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Methodenartikel

Entwicklung eines wirtschaftlich DNA Delivery System von „Acufection“ und seine Anwendung auf die Hautforschung

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DOI:

10.3791/55206

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19. April 2017

 ,  , 
1Graduate Institute of Immunology, National Taiwan University College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll ist eine kostengünstige Alternative für die nackten Plasmid-DNA in Mäusehaut exprimiert. Das übergeordnete Ziel des Protokolls ist immunbezogenen Gene in Hautgewebe liefern die funktionelle Rolle eines spezifischen Gens in Hautentzündung zu beschreiben.

Zusammenfassung

Dysregulation der Immunantwort in der Haut ist mit zahlreichen menschlichen Hauterkrankungen in Verbindung gebracht. Ein direkte Übertragung von immunbezogenen Genen in Hautgewebe ist ein faszinierender Ansatz Immunmodulation von Hautentzündung in Mausmodellen menschlicher Krankheiten zu untersuchen. Hier präsentieren wir ein kostengünstiges Protokoll, die nackte DNA in Mäusehaut geliefert und führt zu einem Transgen-Expression. Das Verfahren wird geprägt „acufection“, bezeichnet ACU Punktur-vermittelter DNA trans fektion. Zur Durchführung acufection, Mäusehaut wurde zuerst mit DNA in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und anschließend gespitzt leicht mit einem Bündel von Akupunkturnadeln infundiert die Aufnahme von DNA und Transfektion in Zellen zu erleichtern. Der Plasmid-DNA wird vermutlich durch die Keratinozyten und dendritischen Zellen (DCs) in der Haut und in dem Protein exprimiert aufgenommen. Mechanische Stich mit der Nadel per se nicht Hautschäden verursachen oder Keratinozyten - Aktivierung induzieren. Der Ausdruckdie transfizierten Gene wurde sowohl für 2 Tage nach acufection Transkriptions- und Translationsniveau in der Haut detektiert und gehalten bis 7 Tage. Das primäre Ziel für die Entwicklung dieser acufection Methode war eine zuvor nicht definiert Isoform von IL-15 zu untersuchen. Unter Verwendung dieses Verfahren wird eine alternativ gespleißte IL-15-Isoform mit teilweise deletierten Exon 7 (IL-15ΔE7) wurde in der Haut exprimiert und anschließend mit einem Toll-like-Rezeptor 7 (TLR7) -Agonisten, Imiquimod (IMQ) behandelt, um Entzündung zu induzieren. Acufection-lieferte IL-15ΔE7 in der Haut unterdrückt Keratinozytenproliferation, epidermale Dicke und neutrophile Rekrutierung in IMQ-induzierte Hautentzündung. Mit zunehmendem Interesse der Regulationsmechanismen der Hautentzündung bei der Identifizierung beschriebenes Protokoll hier bietet eine kostengünstige und vielseitige Alternative zu dem Genkanone System oder Microseeding zur DNA - Verabreichung in vivo. Es kann möglicherweise Entdeckung der Funktion eines neuen erlaubenGene in der Haut oder für neue Behandlung für Hautkrankheiten zu untersuchen.

Einleitung

Die Haut ist die erste Linie der Verteidigung des Wirts. Keratinozyten (KCS) ist der Hauptzelltyp in der Haut von Menschen und Mäusen. Als Reaktion auf Umweltreize (zB Sonnenlicht, Sauerstoff, Chemikalien und pathogene invasion) wird KCs aktiviert , und eine Vielzahl von proinflammatorischen Zytokine und Chemokine, wie IL-8 produzieren, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF- α und GM-CSF - 1. Gemeinsam lösen sie die Rekrutierung von Immunzellen auf der Haut. VERSCHLIMMERT kutanen Entzündung ist oft mit zahlreichen menschlichen Erkrankungen , einschließlich akut ectopic Kontaktdermatitis und chronischen T - Zell-vermittelte Entzündung (zB allergische Kontaktdermatitis und Psoriasis) 2 verbunden. proinflammatorischen Reaktionen in der Haut modulierenden durch KC Aktivierung Hemmung ist ein plausibler Ansatz Hautentzündung zu behandeln. Dieses Protokoll beschreibt einen neuen Ansatz zur transient ein Zytokin-Gen in den Epidermis, um auszudrücken Immun res zu studierenponse Folge einer solchen Behandlung in der Haut.

Die Epidermis bildet die oberflächliche Schicht der Haut. Es dient als physikalische Barriere zu halten externe Substanzen, wie Nukleinsäuren und Pathogenen aus den tieferen Schichten der Haut eintritt. Mehrere nadelfreie Techniken wurden für DNA - Transfer epidermalen 3, 4 aufgebaut. DNA in Lösung oder in Verbindung mit kationischen Liposomen oder Adenovirusvektoren wurde an die Epidermis mit Techniken modifiziert wie die Entfernung des Stratum corneum oder die Behandlung mit depilating Reagenz direkt angewendet. Die Entfernung des Epithels verhornten erleichtert DNA die epidermalen Barriere und Interaktion mit Keratinozyten und Langerhans'schen Zellen kreuzen 5 - Immunantworten zu induzieren. Während eine große Oberfläche für die DNA-Transfer zur Verfügung steht und dieser Ansatz ist nicht mit Nadeln, gibt es einschließlich Nachteile der Anforderungfür die großen Mengen an DNA (10-100 ug), harter Behandlung auf der Haut durch Strippen und die inkonsistenten Ergebnisse der Immunantwort in den immunisierten Tieren ohne DNA - Abgabe Booster 6 induziert wird . Mikroteilchen-vermittelte intrazelluläre Abgabe nackten DNA auf die Haut wurde zum Induzieren von Immunantwort , 7, 8 sehr leistungsfähig und reproduzierbar erwiesen. Tragbares Genkanone verwendet worden ist, die Haut Zielstelle mit Plasmid - DNA-beschichteten Goldteilchen 2 & mgr; m-Durchmesser in der Größe mit Hilfe von Druckluft Heliumstrom 9 zu bombardieren. Der Plasmid - DNA wird vermutlich durch KCsand dendritische Zellen (DCs) in der Haut und das Protein aufgenommen wird lokal ausgedrückt , oder 10 bis ableitenden Lymphknoten von DCs transportiert wird. Obwohl die Gen - Kanone System ist einfach und erfordert begrenzte technische Erfahrung, die Kosten für die Herstellung und Lieferung des "DNA - bullassen "(dh Goldpulver, Heliumgas) und für die Gen - Kanone selbst seine allgemeine Geltung hat beschränkt. Darüber hinaus die Leichtigkeit des Genkanone Transports die Forderung nach einem Heliumgas - Abgabesystem begrenzt , wenn die Experimente an verschiedenen Orten durchgeführt werden. Microseeding ist 11 eine höhere Effizienz des Gentransfers als Einzelinjektion und Teilchenbeschuss gezeigt zu erreichen. Microseeding eine Tätowierung Pistole verwendet , ohne die Verwendung von Partikeln Wülste 11. Oszillieren der Mikronadel auf der Haut ist mit diesem Ansatz DNA auf die Haut zu liefern wahrscheinlich direkt die Zellmembran schaben und so DNA zu mehreren Zellen gleichzeitig übertragen. jedoch mit der großen Anzahl von Injektionen verbundenen Schmerzen mit 0,254 mm Durchmesser Nadeln ein Nachteil ist.

Hier bieten wir einen alternativen Ansatz zur DNA - Verabreichung in vivo. Die „acufection“ Protokoll wir hier beschrieben wird, liefert eine wirtschaftliche und effiziente Weise Plasmid-DNA in Mäusehaut zu liefern. Kurz gesagt, wurden zehn Akupunkturnadel (0,2 mm Durchmesser x 13 mm Länge) in einem Bündel durch ein Klebeband gebunden. Ein Volumen von 10 & mgr; l PBS mit 10 ug Plasmid-DNA, die das Transgen von Interesse enthält, wurde auf der rasierten, Enthaarungscreme behandelter Flanke Haut platziert. Durch die Verwendung von Bündel der Akupunkturnadel, die Oberfläche (1 cm x 1 cm) der Haut, die Keratine an der Hornschicht zu oszillieren wurden gelöst und die Plasmid-DNA auf die Oberfläche aufgebracht wurde, in die Epidermis absorbiert. Hautschäden wurden überwacht und minimal sein gefunden. Die Expression des transfizierten Gens in der acufected Haut wurde sowohl durch quantitativen Echtzeit-PCR (qRT-PCR) und ELISA bestätigt. Die immunmodulatorische Wirkung von acufection-lieferte IL-15ΔE7 auf kutane Entzündung wurden unter Verwendung des IMQ behandelter demonstriert Mausmodell 12. Während acufection beweist eine einfache und weniger dema seinnden Verfahren zur DNA - Verabreichung in vivo, hat sie die optimale Menge an DNA für verschiedene Gene und die Zeiten , um die Haut stechen sorgfältig optimiert werden , um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten.

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Protokoll

Weibliche Mäuse in 8 bis 12 Wochen alt wurden für diese Studie verwendet. C57 / BL6 - Wildtyp (WT) und IL-15 defiziente (IL - 15 - / -) Mäuse wurden von National Laboratory Animal Center (NLAC) erworben, Taiwan und Taconic Farm, respectively. IL-15-defiziente (IL - 15 - / -) und IL-15-dominant (IL - 15 IL - 15 und +/- + / +) zeigten ein Verhältnis 1: 3 in der zweiten Generation aus der Kreuzung von IL - 15 +/- Heterozygoten. Der Genotyp von IL - 15 - / - Mäuse wurden durch PCR - Analyse bestätigt. Die Mäuse wurden in der Spezifische pathogenfreie (SPF) Anlage im Labor Animal Center (LAC), National Taiwan University (NTU) College of Medicine gehalten. Alle Tierverfahren einschließlich der Betäubung Materialien und Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Tier Protokoll, das von der National Taiwan University College of Medicine und der Hochschule für Public Health Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) (Affidavit der Genehmigung des Tier Protokolls 20130225) genehmigt durchgeführt.

1. Herstellung von Akupunkturnadeln

HINWEIS: Akupunkturnadeln sind Medizinprodukte, bestehend aus einem Handgriff und einem Nadelende (1A). Die Durchmesser der Akupunkturnadel lag im Bereich von 0,2 mm (36 G) bis 0,35 mm (28 G). Wir wählen den besten Punkt der Nadel während Einstechen in die Haut mögliche übermäßige Zellschäden zu vermeiden. Es gibt 4 verschiedene Längen der 0,2-mm-Nadel einschließlich 13 mm (0,5 Zoll), 25 mm (1,0 in), 40 mm (1,5 Zoll) und 50 mm (2,0 in) in der Länge. Ein Bündel aus 10 Nadeln mit 13 mm Länge bereitgestellt, um den besten bequemen Griff während des Nadel Oszillieren auf C57BL / 6-Mäusehaut. Die Parameter können geändert werden, wenn das Verfahren auf die Haut von größeren Tieren angewandt wird oder von den Forschern mit größeren Händen durchgeführt.

  1. Entfernen Sie Akupunkturnadeln aus dem sterilen, pyrogenfreien Paket. Legen Sie die Nadeln auf einem sterilen Tuch.
  2. Verwenden Klebeetikettenband 10 Nadeln zusammenzubinden ina Bündel (1B).
    HINWEIS: Die Nadeln 10 sind geometrisch angeordnet, um eine Zylinderform zu bilden. Der Einfachheit halber wird ein Stück Paraffinfilm verwenden, um die Anordnung zu stabilisieren, bevor das Klebeband aufgebracht wird. Stellen Sie sicher, dass alle Nadelspitzen auf der gleichen Ebene liegen. ein Bündel anstelle einer einzelnen Nadel erleichtert maximale DNA Infusion durch den Kontaktbereich zwischen den Nadeln und der Haut zu erhöhen.

2. Herstellung einer großen Menge und Endotoxin-freie Plasmid-DNA

  1. Verwandeln chemisch kompetente Bakterienzellen mit dem Plasmid DNA.
  2. Auswählen und inokulieren eine einzelne Bakterienkolonie in 3 ml LB - Medium , das Antibiotika und inkubieren bei 37 ° C in einem Schüttler über Nacht.
  3. Scale - up die Kultur durch die Bakterienkultur in 1 verdünnt: 100 in 250 ml LB - Medium mit Antibiotika und Schütteln über Nacht bei 37 ° C.
  4. Bereiten Sie eine große Menge an DNA, die durch eine hohe qualit Verwendungy, Endotoxin frei Plasmidpräparation Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
    HINWEIS: Acufection Protokoll erfordert eine hohe Reinheit und eine große Menge an Plasmid-DNA. Verwendung einer hohen Qualität, frei von Endotoxin und column-gereinigter Plasmid-DNA wird empfohlen.
  5. Eluieren der DNA in sterilem Wasser. Shop DNA in kleinen Portionen bei -20 ° C bis zu seiner acufection.
    HINWEIS: Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-und-Tau von DNA konsistent Plasmid-DNA-Expression zu gewährleisten.
  6. Verdünnte Plasmid-DNA zu 1 mg / ml in sterilem PBS für acufection.

3. Verfahren für die Acufection

HINWEIS: Die optimale Menge an DNA und der Bereich der Zielhautoberfläche kann für verschiedene Gene variieren und müssen weiter optimiert werden. Die Einstichkraft und die Anzahl der Male, die Hornschicht der Haut zu lösen, auch in Abhängigkeit von der Hautdicke variieren. Diese Bedingungen müssen sorgfältig bestimmt werden, nachdem das Expressionsniveau von acufected Gen transcri Bewertungpts durch qRT-PCR.

  1. Wiegen der Mäuse und verabreichen Tribromethanol (400 ug pro g Körpergewicht) durch peritoneale Injektion.
    HINWEIS: 2,2,2-Tribromethanol ist ein injizierbares Narkosemittel, das bei Mäusen häufig verwendet wurde. Lösungen werden durch Lösen eines nicht pharmazeutischem Grad 2,2,2-Tribromethanol (2,5 g) in destilliertem Wasser (200 ml), enthaltend 2,5% 2-Methyl-2-butanol hergestellt.
  2. Verwenden vet ophthalmologischen Salbe auf die Augen zur Trockene unter Narkose zu verhindern.
    HINWEIS: - 2 min betäubende Wirkung wird in 1 induziert werden. Schauen Sie sich die Zehe Prise Reflex vor dem Betrieb eine ausreichende Narkosetiefe zu gewährleisten.
  3. Shave die dorsale Flanke und die Haut anwenden Enthaarungscreme Keratinproteinen in der Haarschaft zu lösen.
    HINWEIS: Die Verwendung von Enthaarungscreme Haare entfernen wird die Infusion von DNA in die Haut erleichtern.
  4. Verwenden Sie Wasser getränkte Wattebäusche die Enthaarungscreme abzuwischen.
    HINWEIS: Die Enthaarungscreme in Wasser löslich sind. Die vollständige Entfernung der Creme will eine schmierige Oberfläche verhindern und eine bessere stech Ergebnis zu gewährleisten.
  5. Verwenden ein steriles Wattestäbchen in 70% Ethanol getränkt, um die Hautoberfläche zu desinfizieren.
  6. Markierung des Zielbereich (1 cm x 1 cm) auf der enthaarten Haut mit einer vorgemessenen Schablone. HINWEIS: Um die Zielstelle Kennzeichnung wird dazu beitragen, das Nadelbündel nach oben und nach unten innerhalb eines definierten Bereichs anzuwenden. Dies ist wichtig, Lieferung der gleichen Menge an DNA zu einer spezifischen Oberfläche, um sicherzustellen, Experiment zu Experiment Variation zu minimieren.
  7. Legen Sie eine 10 uL Tropfen von Plasmid-DNA (10 ug) auf die markierte Haut.
    HINWEIS: Die Menge an DNA für acufection variiert mit verschiedenen Genen und dem Typ des Expressionsvektors. Die Menge an DNA verwendet wird, sollte sorgfältig titriert werden, bevor das Experiment von Interesse durch. Die 10 & mgr; L ist ein kleiner Flüssigkeitstropfen und es sitzt gut auf dem rasiert und enthaart Haut ohne rollten während Einstechen. Umfassen eine Kontrollgruppe von Mäusen, die mit 10 & mgr; l leeren Vektor DNA behandelten Mäusen mit einem zum Vergleichmit der Studie Gen cufected.
  8. Halten Sie die Akupunkturnadel Bündel (1B) und stechen die markierte Oberfläche mit einer Auf- und Abbewegung zu 100 - mal oder bis die Feuchtigkeit von DNA in PBS auf die Haut verschwindet. HINWEIS: Einige Rötung der Hautoberfläche auftreten kann. Vermeiden Sie tiefe Schnitte zu machen, die bluten. Die Anzahl der Auf- und Abbewegungen auf der Hautoberfläche Einstechen ist funktionsfähig bestimmt, wenn die Feuchtigkeit von DNA in PBS (10 ul) verschwindet auf der Haut. Wir entschieden uns 100 mal in 30 s, weil es die meisten konsistente Ergebnisse aus acufection-gelieferten Gene gegeben hat. Gegebenenfalls können die Nadeln bis zu 6 Zielhaut pricks (1 cm x 1 cm je) wiederverwendet werden. Spülen Sie die Nadeln in 70% Ethanol und PBS zwischen acufection. Wechseln Sie in neue Nadeln, wenn sie stumpf oder für verschiedene Plasmid-DNA sind eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
  9. Platzieren acufected Mäuse auf einem Heizkissen, die Körpertemperatur, bis wach zu halten.
  10. Rück Mäuse in ihren Käfig, wenn siewieder genügend Bewusstsein. Hinweis: Halten Sie acufected Mäuse in separaten Käfig (weniger als 5 Tiere pro Käfig) aus dem Käfig von un-acufected Mäuse.
  11. Setzen Sie Wasserflasche an Ort und Stelle und gibt den Käfig mit dem IVC (einzeln belüfteten Käfig) Rack.

4. postoperative Pflege

  1. Für die ersten 48 Stunden nach dem Eingriff, genau überwachen Mäuse für irgendwelche Beschwerden einschließlich Verhaltensänderungen (Unruhe, Erregung oder Essstörung) oder Auffälligkeiten (grobe Behaarung oder gekrümmte Haltung).

5. Imiquimod (IMQ) Behandlung von IL-15ΔE7-acufected Haut

HINWEIS: Transkriptions-Expression und Proteinproduktion von acufected Genen nachweisbar ist am 3. Tag Mäusen acufected mit dem Plasmid von Interesse kann mit verschiedenen Arten von Stimulanzien 3 Tage nach der Transfektion behandelt werden. Wir zeigen hier durch die IL-15ΔE7-acufected Mäusehaut mit IMQ Creme behandeln. IMQ ist ein imidazoquinolin Amin zugelassen foder Behandlung von externen Genitalwarzen und perinatale 13. Topische IMQ Behandlung wird gezeigt mit der Manifestation der schuppigen Haut, epidermale Proliferation und dermalen Neutrophileninfiltration 12, 14, 15 Human Psoriasis-ähnlichen Hauterkrankungen bei Mäusen zu induzieren.

HINWEIS: Der Plasmidvektor enthalten Volllängen-Maus-IL-15-cDNA unter der Regulation der Elongationsfaktor-1 α (PEF), flankiert mit einer IL-2-Signalpeptid und ein FLAG-Tag am C-Terminus (pEF-IL- 15, 5859 Basenpaare), die von Bamford et al , wie beschrieben konstruiert. 16. Das Plasmid wird als ein IL-15-Vorlage verwendet, um die ersten 16 Aminosäuren an den Resten 33 zu löschen - 48 in Exon 7 des IL-15-Gen für IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5.811 Basenpaare) durch SOE (Synthese durch Overlap - Extension) PCR - Verfahren 17. Bakterienkolonien, die waren erfolgreichtransformiert mit IL-15ΔE7 wurden durch Restriktionsenzymverdau und DNA - Sequenzieren , gefolgt von 12, 18 überprüft. Eine große Menge von Endotoxin-freien Plasmid-DNA wurde in dem Protokoll Schritt 2 beschrieben, hergestellt.

  1. Anesthetize acufected Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Tribromethanol (400 ug pro g Körpergewicht) und gelten vet ophthalmologischen Salbe auf die Augen zur Trockene unter Narkose zu verhindern. Schauen Sie sich die Zehe Prise Reflex auf eine ausreichende Tiefe der Anästhesie vor dem Beginn der operativen Verfahren zu gewährleisten. Hinweis: Da eine 2 cm x 2 cm der Haut wird für IMQ behandelt werden, 2 Dosen von pIL-15ΔE7 Plasmid-DNA (10 ug in 10 ul PBS pro Dosis) auf 2 Zielstellen acufected (1 cm x 1 cm pro Stück).
  2. Mark Flankenhaut (2 cm x 2 cm), die den acufected Bereich.
  3. Verwenden Q-tip Applikator topisch IMQ Creme auf der markierten Oberfläche anzuwenden. Hinweis: Schritt 5.1 wird nur für die erste Dosis durchgeführt (60 mg / Dosis).Die nächsten aufeinanderfolgenden Dosen werden nicht-narkotisierten Mäusen angewandt.
  4. Dokumentieren Sie die Änderungen von IMQ behandelten Rückenhaut täglich mit einem High-Definition-Camcorder. Hinweis: Eine Person hält die Maus, während ein anderes aufnimmt. Standbilder werden geschossen und zu einem späteren Zeitpunkt bearbeitet werden.
  5. Euthanize Mäuse durch eine Überdosis von Tribromethanol (800 & mgr; g pro Gramm Körpergewicht) Injektion, gefolgt von Genickbruch am Tag 4 oder Tag 7 nach IMQ Behandlung. Die Haut wird ausgeschnitten und verarbeitet (Schritte 4,1-4,5).

6. Homogenat von Mäusehaut

  1. Verwenden, um eine chirurgische Schere einen horizontalen Schnitt von der Basis des Schwanzes zu machen. Verfahren bilateral an die Basis der hinteren Gliedmaße und weiterhin vertikal entlang der Flanke mit der Basis des Vorderbeins schneiden.
  2. Vorsichtig die Haut von dem darunterliegenden Gewebe von posterior zum anterioren. Verwenden Sie die Schere die dorsale Haut abzuschneiden. Legen Sie die Haut auf einer sterilen Petrischale.
  3. Verwenden Sie ein Skalpell Ziel auszuschneidenHaut und in flüssigem Stickstoff sofort einzufrieren. Anmerkung: Die gleiche Größe acufected Haut ohne (1 cm x 1 cm) oder mit IMQ Behandlung (2 cm x 2 cm) wird für jede Maus befestigt zu minimieren Experiment zu Experiment Variationen.
  4. Das tiefgefrorene Hautgewebe in der Mitte eines vorgekühlten 2-Kammer-Mörtel mit Griffen und einem Stößel. Verwenden Sie einen Bleihammer auf dem Mörtel um das Gewebe zu pulverisieren.
  5. Schnell platzieren das pulverisierte Gewebe in ein neues Röhrchen 500 ul Zelllysereagenz zur RNA-Extraktion oder in ein Röhrchen, das 50 ul PBS und 1x-Protease-Inhibitor-Cocktail enthält Proteinlysat zu erhalten.

7. H & E und immunhistochemische Färbung von Haut Section

  1. Platzieren Sie die Hautgewebe in einer Kassette und tauche sie in 4% Paraformaldehyd über Nacht.
  2. Einbetten und Gewebeschnitt, die in unserem Fall durch das Pathologie-Labor an der LAC, NTU durchgeführt wurden. Hinweis: Der Abschnitt in einer Dicke von 5 um geschnitten. Platz Gewebe Abschnitons auf positiv geladene Objektträger.
  3. Wärme , um die Objektträger bei 65 ° C für 15 min.
  4. Legen Sie die Folien in einer Färbebank. Tauchen Sie die Zahnstange in der entsprechenden Behältern enthalten Xylolersatz zweimal für 5 min, gefolgt von aufeinanderfolgenden Eintauchen in 100%, 95%, 80%, 75%, 60% und 50% Ethanol (jeweils 5 min) zur Rehydratisierung. Tauchen Sie die Objektträger in Leitungswasser für 3 Minuten vor der Färbung.
  5. Führen Sie Hämatoxylin und Eosin-Färbung. Hinweis: H & E-Färbung wurde an der LAC, NTU auf Anfrage bei Pathology Laboratory durchgeführt.
  6. Für immunhistochemische Färbung, blockieren den Abschnitt mit Blocklösung bei Raumtemperatur für 5 min nicht spezifische Hintergrundfärbung zu reduzieren. Hinweis: Die Blocklösung wird im Handel mit Immunfärbungstechniken entwickelt. Kein Tierserum ist in diesem Produkt enthalten sind.
  7. Tauchen Sie die Objektträger in PBS die Blocklösung auszuspülen.
  8. Verdünne die Blocklösung in PBS bei 1:10 und fügen 2% fötalen Rinderserum (FBS) (Verdünnungslösung).
  9. Pipette der in geeigneten primären Antikörper auf den Abschnitt verdünnt und für 60 min bei Raumtemperatur inkubieren. Hinweis: Die Antikörper werden in Verdünnungslösung verdünnt. Die Antikörperkonzentrationen für diese Färbung wurden bei 1 optimiert: 800 und 1: 200 für Ki67 (Klon SolA15) und Ly6G (Klon 1A8) verbunden sind. Diese Konzentrationen gefunden werden, ohne Hintergrundfärbung deutlichen Fleck zeigen.
    1. Befleckt einen seriellen Abschnitt im gleichen Durchlauf mit der gleichen Lösung des primären Antikörper verzichtet wird, um nicht-spezifische Bindung des sekundären Antikörpers zu steuern.
  10. Wasch gleitet dreimal in TBS plus 0,1% Tween-20 (TBST-Lösung) für jeweils 5 Minuten. Ändern Lösung zwischen Wäschen.
  11. Pipette einen Tropfen von markierten Polymeren zu jedem Abschnitt und inkubiere bei Raumtemperatur für 40 min. Hinweis: Das markierte Polymer durch Kombination von kommerziell Aminosäurepolymere mit Peroxidase und sekundärem Antikörper hergestellt wird, die zu einem Fab'-Fragmente reduziert wird. Das Reagenz ist bereit für die Verwendungimmunhistochemische Färbung von Maus-Gewebeschnitten.
  12. Wash gleitet dreimal in TBST für jeweils 5 Minuten. Ändern Lösung zwischen Wäschen.
  13. Pipette 3,3'-diaminobenzindine tetrahydrochlorid (DAB) Lösung auf Gewebeschnitt und läßt bei Raumtemperatur stehen, bis ein brauner Niederschlag unter einer Hellfeldmikroskopie sichtbar ist. Hinweis: Die Zeit für DAB in Gegenwart von Peroxidase zu fällen ist etwa 30 min.
  14. Tauchen Sie gleitet in Wasser zu Peroxidase-Aktivität zu stoppen. Dip Slides in Methyl grüne Lösung für die Kernfärbung. Wash gleitet dreimal in PBS für jeweils 5 Minuten.
  15. Platzieren ein Deckglas über den gefärbten Abschnitt, der mit permanentem Befestigungsmedium (8 & mgr; l pro Abschnitt) abgedeckt ist.

8. Foto und Analyse von gefärbten Gewebeschnitten

  1. Visualisieren H & E gefärbt und IHC Gewebeschnitte unter einem Hellfeld-Mikroskop. Erfassen von Bildern unter Verwendung von ladungsgekoppelten Vorrichtung (CCD) Kamera an das Mikroskop angebracht ist. für qengenAnalyse können Bildverarbeitungssoftware verwendet werden,
    1. Scannen Sie die ganzen gefärbten Schnitten eine Scanscope mit einem 20x-Objektiv verwendet wird.
    2. Messen Sie die epidermale Dicke im 1-mm-Segment der Epidermis und die Anzahl der Ki67-immunoreaktive Zellen innerhalb des Segments zählen.
      HINWEIS: Die quantitative Analyse wird unter Verwendung von Mikroskopie Automatisierung und Bildanalyse-Software durchgeführt. Epidermisdicke wird durch den Abstand zwischen der Basalschicht und der äußersten Schicht der Epidermis definiert.
    3. Zähle die Anzahl der Ly6G-immunoreaktive Zellen in der dermalen Bereich (230 x 270 um2 Rechteck) unmittelbar unter topischer IMQ behandelten Haut.

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Ergebnisse

Während einige Rötung innerhalb der ersten Stunde nach dem Einstechen mit Akupunkturnadeln evident war, die Haut am Tag 2 und kein nachteiliger Hautreaktionen 7 bis Tag gelöscht wurde nach Einstechen (2A) beobachtet. Nadeleinstich sehr niedriges Niveau von epidermalen Orthokeratose und minimaler dermalen Infiltration von H & E - Analyse im Vergleich zu unbehandelter Haut (2B) induziert. Die Dicke der Epidermis

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Diskussion

Der kritischste Schritt die Expression des acufected Plasmid-DNA, um sicherzustellen, ist gleichmäßig zu schwingen und die Hornschicht der Haut zu lösen. Während die Nadeln drückt sanft, ohne die Haut zu schneiden, sollte die Kraft stark genug sein, um die Oberfläche zu drücken. Zur Erleichterung der Aufnahme von DNA in 10 & mgr; l Lösung auf einer 1 cm x 1 cm Oberfläche, sollten die Nadeln oszillieren up-and-down für etwa 100-mal in 30 s. Man kann die Kraft bestimmen, die die Haut stechen muss und durch die Anzahl ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine finanziellen Interessen offen zu legen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von Finanzhilfe aus dem Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048) unterstützt. Wir danken Drs. Betty Wu-Hsieh und Chien-Kuo Lee an der NTU, Leigh Zerboni an der Stanford University und Dr. Peter Hoffmann an der Universität von Hawaii für das Manuskript zu lesen, Yun Chien an der NTU für die technische Unterstützung und Dr. Wen-Chi Wei in Landwirtschaft Biotechnologie Research Center an der Academia Sinica für technische Beratung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Accu Handy NeedleAccu36Gx0.5Medizinprodukt
NairTM LotionChurch & DwightN/AZur Haarentfernung verwenden
Shandon Xylin ErsatzThermo Fisher Scientific6764506Entparaffinierung
Avertin (2,2,2-Tribromethanol)Sigma-AldrichT4,840-2Anästhesie
2-Methyl-2-butanolSigma-Aldrich152463Lösungsmittel zum Auflösen von Avertin
DifcoTM LB Brühe, MillerBD244620Vermehrung und Erhaltung von E. coli für die Molekularbiologie
Maus IL-15/IL-15R Komplex ELISA Ready-SET-Go kiteBioscience88-7215Messung des IL-15-Proteins
Anti-Maus Ly6GBioLegend 127601Antikörper zur immunhistochemischen Färbung
Anti-Maus Ki-67eBioscience14-5698-80Antikörper zur Messung immunhistochemischer Farbstoff
Simple Stain Mouse MAXPO (Rat)Nichirei Biosciences414341FReagenz zum Blockieren des Hintergrundsignals in Maus-auf-Maus-Färbung
DAB Peroxidase (HRP) Substrat KitVector LaboratoriesSK-4100Peroxidse-Substrat für immunhistochemische Färbung
Ultra V BlockThermo Fisher ScientificTA-060-UBReduzieren Sie unspezifische Hintergrundfärbungen
MethylgrünSigma-AldrichM8884Kernfärbung
Vecta MountTMVector LaboratoriesM-5000Dauerhafte Konservierung histochemischer Färbungen
Proteasehemmer CocktailtablettenRoche04-693-116-001Hemmung der Proteaseaktivität im Zelllysat
Aldara Creme3M ParmaceuticalsN/A5% Imiquimod Creme
Bessman Tissue PulverizerSpectrum Labs189475Verwendung zur Pulverisierung von Hautgewebe
ABI7900HT CyclerThermo Fisher ScientificN/Aquantitativer real-time PCR Assay
CamcorderPanasonicHDC-SD60Bilddokumentation
Axio Scope.A1ZEISSN/AHellfeldmikroskopie

Referenzen

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