Method Article

Visualisierung von Zellzyklus-Variationen und Bestimmung der Nukleation in postnatale Kardiomyozyten

DOI:

10.3791/55204

⸱

February 24th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiology I, University of Bonn

In This Article

Summary

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Um die Zellteilung von Zellzyklusvariationen in Kardiomyozyten zu unterscheiden, präsentieren wir Protokolle mit zwei transgenen Mauslinien: Myh6-H2B-mCh-transgene Mäuse, zur eindeutigen Identifizierung von Kardiomyozytenkernen, und CAG-eGFP-Anillin-Mäuse, zur Unterscheidung der Zellteilung von Zellzyklusvariationen.

Abstract

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Kardiomyozyten sind anfällig für Variationen des Zellzyklus, wie z.B. Endoreduplikation (fortlaufende Runden der DNA-Synthese ohne Karyokinese und Zytokinese) und azytokinetische Mitose (Karyokinese, aber keine Zytokinese). Solche atypischen Zellzyklusvariationen führen eher zu polyploiden und mehrkernigen Zellen als zu Zellteilung. Daher ist es für die Bestimmung des Herzumsatzes und der Regeneration von entscheidender Bedeutung, die Kardiomyozytenkerne, die Anzahl der Zellkerne pro Zelle und ihren Zellzyklusstatus korrekt zu identifizieren. Dies gilt insbesondere für die Verwendung von nukleären Markern zur Identifizierung der Zellzyklusaktivität, wie z. B. Thymidinanaloga Ki-67, PCNA oder pHH3. Im Folgenden stellen wir Methoden vor, um Kardiomyozyten und ihre Kernkraft zu erkennen und ihre Zellzyklusaktivität zu bestimmen. Wir verwenden zwei veröffentlichte transgene Systeme: die transgene Mauslinie Myh6-H2B-mCh, zur eindeutigen Identifizierung von Kardiomyozytenkernen, und die CAG-eGFP-Anillin-Mauslinie, zur Unterscheidung von Zellteilung und Zellzyklusvariationen. In Kombination erleichtern diese beiden Systeme die Untersuchung der kardialen Regeneration und Plastizität.

Introduction

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Die korrekte Identifizierung von Kardiomyozyten Kerne und der Zellzyklusstatus ist von entscheidender Bedeutung für die Bestimmung der Herzmuskel Umsatz und Regeneration. Dies gilt insbesondere für die Nutzung der Kernmarker wie pHH3, Ki-67, oder Thymidin-Analoga, für die Zellzyklusaktivität identifiziert. Da die proliferative Kapazität von erwachsenen Säugetieren Kardiomyozyten ist sehr klein 1, eine falsche Identifizierung eines Kerns für eine positive Proliferationsmarker eines Kardiomyozyten Kern einen entscheidenden Unterschied in dem Ergebnis eines Proliferationsassay machen könnte. Außerdem sind Kardiomyozyten anfällig für Schwankungen ....

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Protocol

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Alle Verfahren dieses Protokolls Tiere waren in Einklang mit den ethischen Normen der Universität Bonn und mit den Leitlinien der Richtlinie 2010/63 / EU des Europäischen Parlaments über den Schutz von Tieren für wissenschaftliche Zwecke erfüllt.

1. In - vitro - Visualisierung von Zellzyklusaktivität in postnatale Kardiomyozyten

  1. Die postnatale Kardiomyozyten Dissoziation
    1. Pre-experimentelle Präparate
      1. Bereiten Kulturmedien (IMDM, 1% Penicillin / Streptomycin, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren, 0,1% β-Mercaptoethanol); Medium 1: add FCS bis 2%; Medium 2: fügen FCS bis 20%.
      2. Mantel eine ....

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Results

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Um die Effekte von siRNAs / miRNAs auf der Zellzyklusaktivität der postnatalen Kardiomyozyten in vitro, Kardiomyozyten von Doppel transgenen Myh6-H2B-mCh / CAG-eGFP-Anillin Mäuse wurden isoliert auf postnatalen Tag 3 (P3) und transfizierte zu analysieren mit Zellzyklusaktivität auslösenden miR199 5, siRNA p27 und siRNA Fzr1. Im Vergleich zur Negativkontrolle (Abbildung 1A), die Bilder von miR199- (Abbildung 1B) und p27- s.......

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Discussion

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Es gibt eine Kontroverse darüber, ob Kardiomyozyten können den Zellzyklus und teilen sich nach der Verletzung und während der Gewebehomöostase erneut einzugeben. Werte für den Grundumsatz von Kardiomyozyten wurden im Bereich zwischen 1% und 80% 1 7 angegeben. Auch nach einer kardialen Läsion, die Induktion von Zellzyklusaktivität und die Erzeugung neuer Kardiomyozyten wurde in der Grenzzone berichtet, wobei Werte zwischen 0,0083% 8 und 25 - 40%

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Disclosures

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgements

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Wir danken S. Grünberg (Bonn, Deutschland) und P. Freitag (Bonn, Deutschland) für ihre technische Unterstützung.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 cmPetrischale Sarstedt821472
100 & micro; m cell SiebBecton Dickinson GmbH/Falcon352360
2,3-Butandion-Monoxim (BDM)Sigma-AldrichB0753
G20x1 ½ Injektionskanüle, StericanBraun, Melsungen4657519
20 Gauge NadelBecton Dickinson GmbH301300
24-Well-PlattenBecton Dickinson GmbH/Falcon353047
2-MethylbutanCarl Roth GmbH + Co. KG3927,1
37%ige FormaldehydlösungAppliChem GmbHA0936,1000
3-Wege-AbsperrhahnB. Braun Medical Inc.16494C 50 mL
SpritzeB. Braun Medical Inc.8728810F
70% EthanolOtto Fischar GmbH27669
Alexa-Fluor-konjugierter SekundärantikörperJackson ImmunoResearch115-605-205
Alpha-Aktinin EA-53, Maus IgGSigma-Aldrich, SteinheimA7811
CaCl2Sigma-AldrichC4901
Zellkultur-Mikroplatte, 96 Well, Halbflächen-Greiner bio-one675986
Kollagenase BRoche11088815001
konfokales Mikroskop Eclipse Ti-ENikon
Kryostat CM 3050SLeica
EselsserumJackson Immuno Research, Suffolk, GB017-000-121
Dulbecco's Phosphate Buffered KochsalzlösungSigma-AldrichD8537
EDTASigma-AldrichE4884
fötales KälberserumPromoCell, Heidelberg
Formaldehydlösung (4%)PanReac AppliChemA3697
Gelatine aus Schweinehaut, Typ ASigma-Aldrich, SteinheimG2500
GlasdeckgläserVWR631-0146
GlucoseSigma-AldrichG7021
Heidelberger VerlängerungshülseIMPROMEDIFORM GmbHMF 1833
Heparin-NatriumRatiopharm5394.02.00
HEPESSigma-AldrichH3375
HistoBond ObjektträgerMarienfeld0810000
Hoechst 33342 (1  mg/mL)Sigma Aldrich, TaufkirchenB2261
InsulinspritzeBecton Dickinson GmbH300334
Iscove' s ModifiedDulbecco' s Medium (IMDM)Gibco/Life Technologies, Darmstadt21980-032
KClSigma-AldrichP9333
LamininCorning354221
Laser Scanning Mikroskop Eclipse TiNikoninstruments, Dü sseldorf
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies, Darmstadt13778075
Maus IgG Cy5 (Esel)Jackson ImmunoResearch715-175-151
MgCl2Sigma-AldrichM8266
MikrozentrifugenröhrchenSarstedt72690
Mini-ShakerVWR12620-940
mirVana miRNA mimic, has-miR199a-3pAmbion/Thermo Fischer Scientific4464066
Biopsy MoldSakura Finetek/ VWR4565
M-slide 8-well ibiTreatibidi 80826
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHMerck Millipore567530
negativ control (scrambled RNA)Ambion/Thermo Fischer ScientificAM4611
Dissoziationskit für NeugeboreneMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bitNikoninstruments, Dü
non essential amino acids, NEAAGibco/Life Technologies, Darmstad11140-035
Opti-MEM, Reduced SerumMedium Gibco51985-026
P21-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
P27-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
Penicillin/StreptomycinGibco/Life Technologies, Darmstadt15140-122
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Sigma-Aldrich, Steinheim14190-094
Einbettmedium aus Polyvinylalkohol mit DABCO®, antifadingSigma-Aldrich10981
RNase AQiagen1007885
RNaseZapInvitrogen/Life Technologies, DarmstadtAM9780
ProbenbehälterVitlab80731
Serologische PipetteGreiner607180
Software NIS ElementsNikon
SaccharoseSigma-AldrichS0389
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek/ VWR25608-930
ToPro3 Jodid (642/661)Molekular Sonden/ThermoFisher ScientificT3605
TrisSigma-AldrichT1503
Triton XFluka93418
Triton X-100Fluka93418
TrypsinSigma-AldrichT1426
Weizenkeim-Agglutinin (WGA) Fluorescein markiertVector LaboratoriesVEC-FL-1021-5
α-Aktinin AntikörperSigma-AldrichA7811
β-MercaptoethanolSigma-Aldrich, SteinheimM3148
brussels

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell ....

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