R01 HL-084487) zu ALE unterstützt.

....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
NatriumchloridSigma7647-14-5
D-(+)-GlukoseSigma50-99-7
KaliumchloridSigma7447-40-7
HEPESSigma7365-45-9
NatriumphosphatSigma10049-21-5
CalciumchloridlösungSigma10043-52-4
Magnesiumchlorid LösungSigma7786-30-3
NatriumhyrdoxidSigmaS-8045
0,2 μ m Nylon-MembranfilterWhatman7402-004
Verteiler MPPWarner64-0216 
21G1.5 Präzisions-GleitnadelB-D305167
Schwarz Geflochtene Seidenschnur (nicht resorbierbares chirurgisches Nahtmaterial)AllMech TechLOOK-SP105
Heparin-Natrium-Injektion 1000USP/mLAllMech TechNDC63323-540-11
DMSO D8779Sigma67-68-5
BlebbistatinSigma856925-71-8
Pluronic F-127 20%ige LösungBiotium59004
Materflex C/L SchlauchpumpeCole-Parmer77122-26
Isostim StimulatorWorld Precision InstrumentsA320RC
Waveform-GeneratorTeledyne LecroyWaveStation 2012
Ultraschallreiniger FS20Fisher Scientific1533530
Tygon-Schlauch ID: 1/32" OD: 3/32" Wand 1/32"Komponentenversorgung TET-031A
Tygonschlauch ID: 3/32" OD: 5/32" Wand 1/32"KomponentenversorgungTET-094A
Adapter Luer-Lock auf 3-Wege-VentilCole-ParmerEW-31200-80
T-Adapter und KunststoffverschraubungenCole-Parmer6365-90
KunststoffklemmeWaterZoo2465
PeltierTE TechnologyTE-127-2.0-2.5
Rhod-2AMThermoFisherScientific R1245MP
Di-8-ANEPPSThermoFisher ScientificD3167
Mag-Fluo-4AMThermoFisher ScientificM14206
AkupunkturnadelnLHASATC1.20x13
60 mL BD-Spritze mit Luer-LokFisher Scientific14-820-11
LabViewNational Instruments Speed vacuum
Eppendorf VagufugeFisher Scientific07-748-13
Digitale Signalverarbeitungsschaltung DSP TMS 320Texas Instrument
Duchoitischer Langpassspiegel 567 nmThorLabsDMLP567L
Objektiv 10X NA 0,25 DIN AchromatischEndliches Intl StandardobjektivEdmund OpticsLager# 33-437
Objektiv 20X NA 0,40 DIN Achromatisch Endliches Intl StandardobjektivEdmund OpticsLager# 33-438
Langpass Farbglasfilter 590 nm ThorLabsFGL590
Green Nd-YAG Laser 532 nm, 500 mW
Mikromanipulator für LaserSiskiyouMX130R
Multimode Faseroptik 200 & Mikro; m NA 0.39ThorLabsFT200UMT
LEDs blauLumiledsL135-B475003500000
LEDs grünLumiledsL135-G525003500000
Würfelstrahlteiler, unpolarisierendThorLabsBS007
36" Länge, Schwalbenschwanz Optische SchieneEdmund Optics54-402
2,5" Breite, SchwalbenschwanzträgerEdmund Optics54-404
0,75" Verfahrweg, MikrometertischEdmund Optics37-983
Schwalbenschwanz optische Schiene 3"ThorLabsRLA075/M
Schwalbenschwanzschienenträger 1"ThorLabsRC1
Avalanche Fotodiode Helix 902Digi-KeyHELIX-902-200
Objektivhalter XY Translator& nbsp;ThorLabsST1XY-S
Aluminium-Steckbrett 6" x 6"ThorLabsMB6
Nexus otpischer Tisch 4' x 6'ThorLabsT46HK
Zylinderschrauben aus EdelstahlThorLabsHW-KIT5/M
Acryl  BlechHome Depot/Lowes
Sylgard Silikonelastomer-KitDow CorningSylgard 184
Epoxid-GelWalmart/Home Depot2-teilig 5 min clr 1oz
21G1.5 Präzisions-GleitnadelB-D305167
23G Präzisions-GleitnadelB-D305145
Montagesockel, 25 mm x 75 mm x 10 mmThorLabsBA1/M
Drahtregale 36"AleraAALESW59PO36SR
DrahtregaleAleraALESW582424SR
Pfosten- und WinkelklemmeThorLabsSWC/M-P5
Glasspritze für FärbekammerWheatonW851020
GummistopfenHome Science ToolsCE-STOP01C

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fabiato, A., Fabiato, F. Contractions induced by a calcium-triggered release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells. J Physiol. 249 (3), 469-495 (1975).
  2. Mitra, R., Morad, M.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Bildgebung des intakten HerzensLangendorff Perfusionfluoreszierende Indikatorenzytosolisches CalciumMembranpotenzialgepulstes LFFMkontinuierliches LFFMPLEDFM TechnikMessung von Herzsignalen

Verwandte Artikel