Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine vielseitige Einbettungsmethode, die die Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung der hinteren Körperentwicklung von lebenden Zebrafischembryonen ermöglicht, ohne die normale Entwicklung zu stören.

Zusammenfassung

Zebrabärbling-Embryonen bieten eine ideale experimentelle System komplexe morphogenetischen Prozesse zu untersuchen aufgrund ihrer leichten Zugänglichkeit und optische Transparenz. Insbesondere ist hintere Körperdehnung ein wesentlicher Prozess in der embryonalen Entwicklung, durch die Verformungen mehrere Gewebe zusammen, um die Bildung eines großen Teils der Körperachse zu lenken handeln. Um diesen Prozess durch langfristige Zeitraffer-Bildgebung zu beobachten, ist es notwendig, eine Montagetechnik zu verwenden, die ausreichende Unterstützung ermöglicht es, Proben in der richtigen Ausrichtung während der Übertragung an das Mikroskop und den Erwerb zu halten. Darüber hinaus muss die Montage bieten auch ausreichende Bewegungsfreiheit für das Auswachsen des hinteren Körperbereich ohne seine normale Entwicklung zu beeinflussen. Schließlich muss ein gewisses Maß an Vielseitigkeit des Montage Methode, um Bildgebung auf verschiedenen Abbildungsaufbauten ermöglichen. Hier präsentieren wir eine Montagetechnik für die Abbildung der Entwicklung des hinteren Körpers Elongation in der Zebrabärbling D. rerio. Diese Technik beinhaltet Embryonen, so dass der Kopf und Dottersack Regionen sind fast vollständig in Agarose enthalten, während das Weglassen der hinteren Körperbereich zu verlängern und zu entwickeln, die normalerweise Montage. Wir werden zeigen , wie sich dies für aufrecht, umgekehrt und vertikale Lichtbogen - Mikroskopie - Set-ups angepasst werden. Während dieses Protokoll Embryonen für die Bildgebung bei der Montage für den hinteren Körper konzentriert, könnte es leicht für die Live-Bildgebung von mehreren Aspekten der Zebrabärblingentwicklung angepasst werden.

Einleitung

Posterioren Körper Dehnung ist ein wesentlicher Prozess bei der Embryonalentwicklung, durch die der Embryo ein großer Teil der Körperachse zu bilden, erstreckt. Es ist ein Beispiel eines komplexen morphogenetic Prozess, bei dem mehrere Zellverhalten koordinativ die Morphogenese auf der Ebene der einzelnen Gewebe zu erzeugen, wirken. Diese unterschiedlichen Gewebedeformationen dann zusammen wirken, um die Dehnung des hinteren Körpers an der gesamten Strukturebene zu erzeugen. Um zu verstehen , wie diese Prozesse werden gesteuert , und während der Entwicklung koordiniert, müssen wir in der Lage sein , diese Verfahren bei mehreren Skalen zu folgen (dh auf der E....

Protokoll

1. Herstellung von Lösungen und Pulled Glasnadel

1. Machen Sie eine 25x Stammlösung von Tricaine (3-Amino benzoesäureethylester, die auch als Ethyl-3-aminobenzoat) bei 4 mg / ml in 20 mM Tris pH 8,8 und bringen diese Lösung bei pH 7. Aliquot von 4 ml und an einem -20 ° C.
   HINWEIS: Das Anästhetikum Tricaine wirkt bevorzugt auf neuronalen spannungsgesteuerten Natriumkanäle dadurch blockiert Muskelzuckungen und Bewegung ^6.
2. Machen Sie eine Arbeitslösung von Tricaine bei einer Endkonzentration von 0,17 mg / ml in E3 Embryo Medium. ⁷
   HINWEIS: Stellen Sie die Tricaine Arbeitslösung unvorbereitet....

Ergebnisse

Das Protokoll oben skizzierte Details eine vielseitige Technik zur Montage von Genaktivität für die Langzeit Zeitraffer-Bildgebung. Ein Beispiel hierfür ist in 2A und in animierter / Video - 1 gezeigt. Die Embryonen wurden in der 1-Zell-Stadium injiziert mit mRNA, die das Photokonvertierbare fluoreszierendes Protein kikumeGR kodiert. Am 15 Somiten Stadium wurden sie wie oben beschrieben montiert und für 12 h auf einem invertierten konfokalen Mikroskop mi.......

Diskussion

Diese Befestigungstechnik ermöglicht Embryonen noch während der Übertragung an das Mikroskop und über an folgenden hinteren Körperdehnung mehrere Längenskalen dem Ziel eines langfristigen Zeitraffer-Imaging Experimente gehalten werden. Darüber hinaus ist es vielseitig, dass sie für die Bildgebung auf beiden aufrechten und der inversen Mikroskopie Aufbauten erlaubt, und ein Vorschlag gemacht wird, wie dies weiter vertikal ausgerichtet SPIM angepasst werden.

Ein entscheidender Schritt in diese.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
VERBRAUCHSMATERIALIEN
Schalen mit Glasboden	Mattek	P35-1.5-10-C	35 mm Petrischale, 10 mm Mikrotigramm. Nr. 1.5 Deckglas
Kapillaren für Injektionsnadeln	Sutter	BF 120-94-10	Wir verwenden Orosilikatglas mit Filament, AD 1,20 mm, ID 0,94 mm, Länge 10 cm. Filamentnadeln sind jedoch nicht erforderlich und die meisten Injektionsstandardnadeln sollten funktionieren.
Mikroskalpell	Feather	P-715	Micro Feather opthalmisches Einwegskalpell mit Kunststoffgriff
Pasteurpipetten			230 mm lang
REAGENZIEN
Tricain	Sigma-Aldrich	A5040
Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt	Sigma-Aldrich	A9414
< strong>EQUIPMENT
Feine Pinzette	FINE SCIENCE TOOLS GMBH	11252-30	Dumont #5
Nadelabzieher	Sutter	P97	Heizfilament-Nadelzieher
Binokulares Präpariermikroskop	Leica	S8 Apo