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Methodenartikel

Visualisierung von Zellzyklus-Variationen und Bestimmung der Nukleation in postnatale Kardiomyozyten

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DOI:

10.3791/55204

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24. Februar 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiology I, University of Bonn

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Um die Zellteilung von Zellzyklusvariationen in Kardiomyozyten zu unterscheiden, präsentieren wir Protokolle mit zwei transgenen Mauslinien: Myh6-H2B-mCh-transgene Mäuse, zur eindeutigen Identifizierung von Kardiomyozytenkernen, und CAG-eGFP-Anillin-Mäuse, zur Unterscheidung der Zellteilung von Zellzyklusvariationen.

Zusammenfassung

Kardiomyozyten sind anfällig für Variationen des Zellzyklus, wie z.B. Endoreduplikation (fortlaufende Runden der DNA-Synthese ohne Karyokinese und Zytokinese) und azytokinetische Mitose (Karyokinese, aber keine Zytokinese). Solche atypischen Zellzyklusvariationen führen eher zu polyploiden und mehrkernigen Zellen als zu Zellteilung. Daher ist es für die Bestimmung des Herzumsatzes und der Regeneration von entscheidender Bedeutung, die Kardiomyozytenkerne, die Anzahl der Zellkerne pro Zelle und ihren Zellzyklusstatus korrekt zu identifizieren. Dies gilt insbesondere für die Verwendung von nukleären Markern zur Identifizierung der Zellzyklusaktivität, wie z. B. Thymidinanaloga Ki-67, PCNA oder pHH3. Im Folgenden stellen wir Methoden vor, um Kardiomyozyten und ihre Kernkraft zu erkennen und ihre Zellzyklusaktivität zu bestimmen. Wir verwenden zwei veröffentlichte transgene Systeme: die transgene Mauslinie Myh6-H2B-mCh, zur eindeutigen Identifizierung von Kardiomyozytenkernen, und die CAG-eGFP-Anillin-Mauslinie, zur Unterscheidung von Zellteilung und Zellzyklusvariationen. In Kombination erleichtern diese beiden Systeme die Untersuchung der kardialen Regeneration und Plastizität.

Einleitung

Die korrekte Identifizierung von Kardiomyozyten Kerne und der Zellzyklusstatus ist von entscheidender Bedeutung für die Bestimmung der Herzmuskel Umsatz und Regeneration. Dies gilt insbesondere für die Nutzung der Kernmarker wie pHH3, Ki-67, oder Thymidin-Analoga, für die Zellzyklusaktivität identifiziert. Da die proliferative Kapazität von erwachsenen Säugetieren Kardiomyozyten ist sehr klein 1, eine falsche Identifizierung eines Kerns für eine positive Proliferationsmarker eines Kardiomyozyten Kern einen entscheidenden Unterschied in dem Ergebnis eines Proliferationsassay machen könnte. Außerdem sind Kardiomyozyten anfällig für Schwankungen in den Zellzyklus, wie Endoreduplikation und acytokinetic Mitose, die in polyploiden und mehrkernige Zellen führen, anstatt in der Zellteilung. Zu diesem Zweck ist die Interpretation der Antikörperfärbung gegen gemeinsame Zellzyklus-Marker in allen Fällen nicht schlüssig.

Hier präsentieren wir Methoden für die lineare forwa rd Anerkennung der Maus Kardiomyozyten und ihre Nuklearität in nativen isolierten Zellen und dicke Gewebeschnitte bei postnatalen und adulten Stadien durch die eindeutige Identifizierung ihrer Kerne. Zu diesem Zweck wird eine transgene Mauslinie mit Kardiomyozyten-spezifische Expression eines Fusionsproteins bestehend aus humanem Histon H2B und mCherry unter der Kontrolle des Promotors Myh6 (Myh6-H2B-MCH) 2 verwendet. Kreuz-Zucht Mauslinie mit einer transgenen Proliferation Indikator Mauslinie, in denen die Expression eines eGFP-Anillin Fusionsprotein unter der Kontrolle des allgegenwärtigen Huhn-Aktin-Promotor mit einem CMV-Enhancer (CAG-eGFP-Anillin), ermöglicht die Bestimmung der Zellzyklus-Status. Das Gerüstprotein Anillin wird in Zellzyklus - aktiven Zellen 3 und seine differentielle subzelluläre Lokalisierung während des Zellzyklus ermöglicht Live-tracking Zellzyklusprogression mit einer hohen Auflösung von M-Phase spezifisch exprimiertef "> 4. Daher kann der doppelt transgenen Mäuse verwendet werden , um zwischen proliferierenden Kardiomyozyten und diejenigen zu unterscheiden , die Zellzyklus - Variationen unterzogen werden . Dies erweist sich als besonders nützlich beim Screening auf die Proliferation induzierenden Substanzen in vitro.

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Protokoll

Alle Verfahren dieses Protokolls Tiere waren in Einklang mit den ethischen Normen der Universität Bonn und mit den Leitlinien der Richtlinie 2010/63 / EU des Europäischen Parlaments über den Schutz von Tieren für wissenschaftliche Zwecke erfüllt.

1. In - vitro - Visualisierung von Zellzyklusaktivität in postnatale Kardiomyozyten

  1. Die postnatale Kardiomyozyten Dissoziation
    1. Pre-experimentelle Präparate
      1. Bereiten Kulturmedien (IMDM, 1% Penicillin / Streptomycin, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren, 0,1% β-Mercaptoethanol); Medium 1: add FCS bis 2%; Medium 2: fügen FCS bis 20%.
      2. Mantel eine 96-Well - Kulturschale (Halbwachstumsbereich: 15 mm 2) mit 0,1% Gelatine in PBS - Lösung.
    2. Herz-Dissektion
      1. Bereiten Sie eine Petrischale mit 15 ml PBS und speichern Sie es auf Eis. Sterilisieren zwei Pinzette und eine kleine Schere, indem sie in einem trockenen Glasperlen Sterilisator setzen.
      2. Sacrifice Neugeborenen transgenen Mäusen (CAG-eGFP-Anillin / Myh6-H2B-MCH) durch Enthauptung. Öffnen Sie den Thorax, sezieren das Herz aus, wie in Ehler et al. , 2013 (J Vis Exp .; (79):. 50154 doi: 10,3791 / 50154), und es zu dem eiskalten PBS übertragen. Fahren Sie mit dem nächsten Maus.
      3. Bei der Verwendung von nicht-homozygote Brutpaare, identifizieren die transgenen Herzen mit einem Fluoreszenzmikroskop. Legen Sie die Herzen in PBS unter einem Fluoreszenzmikroskop. Überprüfen Sie für eGFP-Anillin Ausdruck (Bsp .: 488 nm; Em .: 509 nm) und H2B-mCh Ausdruck (Bsp .: 587 nm; Em .: 610 nm) mit den entsprechenden Filtersätzen.
    3. cardiomyocyte Isolation
      1. Distanzieren die ausgewählten Herzen durch die neonatale Herz Dissoziation Kit. Inkubieren der Enzymmischung 1 bei 37 ° C für 5 min. Zur Gewinnung von 1 ml der fertigen Enzymmischung, fügen Sie 945 ul Enzymmischung 1 bis 55 & mgr; l Enzym-Mix 2.
      2. Übertragen Sie bis zu 4 Herzen von P1 - P3 Mäuse oder bis zu 2 Herzen von P4 - P6 Mäuse in ein 1,5-ml-reaction Röhrchen mit 1 ml Enzymmischung und schneiden Sie das Herz in kleine Stücke mit einer Schere. Die Lösung wird in 15 ml Reaktionsröhrchen.
      3. für 15 min bei 37 ° C inkubieren. Um den Kontakt zwischen dem Gewebe und den Enzymen zu maximieren, stellen die 15-ml-Röhrchen nahezu horizontal in den Inkubator. Mischen durch Pipettieren von 5 bis 10 mal nach oben und unten mit einer 5-ml-Pipette. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
      4. 7.5 ml Medium 2 (20% FCS), um die Enzymreaktion zu stoppen. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70-um-Zelle Sieb. Spülen Sie die Zelle Sieb mit 3 ml Medium 2.
      5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 × g für 15 min und den Überstand verwerfen. Resuspendieren des Pellets in 500 ul Medium 1; der roten Blutkörperchen Lyse ist nicht für weitere Experimente erforderlich. Pipette 10 ul der Zellsuspension in eine Zelle Zählkammer bestimmen und die Anzahl der Zellen.
      6. Für eine 96-Well-Platte: Samen 10.000 Zellen pro Vertiefung in 120 & mgr; l Medium 1 (2% FCS). Ortdie Zellen in einen Inkubator (37 ° C und 5% CO 2) und unmittelbar auf die Transfektion erfolgen.
  2. Die Transfektion von Neugeborenen Kardiomyozyten mit siRNAs oder miRNAs
    1. Wischen Sie eine Bank mit RNase Dekontaminationslösung, um die RNasen entfernen. Reinigen Sie das folgende Material mit RNase Dekontaminationslösung: 10 & mgr; l, 100 & mgr; l und 200 & mgr; l Pipetten und ein Eisschrank. Thaw siRNA Lager Aliquots (100 & mgr; M) auf dem Eis.
    2. Bereiten Sie 2 uM Arbeitsvorräte an si / miRNAs in reduziertem Serum-Medium (98 & ​​mgr; l reduziert Serum-Medium + 2 & mgr; l von siRNA 100 uM Lager). Die Arbeits Aktie sollte noch am selben Tag verwendet werden. Das Einfrieren wird nicht empfohlen.
    3. Hinzufügen 4 ul der 2 uM Lager bis 6 & mgr; l der reduzierten Serummedium auf eine 0,5-ml-Reaktionsrohr (Menge für eine 96-well; final si / miRNA-Konzentration in 140 ul: ~ 57 nM). Wählen eines geeigneten Volumens für die Anzahl der Vertiefungen mit einem bestimmten Si / miRNA transfiziert werden.
    4. Bereiten Sie einen Master-Mix des Transfektionsreagenz. Verwenden Sie 10 & mgr; l (0,6 ul Transfektionsreagenz + 9,4 ul reduzierten Serum-Medium) für jede Vertiefung (96 Vertiefungen insgesamt).
    5. Fügen Sie die si / miRNA mischen, um die Transfektion Reagenzienmix. Inkubieren für 5 min auf Eis. Pipettieren 20 & mgr; l in jede Vertiefung. Inkubieren der Zellen für 48 h bei 37 ° C und 5% CO 2 und dann das Medium in jeder ersetzen gut mit 120 ul Medium 1. Nach 24 h oder mehr, gehen zur Fixierung und Immunfluoreszenzfärbung.
  3. Die Fixierung und Immunfluoreszenzanfärbung
    1. Entfernen Sie das Medium und die Zellen werden einmal mit PBS. Decken Sie die Zellen mit 4% Formaldehydlösung für 20 min. Nehmen Sie die Formaldehyd-Lösung aus und die Zellen waschen einmal mit PBS und dann bedecken sie mit PBS zur Lagerung oder fahren Sie mit Immunfärbung.
    2. Inkubieren mit primärem Antikörper (Konzentration nach den Angaben des Herstellers) in 0,2% Triton-X und 5% Eselserum für mindestens 2 h.Wenn Anfärben für α-Actinin (Verdünnung 1: 400; monoklonaler anti-α-Actinin), Beize über Nacht bei 4 ° C.
    3. Entfernen Sie den primären Antikörper und waschen Sie 3-mal mit PBS. Verdünnen Sie die sekundären Antikörper in Hoechst Lösung 1: 400 und Inkubation für 1 h bei RT vor Licht geschützt. Entfernen des Antikörpers, Waschen mit 3 x PBS, und decken die Zellen mit PBS für die Lagerung bei 4 ° C.
  4. Die konfokale Mikroskopie und
    1. Verwenden Sie ein Konfokalmikroskop für die Bildaufnahme. Öffnen Sie die Imaging-Software. Öffnen Sie "a1plus Einstellungen" und aktivieren Sie die Kästchen für Ch1, Ch2 und Ch3. Set Ch1 bis DAPI, Kanal 2 zu eGFP, Ch3 zu Cy3 und Ch4 zu Cy4, indem Sie auf das Pulldown-Menü klicken.
      1. Für jeden Kanal, klicken Sie auf HV und setzen Sie ihn auf 80 durch den Schieberegler verwenden. Stellen Sie den Offset auf 0 durch die Schieberegler verwenden, und klicken Sie auf die Schaltfläche "Home" die Pinhole zur Ausgangsposition zu setzen. Stellen Sie die Scangröße auf 1.024 x 1.024 auf dem Pull-Down-Menü klicken.
      2. Klicken Sie auf Optimieren zu öffnen"XYZ Größe Setup" Fenster. Überprüfen Sie "Perfect Voxel" Box unter "Empfohlene Schritt (z)". Erhöhen Sie die Laserintensitäten, bis das Bild weder unterbelichtet noch überbelichtet ist.
        HINWEIS: Zum Beispiel; Ch1 (DAPI): 16%, Ch2 (eGFP): 12%, CH 3 (Cy3): 100%, Ch4 (Cy5): 1%. Stellen Sie den Offset für alle Kanäle auf 0.
    2. Nehmen Sie Bilder mit einem 20x-Objektiv (200-facher Vergrößerung). Scannen Sie ein großes Bild , das aus Kachelbildern (zB 3 x 3).
      1. In der Imaging-Software, gehen Sie auf "Erfassen" und "Scan große Bild" aus dem Pull-Down-Menü wählen. Unter "Area", wählen Sie "aktuelle Position in der oberen linken Ecke" aus dem Pull-Down-Menü und setzen Sie "Anzahl der Felder in X und Y" bis 3 x 3. Klicken Sie auf "Scan".
  5. Bildanalyse
    1. Definieren die Anzahl der Kerne Kardiomyozyten durch Zählen H2B-Ch-Signale und die Anzahl der Kardiomyozyten durch α-Actinin-Signale zu zählen.
      1. Klicken Sie auf "Messen" und "Manuelle Messung" aus dem Pull-Down-Menü wählen. Wählen Sie "Counts" aus dem nächsten Pulldown-Menü. Klicken Sie auf Kerne mit H2B-mCh Signale, wodurch die Kennzeichnung und sie zu zählen. Haben gleiche die für α-Actinin-positiven Zellen die Anzahl der Kardiomyozyten zu bekommen.
    2. Graf S / G2-Phase Kardiomyozyten mit nuklearen eGFP-Anillin Signale (eGFP-Anillin + / H2BmCh + Kerne). Klicken Sie auf "Messen" und "Manuelle Messung" aus dem Pull-Down-Menü wählen. Wählen Sie "Counts" aus dem nächsten Pulldown-Menü. Markieren Sie die Kerne mit eGFP-Anillin Signale und H2B-mCh Signale durch Anklicken.
    3. Zähle die Kardiomyozyten mit Mitose spezifischen eGFP-Anillin Signale (zB 1F und G), wie zytoplasmatische Signale, kontraktile Ringe und midbodies. Klicken Sie auf "Messen" und "Manuelle Messung" aus dem Pull-Down-Menü wählen. Wählen Sie "Counts" von der nächsten pulFalldown-Menü. Mark Kardiomyozyten mit Mitose spezifischen eGFP-Anillin Signale (zB 1F und G) zytoplasmatische Signale, Kontraktionsringe und midbodies indem Sie auf sie.

2. Bestimmung der Nukleation in adulten Kardiomyozyten von Langendorff Distanzierung und dicke Gewebeschnitte

  1. Isolierung von adulten Kardiomyozyten von Langendorff-Dissoziation
    1. Vorbereitungen vor dem Herz-Dissektion
      1. Füllen Sie eine Insulinspritze (30-Gauge-Nadel) mit Heparin (20 Einheiten / g Körpergewicht). Fassen Sie die Maus durch das Genick des Halses. Heben und drehen rückwärts, um die Maus, um den Bauch zur Injektion zu belichten.
      2. Führen Sie eine intraperitoneale Injektion. Setzen Sie die heparinisierte Maus wieder in den Käfig und warten Sie mindestens 15 Minuten vor der Herz-Dissektion beginnt. Spülen und lüften Sie den Langendorff-Apparatur mit von 5 bis 10 ml Perfusionspuffer (Perfusions-Puffer: 135 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2,5 mM HEPES, 5 mM Glucose und 25 mM BDM in ddH 2 O, auf pH 7,4 mit NaOH) einzustellen.
    2. Herz-Dissektion
      1. Bereiten Sie eine 10-cm-Petrischale mit kaltem (4 ° C) PBS und legen Sie es auf Eis. Füllen und lüften Sie eine 1-ml-Spritze mit einer Kanüle (20 Gauge) verbunden mit PBS. Befestigen Sie die Kanüle mit Knetmasse an der Grenze der Petrischale. Legen Sie die Kanülenspitze leicht unter dem PBS Oberfläche.
      2. Opfere die Maus durch Genickbruch. Wischen Sie den Bauch mit 70% Ethanollösung. Einen Einschnitt aus der Mitte des Bauches bis zum Brustbein mit chirurgischen Schere. Entfernen Sie die Membran und schneiden Sie den Thorax bilateral mit chirurgische Scheren.
      3. Heben Sie und befestigen Sie das Brustbein mit einer 20-Gauge-Nadel, öffnen Sie die Brusthöhle und sanft das Herz mit anatomischen Pinzette fassen. Heben Sie das Herz und nehmen Sie ihn aus der Lunge und Gefäße durch die Gefäße des Ausflusstraktes zu schneiden.
        Hinweis: Um die Aorta identifizieren, positionieren Sie das Herz mitseine Bauchseite nach oben. Dies verringert den Abstand zwischen den beiden Vorkammern, so die Aorta mit seinen Zweigen zwischen den Vorhöfen zu finden. Abhängig von der individuellen Herz-Architektur können die Äste entfernt werden, wenn der Hauptzweig der Aorta noch lang genug ist.
      4. Übertragen Sie das Herz auf die 10-cm-Petrischale gekühlt PBS, das (siehe Schritt 2.1.2.1). Kanülieren das Herz durch die aufsteigende Aorta auf einer G20x1 ½ Injektionskanüle gezogen, die durch einen oszillierenden Multiwerkzeug abgestumpft wurde Gewebeschäden zu vermeiden. Befestigen Sie die Aorta mit einem Gewinde an der Kanüle. Spülen Sie leicht das Herz mit PBS, indem Sie den Spritzenkolben überschüssiges Blut zu entfernen. Eine leichte Vergrößerung des Herzens sollte sichtbar sein.
    3. Langendorff-Herz Dissoziation
      1. Schließen Sie den kanülierten Herz schnell an den Luer-Lock-Adapter an der Langendorff Perfusionsgerät. Perfundieren das Herz mit 30 ml oxygeniertem Perfusionspuffer bei 37 ° C für 5 min mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 Tropfen / s. the Strömungsgeschwindigkeit kann durch Regulieren der O & sub2 ; -Strom innerhalb des Langendorff - Apparatur unter Verwendung des Druckminderventils (Druck zwischen 0 und 200 mbar) angepasst werden.
      2. Bereiten Sie die Verdauung Puffer unmittelbar vor dem Gebrauch: Perfusionspuffer mit 6 U Kollagenase B, 10.000 Einheiten Trypsin und 50 & mgr; M CaCl 2. Entfernen der Puffer Perfusion und starten die enzymatische Verdau durch Zugabe von 30 ml warmem (37 ° C) und oxygenierte Verdauungspuffer.
        HINWEIS: Die Menge an Kollagenase B muss titriert werden in Abhängigkeit von der Aktivität verschiedener Chargen.
      3. Stellen Sie die Strömung auf eine Geschwindigkeit von 1 Tropfen / s und verdauen das Herz für 10 - 13 min. Zur Vermeidung von Kontaminationen, nicht das Ausströmen wieder verwenden. Übertragen, um das Herz zu einer 10-cm-Petrischale mit 5 ml Verdauungspuffer. Präparieren des Gewebes manuell mit einer Pinzette durch das Herz mit einer Zange halten und mit dem anderen Paar, das Herz in kleine Stücke zu zerreißen.
        HINWEIS: Bei diesem Schritt kann die Vorhöfe getrennt werden, in kleineStücke (mit Irisschere) und für 30 min in 750 & mgr; l Verdauungspuffer in den Inkubator bei 37 ° C zu erhalten, um isolierten atrialen Zellen verdaut. Um reine atriale Kardiomyozyten, pipettieren nach oben und unten mehrmals mit einer 1-ml-Pipette. Stoppen Sie die Enzymreaktion durch 750 & mgr; l Stopplösung hinzugefügt wird.
      4. Stoppen Sie die Verdauung durch Zugabe von 5 ml Stopplösung (Perfusions - Puffer mit 5% FBS und 50 & mgr; M CaCl 2). Verwendung einer serologischen Pipette, filtern die Zellsuspension durch ein Zellsieb 100 um und sammle die Zellen in einer 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die gefilterte Zellsuspension bei 80 × g für 1 min bei Raumtemperatur.
      5. Überstand verwerfen und sanft das Zellpellet in 10 ml-Stop-Lösung unter Verwendung einer 10 ml serologische Pipette resuspendieren. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 80 × g für 1 min bei Raumtemperatur.
      6. Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 1 ml Kulturmedium (IMDM mit 20% FCS, 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 50 ug / ml von jeweils Penicillin und Streptomycin und 0,1 mM β-Mercaptoethanol) für die Kultivierung. Alternativ gehen 2.2, "Immunfluoreszenzanfärbung" zu treten und die Zellen zu beheben.
      7. Zur Befestigung auf Platten mit 24 Vertiefungen, Platten 10.000 der isolierten Zellen pro Vertiefung auf 8 & mgr; g / mL Laminin beschichteten Deckgläschen in 24-Well - Platten mit 500 & mgr; l Kulturmedium bei 37 ° C und 5% CO 2 für mindestens 3 h .
  2. Immunfluoreszenzanfärbung auf Langendorff-isolierte Kardiomyozyten in der Schwebe
    1. Fix Langendorff-isolierten Kardiomyozyten in 1 ml 4% PFA in PBS, pH 7,4, für 15 min bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 800 × g für 2 Minuten bei Raumtemperatur, entfernen Sie das Fixiermittel und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS.
    2. Resuspendieren der Fest Kardiomyozyten in 1 ml PBS und entweder weiter mit der Immunfluoreszenzanfärbung oder speichern sie in 500 & mgr; l PBS pro Vertiefung aufeine 24-Well-Platte bei 4 ° C. Übertragen, die einen Teil der Zellsuspension (~ 100 bis 200 & mgr; l) in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 800 × g für 2 Minuten bei Raumtemperatur und den Überstand verwerfen.
    3. Permeabilisieren, Block- und färben die Zellen mit dem primären Antikörper gegen α-Actinin durch Zugabe von 200 & mgr; l des primären Antikörpers, verdünnt 1: 400 in PBS mit 0,2% Triton X-100 und 5% Eselserum für 1 h bei Raumtemperatur.
    4. Zentrifuge bei 800 × g für 2 Minuten bei Raumtemperatur und den Überstand verwerfen. Waschen des Zellpellets mit PBS und Zentrifugation bei 800 × g für 2 min bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen und Inkubation in 200 ul Alexa-Fluor-konjugierten sekundären Antikörper (anti-Maus-IgG1), verdünnt 1: 400 in Hoechst-Farbstoff (Arbeitslösung: 1 & mgr; g / ml) für 1 h bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt.
    5. Zentrifuge bei 800 × g für 2 Minuten bei Raumtemperatur und den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt. Schützen Sie die Probe vor Licht. Resuspend die Zellen in 200 bis 500 & mgr; l PBS und Transfer 100-300 & mgr; l der Zellsuspension in eine Vertiefung einer Mikroskopiekammer. Schließen Sie den Deckel der Kammer und speichern die Zellen bei 4 ° C bis zur Bildgebung. Vor Licht schützen.
  3. Die Analyse der Nuklearität von Langendorff-isolierte Kardiomyozyten
    1. Nehmen Sie Bilder von α-Actinin-gefärbten Kardiomyozyten mit einem 25X Ziel, zu einer 250-facher Vergrößerung entspricht. Zählen Sie die Anzahl der H2B-mCh + Kerne nur in den Kardiomyozyten, die regelmäßig befleckt von α-Actinin und zeigen typische stabförmige Morphologie und sind daher angenommen, intakt zu sein.
    2. Zählen Sie mindestens 100 Kardiomyozyten aus drei verschiedenen Herzen. Berechnen Sie die Prozentsätze der einkernigen, zweikernigen und dreikernigen Kardiomyozyten.
      HINWEIS: In der Regel sollten zweikernigen Zellen machen etwa 80 bis 90%, während die dreikernigen Zellen und solche mit größerer Zahl von Kernen sind selten (<1% in Langendorff-isolierte Kardiomyozyten, <3% in dicke Scheiben). Atriale Kardiomyozyten sind wesentlich kleiner als ventrikuläre Kardiomyozyten. Typischerweise machen einkernigen Zellen 90% der Gesamtbevölkerung aus.
  4. Isolation, Fixierung und Kryokonservierung von adulten Herzen als Vorbereitung für dicke Scheiben
    1. Zubauen eine Perfusionsapparatur zur Fixierung mit einer 50-ml-Spritze mit einem 3-Wege-Hahn mit einer Heidelberger Verlängerungsrohr verbindet, und eine zweite 3-Wege-Hahn. Fixieren die Spritze in einem Gestell in der Weise, dass Durchfluss durch Schwerkraft freigegeben wird. Füllen Sie das System mit 15 ml PBS.
    2. Führen Sie die Schritte 2.1.2.1-2.1.2.4, "Herz Vorbereitung." Schließen Sie das G20x1 ½ Injektionskanüle mit dem Herzen zu den Luer-Lock-Adapter des blasenfreien PBS-gefüllten Perfusionsgerät und perfuse es mit PBS. Füllen Sie das System mit 10 bis 15 ml 4% Formaldehyd in PBS, die dann durch das Herz perfundiert wird. Tauch beheben, um das Herz in 4% Formaldehyd-Lösung über Nacht.
    3. Ersetzen Sie die 4% FormaldehydLösung mit PBS und das Herz in PBS auf einem Horizontalschüttler bei 150 Upm für 8 h bei Raumtemperatur waschen. Tauschen Sie die PBS mit 20% Saccharose-Lösung das Herz über Nacht bei 4 ° C zu dehydrieren.
    4. Frieren Sie das Herz in Kryo-Einbettungsmittel in einer kleinen Form.
      1. Stellen Sie einen Becher nach oben gefüllt mit 2-Methyl und legen Sie es mit Trockeneis in einer Box. Setzen Sie das Herz in einen Gefrierform zuvor halb gefüllt mit Kryo Einbettmediums und decken Sie es vollständig mit Kryo Medium eingebettet wird. Legen Sie das Form in den kalten Becher, der Kryo-Einbettungsmittel mit dem 2-Methyl, um den Kontakt. Lagern Sie das gefrorene Gewebe bei -80 ° C bis zur Verwendung.
  5. Herstellung von dicken Scheiben Herz
    1. Verwenden Sie das folgende Setup in einem Kryotom: eine Objekttemperatur von -18 bis -20 ° C, eine Raumtemperatur von -21 bis -23 ° C, eine Lichtung Winkel auf dem Messerhalter von 4 ° und Feder R35 Mikrotomklingen.
    2. Nehmen Sie die kryokonservierten organ aus dem Gefrierbehälter und fixieren sie auf dem Probenteller mit Medium Kryo-Einbetten des schnellen Einfrierens Regal verwenden. Positionieren das Herz in einer Weise, dass Schnitte an der Spitze beginnt.
    3. Schneiden Sie 50 um Scheiben, bis eine gleichmäßige Schnittebene erreicht wird und das Organ wird sichtbar. Cut 50-uM Gewebeschnitten durch die Kryotom im manuellen Modus mit einer langsamen Geschwindigkeit unter Verwendung von und mit der Anti-Roll-Platte auf dem Messer gelegt. Berg Scheiben auf Kochsalzlösung behandelten Objektträger. Lassen Sie die Scheiben für 30 Minuten bei Raumtemperatur trocknen und lagern Sie die Folien bei -80 ° C oder direkt Fleck.
  6. Die Färbung der dicken Herz Scheiben (Kerne und Zellmembranen)
    1. Behandlung von Herzscheiben mit RNAse A (20 ug / ml) in Waschpuffer (0,5 M NaCl, 0,1 M Tris pH 7,5 und 50 mM EDTA) in einer Küvette für 1 h bei 37 ° C. Inkubieren der Scheiben in 0,2% Triton-X in Waschpuffer für 30 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Scheiben zweimal für jeweils 5 Minuten in Waschpuffer in einer Küvette auf eineHorizontalschüttler bei Raumtemperatur.
    2. Stain über Nacht mit 1 & mgr; M-PRO3 iodid (642/661) und Fluorescein-gekoppelten Weizenkeim-Agglutinin (WGA, 1: 100) in Waschpuffer bei 4 ° C. Waschen Sie die Scheiben dreimal für jeweils 5 Minuten mit Waschpuffer in Küvetten auf einem horizontalen Schüttler und bedecken sie mit Polyvinylalkohol Eindeckmediums mit einem Anti-Fading-Reagenz und einem Deckglas.
  7. Bildaufnahme
    1. Idealerweise einen invertierten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit einem 40x / 1,15 NA Wasser-Tauchziel ausgestattet verwenden. Suchen Sie nach Augenmaß für einen Bereich innerhalb der Scheibe, die sich in Längsrichtung gezeichnet Kardiomyozyten besteht; zu diesem Zweck ist das Fluorescein-WGA-Kanal (Bsp .: 488 nm) am besten geeignet.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, da die oberen und unteren Grenzen der Kardiomyozyten sollte für spätere Analysen innerhalb der z-Stapel sichtbar. Da die Abbildungstiefe auf ~ 30 nm und die Dicke der Scheibe begrenzt ist, beträgt 50 & mgr; m, ist es nicht möglich zu ImAltersquerschnitte dieser Zellen (Zelllänge: ~ 120 & mgr; m).
    2. Stellen Sie die Setup innerhalb der Imaging-Software. Öffnen Sie die Imaging-Software. Öffnen Sie a1plus Einstellungen und Kontrollkästchen für Ch2, Ch3 und Ch4. Set Ch2 zu eGFP, Ch3 zu Alx546 und Ch4 zu Alx647, indem Sie auf das Pulldown-Menü klicken.
      1. Für jeden Kanal, klicken Sie auf HV und setzen Sie ihn auf 80 durch den Schieberegler verwenden. Stellen Sie den Offset auf 0 durch die Schieberegler verwenden. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Home" das Pinhole in die Ausgangsposition zu setzen. Stellen Sie die Scangröße auf 1.024 x 1.024 auf dem Pull-Down-Menü klicken und klicken Sie auf die Optimierung der "XYZ Größe Setup" Fenster zu öffnen. Überprüfen Sie die "Perfect Voxel" Box unter "Empfohlene Schritt (z)".
    3. Klicken Sie auf "Live-Scan" und stellen Sie die Laserintensitäten, indem Sie auf den einzelnen Kanälen auf den Schieberegler klicken. Überprüfen Sie die "Z-Serie" auf der "ND Acquisition" Fenster und klicken Sie auf den "definiert durch obere Taste" -Box. Definieren Sie die obere undTaste des Z-Stapel, indem Sie auf den entsprechenden Button klicken, nachdem der Fokus auf dem Mikroskop einzustellen. Stellen Sie die z-Schrittweite bis 0,5 um.
      HINWEIS: Die Tiefe der z-Stapels wird durch die optische Eindringtiefe in das Gewebe und das Signal-zu-Rausch-Verhältnis begrenzt.
    4. Gehen Sie auf "a1plus Einstellungen" und stellen Sie den Line Average / Integral auf 2-4, indem Sie auf das Pulldown-Menü klicken. Feinabstimmung der Laserintensitäten; das Pinhole sollte so klein wie möglich, um dem Bild in einer Brennebene sein.
  8. Analyse der Nukleation
    1. Öffnen Sie die Bildanalyse-Software und laden Sie die z-Stapel von Interesse.
    2. bestimmen manuell Nukleation in der z-Stapel durch, um durch die verschiedenen Schichten des Stapels Scrolling-Zellen zu identifizieren, die vollständig innerhalb des Stapels liegen; dies ist der Fall, wenn die WGA-Färbung in allen Dimensionen sichtbar ist. Zählen Sie die Anzahl der Kerne (die meisten von ihnen werden zweikernige) und markieren Sie die analysierte Zelle durch eine Anmerkung in der Software.
    3. Bestimmen Sie die Anzahl der CM - Kerne (H2B-mCh +) und Gesamtkerne (TO-PRO3 +) in 3D - Rekonstruktionen für die einzelnen Kanäle (2D). In der Imaging-Software, klicken Sie auf "Binary" und wählen Sie "definieren Threshold 3D" aus dem Pull-Down-Menü. Wählen Sie aus dem Kanal Pull-Down-Menü entweder Alx546 für die Anzahl der CM-Kerne oder Alx647 für die Gesamtzahl der Kerne. Durch die entsprechenden Pfeile klicken, stellen Sie das Programm "Smooth 4x", Sauber 1x und füllen Löcher auf. Überprüfen Sie die "Größe" ein und setzen Sie ihn auf 5 & mgr; m durch den Schieberegler verwenden. Stellen Sie den Schwellenwert mit dem Schieberegler, bis einzelne Objekte erscheinen.
      HINWEIS: Nach der Fragmentierung der Anwendung zeigt das Ergebnisfenster eine Tabelle von quantifizierten Ereignisse und einer farbigen Fragmentierung des Bildes. Da einige Kerne direkt miteinander in Kontakt stehen, korrigieren manuell die automatische Messergebnis für Dubletts, die korrekt von der Software getrennt werden, möglicherweise nicht.

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Ergebnisse

Um die Effekte von siRNAs / miRNAs auf der Zellzyklusaktivität der postnatalen Kardiomyozyten in vitro, Kardiomyozyten von Doppel transgenen Myh6-H2B-mCh / CAG-eGFP-Anillin Mäuse wurden isoliert auf postnatalen Tag 3 (P3) und transfizierte zu analysieren mit Zellzyklusaktivität auslösenden miR199 5, siRNA p27 und siRNA Fzr1. Im Vergleich zur Negativkontrolle (Abbildung 1A), die Bilder von miR199- (Abbildung 1B) und p27- s...

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Diskussion

Es gibt eine Kontroverse darüber, ob Kardiomyozyten können den Zellzyklus und teilen sich nach der Verletzung und während der Gewebehomöostase erneut einzugeben. Werte für den Grundumsatz von Kardiomyozyten wurden im Bereich zwischen 1% und 80% 1 7 angegeben. Auch nach einer kardialen Läsion, die Induktion von Zellzyklusaktivität und die Erzeugung neuer Kardiomyozyten wurde in der Grenzzone berichtet, wobei Werte zwischen 0,0083% 8 und 25 - 40%

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Wir danken S. Grünberg (Bonn, Deutschland) und P. Freitag (Bonn, Deutschland) für ihre technische Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 cmPetrischale Sarstedt821472
100 & micro; m cell SiebBecton Dickinson GmbH/Falcon352360
2,3-Butandion-Monoxim (BDM)Sigma-AldrichB0753
G20x1 ½ Injektionskanüle, StericanBraun, Melsungen4657519
20 Gauge NadelBecton Dickinson GmbH301300
24-Well-PlattenBecton Dickinson GmbH/Falcon353047
2-MethylbutanCarl Roth GmbH + Co. KG3927,1
37%ige FormaldehydlösungAppliChem GmbHA0936,1000
3-Wege-AbsperrhahnB. Braun Medical Inc.16494C 50 mL
SpritzeB. Braun Medical Inc.8728810F
70% EthanolOtto Fischar GmbH27669
Alexa-Fluor-konjugierter SekundärantikörperJackson ImmunoResearch115-605-205
Alpha-Aktinin EA-53, Maus IgGSigma-Aldrich, SteinheimA7811
CaCl2Sigma-AldrichC4901
Zellkultur-Mikroplatte, 96 Well, Halbflächen-Greiner bio-one675986
Kollagenase BRoche11088815001
konfokales Mikroskop Eclipse Ti-ENikon
Kryostat CM 3050SLeica
EselsserumJackson Immuno Research, Suffolk, GB017-000-121
Dulbecco's Phosphate Buffered KochsalzlösungSigma-AldrichD8537
EDTASigma-AldrichE4884
fötales KälberserumPromoCell, Heidelberg
Formaldehydlösung (4%)PanReac AppliChemA3697
Gelatine aus Schweinehaut, Typ ASigma-Aldrich, SteinheimG2500
GlasdeckgläserVWR631-0146
GlucoseSigma-AldrichG7021
Heidelberger VerlängerungshülseIMPROMEDIFORM GmbHMF 1833
Heparin-NatriumRatiopharm5394.02.00
HEPESSigma-AldrichH3375
HistoBond ObjektträgerMarienfeld0810000
Hoechst 33342 (1  mg/mL)Sigma Aldrich, TaufkirchenB2261
InsulinspritzeBecton Dickinson GmbH300334
Iscove' s ModifiedDulbecco' s Medium (IMDM)Gibco/Life Technologies, Darmstadt21980-032
KClSigma-AldrichP9333
LamininCorning354221
Laser Scanning Mikroskop Eclipse TiNikoninstruments, Dü sseldorf
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies, Darmstadt13778075
Maus IgG Cy5 (Esel)Jackson ImmunoResearch715-175-151
MgCl2Sigma-AldrichM8266
MikrozentrifugenröhrchenSarstedt72690
Mini-ShakerVWR12620-940
mirVana miRNA mimic, has-miR199a-3pAmbion/Thermo Fischer Scientific4464066
Biopsy MoldSakura Finetek/ VWR4565
M-slide 8-well ibiTreatibidi 80826
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHMerck Millipore567530
negativ control (scrambled RNA)Ambion/Thermo Fischer ScientificAM4611
Dissoziationskit für NeugeboreneMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bitNikoninstruments, Dü
non essential amino acids, NEAAGibco/Life Technologies, Darmstad11140-035
Opti-MEM, Reduced SerumMedium Gibco51985-026
P21-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
P27-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
Penicillin/StreptomycinGibco/Life Technologies, Darmstadt15140-122
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Sigma-Aldrich, Steinheim14190-094
Einbettmedium aus Polyvinylalkohol mit DABCO®, antifadingSigma-Aldrich10981
RNase AQiagen1007885
RNaseZapInvitrogen/Life Technologies, DarmstadtAM9780
ProbenbehälterVitlab80731
Serologische PipetteGreiner607180
Software NIS ElementsNikon
SaccharoseSigma-AldrichS0389
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek/ VWR25608-930
ToPro3 Jodid (642/661)Molekular Sonden/ThermoFisher ScientificT3605
TrisSigma-AldrichT1503
Triton XFluka93418
Triton X-100Fluka93418
TrypsinSigma-AldrichT1426
Weizenkeim-Agglutinin (WGA) Fluorescein markiertVector LaboratoriesVEC-FL-1021-5
α-Aktinin AntikörperSigma-AldrichA7811
β-MercaptoethanolSigma-Aldrich, SteinheimM3148
brussels

Referenzen

  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status. Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33(2015).
  3. Field, C. M., Alberts, B. M. Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex. J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).
  4. Hesse, M., et al. Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle. Nat.Commun. 3, 1076(2012).
  5. Eulalio, A., et al. Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration. Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).
  6. Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
  7. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).
  8. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).
  9. Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
  10. Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation. J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).
  11. Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).

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