Neuromuskuläre Synapse Messfunktionalität

Zusammenfassung

Eine funktionale Bewertung der neuromuskulären Synapse (NMJ) kann wesentliche Informationen über die Kommunikation zwischen Muskeln und Nerven. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die NMJ und Muskel Funktionalität mit zwei verschiedenen Muskel-Nerv-Präparate, d.h. Soleus-Ischias und Membran-Phrenicus umfassend zu bewerten.

Zusammenfassung

Neuromuskuläre Synapse (NMJ) Funktionalität spielt eine zentrale Rolle bei Krankheiten zu studieren, in denen die Kommunikation zwischen Motoneuron und Muskel, wie Altern und Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) vorliegt. Hier beschreiben wir ein experimentelles Protokoll, das verwendet werden kann, um NMJ Funktionalität zu messen, durch die Kombination von zwei Arten der elektrischen Stimulation: direkte Muskelstimulation Membran und die Stimulation durch den Nerv. Der Vergleich der Muskel-Reaktion auf diese zwei verschiedenen Stimulationen kann helfen, um zu definieren, auf der Funktionsebene, mögliche Änderungen in den NMJ, die funktionelle Rückgang der Muskulatur führen.

EX vivo Präparate eignen sich für gut kontrollierte Studien. Hier beschreiben wir eine intensive Protokoll um mehrere Parameter des Muskels und NMJ Funktionalität für die Vorbereitung der Soleus-sciatic Nerv und die Membran-Phrenicus Nerv Vorbereitung zu messen. Das Protokoll dauert ca. 60 Minuten und erfolgt ohne Unterbrechung durch eine maßgeschneiderte Software, die die Twitch-Kinetik-Eigenschaften, das Kraft-Frequenz-Verhältnis für Muskeln und Nerven Stimulationen und zwei Parameter spezifisch für NMJ Funktionalität, d.h. Neurotransmission scheitern und intratetanic Müdigkeit misst. Diese Methode wurde verwendet, um Schäden in Soleus und Zwerchfell Muskel-Nerv-Vorbereitungen mit SOD1^G93A transgenen Maus, ein experimentelles Modell Alsen, die ubiquitär die mutierten antioxidative Enzym Superoxid-Dismutase 1 (SOD1) overexpresses zu erkennen.

Einleitung

Die neuromuskuläre Synapse (NMJ) ist eine chemische Synapse, die durch die Verbindung zwischen der motorischen Endplatte der Muskelfaser und das Motoneuron Axon terminal gebildet. Die NMJ nachweislich eine entscheidende Rolle zu spielen, wenn die Kommunikation zwischen Muskeln und Nerven beeinträchtigt, wie es bei Alterung oder Amyotrophe Lateralsklerose (ALS). Da Muskeln und Nerven in einer bidirektionalen Weg^{1,2 kommunizieren}, kann NMJ Mängel getrennt vom Muskel Mängel Messen neue Einblicke in ihre pathophysiologischen Zusammenspiel vorsehen. In der Tat kann diese funktionale Bewertung helfen, um zu beurteilen, ob morphologische und biochemische Veränderungen Neurotransmission Signalisierung Funktionalität reduzieren.

Der Vergleich der Muskel kontraktile Antwort hervorgerufen durch Nervenstimulation und die Reaktion des gleichen Muskels hervorgerufen durch direkte Stimulation der seine Membran wurde vorgeschlagen, als eine indirekte Messung der NMJ Funktionalität. In der Tat können keine Unterschiede in den beiden kontraktilen Antworten seit Membran Stimulation von Umgehungsstraßen Neurotransmission Signalisierung, Änderungen in den NMJ zugeschrieben werden. Dieser Ansatz intensiv vorgeschlagen für Ratten^3,4,5,6,7wurde, und auch verwendet, um Informationen über Maus-Modelle^8,9,10,11,12zu sammeln.

Hier beschreiben wir ausführlich ein Verfahren zur Verbrauchsteuer und zwei Muskel-Nerv-Präparate, d. h. die Soleus-Ischias und Membran-Phrenicus Vorbereitungen zu testen. Mit einem maßgeschneiderten Software, entwickelt wir eine kontinuierliche Testprotokoll, das die Messung verschiedener Parameter kombiniert, die NMJ und Muskel Funktionalität charakterisieren damit eine umfassende Bewertung der NMJ Schaden separat von der Muskel nachgeben. Insbesondere misst das Protokoll Twitch Kraft, die Muskel-Kinetik, die Kraft-Frequenzkurve für direkte und Nerv Stimulationen, die Neurotransmission Fehler¹³ für eine feuern und tetanische Frequenzen, und die intratetanic Müdigkeit⁷.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission der Universität Sapienza in Rom - Abteilung für Histologie und medizinische Embryologie - genehmigt und in Übereinstimmung mit der aktuellen Version des italienischen Gesetzes zum Schutz von Tieren durchgeführt.

1. Versuchsaufbau

1. Aufbau des experimentellen Systems, bestehend aus 1 Aktuator/Wandler, 2 Stimulatoren, 1 In-vitro-Muskelapparat, 1 vorbereitendem Gewebebad, 1 Saugelektrode, 1 digitalem Oszilloskop, 1 Stereomikroskop, 1 Kaltlichtbeleuchtung, 1 Erfassungsplatine, 1 Anschlussblock und einem PC.
   HINWEIS: Hier wurde die Befehlssoftware in LabView programmiert und so konzipiert, dass sie eine hohe Flexibilität, Genauigkeit und Wiederholbarkeit der Stimulationen garantiert. Für jede Stimulation kann der Benutzer die Pulsbreite, Frequenz und Dauer auswählen und entscheiden, ob sie an die Membran oder über den Nerv abgegeben wird. Der Benutzer kann auch die Länge der Ruhephase vor jeder Stimulation auswählen.

2. Bewertungen der kontraktilen NMJ-Eigenschaften von Soleus- und Zwerchfellmuskeln

1. Aufwärmen des Systems
   1. Bereiten Sie den Krebs-Ringer-Puffer vor¹⁴ und legen Sie ihn in ein Bad aus der Eindeckvorrichtung und dem vorbereitenden Gewebebad. Stellen Sie eine mit 4 ml Silikon vorbereitete 60-mm-Schale in das vorbereitende Gewebebad.
   2. Schalten Sie das zirkulierende Wasserbad ein und stellen Sie die Temperatur auf 30 °C für den Musculus soleus und auf 27 °C für den Zwerchfellmuskel ein.
   3. Lassen Sie 95 % O₂ - 5 % CO₂ -Gemisch in beide Bäder fließen.
   4. Schalten Sie den Aktuator/Wandler und die beiden Impulsstimulatoren ein und stellen Sie die Stromwerte auf 300 mA für die Membranstimulation und auf 5 mA für die Nervenstimulation ein.
      HINWEIS: Es wurde bereits gezeigt, dass der Stromwert von 300 mA keine signifikante Kontraktion der Nervenäste induziert, wenn D-Tubocurarin zur Lösung hinzugefügt wird¹⁵. Der Stromwert von 5 mA entspricht der Strommenge, die erforderlich ist, um den Muskel durch den Nerv zu stimulieren, ohne eine Überlappung mit der durch die Lösung induzierten Membranstimulation zu erzeugen. Da der Abstand zwischen der Saugelektrode und dem Muskel von der Nervenlänge abhängig ist, muss dieser Stromwert vor jedem Versuch sorgfältig angepasst werden, wie im Folgenden beschrieben.
2. Soleus- und Zwerchfelldissektion
   1. Opfern Sie die Maus durch Zervixluxation, um das Leiden zu minimieren, und entfernen Sie sofort die Muskeln für die Tests wie folgt.
   2. Soleus-Ischias-Präparation, Dissektion und Einrichtung
      1. Sprühen Sie 70%iges Ethanol auf das Mausbein und entfernen Sie die Haut, die das Bein bedeckt. Machen Sie mit einer Schere einen Schnitt in den oberen Teil des Beins und ziehen Sie dann fest an der Haut. Isolieren Sie die Achillessehne von der Tibia und schneiden Sie dann die Achillessehne mit einer Schere durch.
      2. Klemmen Sie die Sehne mit einer Pinzette fest und ziehen Sie den Musculus gastrocnemius vorsichtig zusammen mit dem Soleus. Sobald die proximale Sehne des Soleus freigelegt ist, schneiden Sie die gesamte Wade mit einer Schere auf, während Sie die Achillessehne noch festhalten. Legen Sie die Gewebeprobe sofort in das vorbereitende Gewebebad.
      3. Stellen Sie das Vorbereitungsbad unter das Stereomikroskop und befestigen Sie das Kalb mit Edelstahlstiften mit einem Durchmesser von 0,20 mm an der Silikonschale. Klemmen Sie mit einer Pinzette die proximale Sehne des Soleus fest und ziehen Sie sanft daran, um die Ischiasinnervation freizulegen.
      4. Sobald die Innervation freigelegt ist (Abbildung 1), entfernen Sie vorsichtig das umgebende Gewebe, um etwa 5 mm des Nervs freizulegen. Verwenden Sie eine feine Schere, um den Nerv zu durchtrennen. Während Sie den Soleus mit einer Pinzette fest an der proximalen Sehne festklemmen, ziehen Sie ihn erneut und schneiden Sie ihn heraus, indem Sie die Achillessehne mit einer Schere durchtrennen.
      5. Führen Sie einen Nylondraht durch das Loch des Hebelarms des Aktuators/Wandlers. Ziehe eine Schlinge am Ende des Drahtes und greife die Achillessehne, bevor du den Draht zurückziehst, bis der Muskel das Bad des Montageapparats erreicht. Klemmen Sie die proximale Sehne in die feste Klemme und binden Sie den Nylondraht um den Hebelarm. Lassen Sie den Muskel in der Lösung ausbalancieren.
      6. Bestimmen Sie die anfängliche optimale Länge (L₀).
         1. Zuerst dehnst du den Muskel, um ihn bei 10 mN vorzuspannen (dieser Wert garantiert die maximale Zuckkraft (erfahrungsbasiert)). Dehnen Sie dann den Muskel sanft, um die Vorspannung zu ändern, und stimulieren Sie ihn mit einer Reihe von Einzelimpulsen. Die optimale Länge wird erreicht, wenn die maximale Zuckenkraft gemessen wird.
   3. Membran-Zwerchfell-Präparation, Dissektion und Aufbau
      1. Sprühen Sie 70% Ethanol auf die Maushaut. Entfernen Sie die Haut, die den Zwerchfellmuskel bedeckt, indem Sie mit einer Schere einen Schnitt über dem Brustbein machen und die Haut fest ziehen.
      2. Schneiden Sie mit einer Schere den Bauch waagerecht unterhalb des Brustbeins ab und entfernen Sie vorsichtig mit einer Pinzette den Darm und die Organe. Verwende eine dicke Schere, um die Wirbelsäule zu schneiden.
      3. Die Rippen ca. 1 cm über dem Brustbein einschneiden und waagerecht vorgehen. Entfernen Sie vorsichtig die äußeren Organe mit einer Pinzette und schneiden Sie die Wirbelsäule auf, um einen kreisförmigen Ring aus Rippen zu erhalten, der das Zwerchfell enthält.
      4. Waschen Sie das Präparat in einer Schale mit dem Krebs Ringer-Puffer und legen Sie es dann mit der Oberseite nach oben und dem Brustbein nach vorne in die Silikonschale in das vorbereitende Gewebebad.
      5. Entfernen Sie mit dem Stereomikroskop vorsichtig die Lunge und die restlichen Organe; der Nervus phrenicus ist auf der rechten Seite sichtbar (Abbildung 2A).
      6. Schneiden Sie die Rippen so ab, dass ein Ring von ca. 2 mm entlang der Membran verbleibt.
      7. Befestigen Sie mit einer Pinzette einen Edelstahlstift mit einem Durchmesser von 0,20 mm an der zentralen Sehne des Zwerchfells an dem Punkt, der der Innervation des Zwerchfellnervs entspricht, und einen weiteren Stift an den Rippen auf derselben Achse, um den interessierenden Zwerchfellstreifen zu identifizieren.
      8. Befestigen Sie zwei zusätzliche Stifte an der zentralen Sehne und zwei weitere Stifte an den Rippen auf beiden Seiten des ausgewählten Streifens, um die Membran auszulegen. Reinigen Sie gegebenenfalls den Nervus phrenicus mit einer Pinzette vom umgebenden Bindegewebe.
      9. Schneiden Sie mit einer gebogenen Klinge das Zwerchfell auf beiden Seiten der Innervation ab, um einen Sehnen-Muskel-Rippen-Streifen zu identifizieren, wie in Abbildung 2B gezeigt.
      10. Führen Sie einen Nylondraht durch das Loch des Hebelarms des Aktuators/Wandlers. Ziehe eine Schlinge am Ende des Drahtes und greife die Sehne, bevor du den Draht zurückziehst, bis der Muskel das Bad des Montageapparats erreicht.
      11. Klemmen Sie die Rippen in die feste Klemme und binden Sie den Nylondraht um den Hebelarm.
      12. Lassen Sie den Muskel in der Lösung ausgleichen und bestimmen Sie die anfängliche optimale Länge (L0).
          1. Dehnen Sie den Muskel, um ihn bei 5 mN vorzubelasten. Dehnen Sie den Muskel sanft, um die Vorspannung zu ändern, und stimulieren Sie ihn mit einer Reihe von Einzelimpulsen. Die optimale Länge wird erreicht, wenn die maximale Zuckenkraft gemessen wird.

Abbildung 1 - Präparation des Nervus soleus. Nervus soleus-ischiasis während des chirurgischen Eingriffs für die Funktionstests. Der Ischias wird mit einer Pinzette freigelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2 - Präparation des Zwerchfell-Zwerchfellnervs. Das Bild zeigt eine Phase der Präparation des Nervus diaphram-phrenicus (A) und den Streifen, der für Funktionstests montiert werden soll (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Messung der NMJ-Eigenschaften getrennt von der Muskelkontraktilität
   1. Stellen Sie die beste Stromstärke für die Stimulation durch den Nerv ein und stellen Sie sicher, dass die durch die Saugelektrode abgegebenen Stromimpulse durch die Ausbreitung des Stroms im Bad keine Muskelkontraktion hervorrufen.
      1. Platzieren Sie die Saugelektrode in der Nähe des Muskels und ziehen Sie den Nerv hinein. Während Sie die Stromstärke sanft erhöhen (ab 5 mA), stimulieren Sie den Muskel mit einer Reihe von Einzelimpulsen. Der optimale Stromwert wird ermittelt, wenn die Zuckkraft maximal ist.
      2. Schieben Sie den Nerv aus der Elektrode und geben Sie einige einzelne Impulse ab. Stellen Sie sicher, dass sich der Muskel nicht aufgrund einer Überlappung mit der Membranstimulation mittels der Lösung zusammenzieht. Ziehen Sie den Nerv wieder ein.
   2. Starten Sie das Programm und wählen Sie die Eingabedatei aus, um das gewünschte Testprotokoll auszuführen.
      HINWEIS: Die Eingabedatei enthält alle Stimulationsparameter, die zum Ausführen des gesamten Protokolls erforderlich sind. Obwohl für die beiden Muskeln die gleiche Protokollstruktur verwendet wird, unterscheiden sich die Stimulationsparameter je nach Protokoll, bezogen auf den Soleus- oder Zwerchfellmuskel.
      1. Stimulation des Nervus soleus-ischias, (siehe Tabelle 1)
         1. Verwenden Sie für alle elektrischen Stimulationen die folgenden Pulsbreiten: 1,4 ms für die Stimulation des Ischiasnervs und 0,1 ms für die direkte Soleus-Stimulation. Das vollständige Protokoll dauert ca. 65 Minuten.
      2. Stimulation des Zwerchfell-Zwerchfellnervs (siehe Tabelle 2)
         1. Verwenden Sie für alle elektrischen Stimulationen die folgenden Pulsbreiten: 1,8 ms für die Stimulation des Nervus phrenica und 0,2 ms für die direkte Zwerchfellstimulation. Das vollständige Protokoll dauert ca. 55 Minuten.
      3. Messen Sie am Ende des Versuchsprotokolls die Länge und das Nassgewicht des Muskels mit einem analogen Messschieber mit einer Genauigkeit von 0,05 mm bzw. einer Präzisionswaage mit einer Genauigkeit von 0,1 mg.
         1. Berechnen Sie die Querschnittsfläche (CSA), indem Sie die Muskelmasse durch das Produkt aus optimaler Faserlänge (L_f) und der Dichte der Skelettmuskulatur von Säugetieren (1,06 mg/mm³) dividieren¹⁶.
            HINWEIS: L_f erhält man durch Multiplikation von L₀ mit dem Verhältnis von Faserlänge zu Muskellänge (0,71 für Soleus muscle¹⁶ und 1 für den Zwerchfellmuskel¹⁷).

kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg

Art des Versuchs	Frequenz	Dauer	Wiederholungen	Muskel- oder Nervenstimulation	Zweck
	(Hz)	(s)
zucken	Einzelner Impuls		1	Muskel	Zuckungskraft und Kinetik
Ruhepause		30
zucken	Einzelner Impuls		1	Nerv
Ruhepause		30
zucken	Einzelner Impuls		1	Muskel
Ruhepause		30
zucken	Einzelner Impuls		1	Nerv
Ruhepause		Nr. 120
Nicht verschmolzener Tetanus	40	0,8	1	Nerv	Kraft-/Frequenzkurven für Nerven- und Muskelstimulationen
Ruhepause		180
Nicht verschmolzener Tetanus	60	0,8	1	Muskel
Ruhepause		180
Fusionierter Tetanus	80	0,8	1	Nerv
Ruhepause		180
Nicht verschmolzener Tetanus	20	0,8	1	Muskel
Ruhepause		180
Nicht verschmolzener Tetanus	60	0,8	1	Nerv
Ruhepause		180
Fusionierter Tetanus	80	0,8	1	Muskel
Ruhepause		180
Nicht verschmolzener Tetanus	20	0,8	1	Nerv
Ruhepause		180
Nicht verschmolzener Tetanus	40	0,8	1	Muskel
Ruhepause		300
Ermüdungsparadigma	35	0,8	1 Muskelstimulation gefolgt von 14 Nervenstimulationen mit einer Ruhezeit von je 1,2 s, 20 mal wiederholt		Versagen der Neurotransmission (NF)
Ruhepause		900
Ermüdungsparadigma	80	0,8	1 Muskelstimulation gefolgt von 14 Nervenstimulationen mit einer Ruhezeit von je 1,2 s, 20 mal wiederholt		Neurotransmissionsversagen (NF) und intratetanische Müdigkeit (IF)

Tabelle 1 - Protokoll zur Stimulation des Soleus-Ischiasnervs. Die Tabelle listet die Abfolge der Tests auf, die das vollständige Protokoll für die Untersuchung von Präparaten des Nervus soleus-ischias' bilden.

kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg

Art des Versuchs	Frequenz	Dauer	Wiederholungen	Muskel- oder Nervenstimulation	Zweck
	(Hz)	(s)
zucken	Einzelner Impuls		1	Muskel	Zuckungskraft und Kinetik
Ruhepause		30
zucken	Einzelner Impuls		1	Nerv
Ruhepause		30
zucken	Einzelner Impuls		1	Muskel
Ruhepause		30
zucken	Einzelner Impuls		1	Nerv
Ruhepause		Nr. 120
Nicht verschmolzener Tetanus	60	0,5	1	Nerv	Kraft-/Frequenzkurven für Nerven- und Muskelstimulationen
Ruhepause		Nr. 120
Fusionierter Tetanus	100	0,5	1	Muskel
Ruhepause		180
Nicht verschmolzener Tetanus	40	0,5	1	Nerv
Ruhepause		Nr. 120
Nicht verschmolzener Tetanus	20	0,5	1	Muskel
Ruhepause		Nr. 120
Nicht verschmolzener Tetanus	80	0,5	1	Nerv
Ruhepause		150
Nicht verschmolzener Tetanus	80	0,5	1	Muskel
Ruhepause		150
Nicht verschmolzener Tetanus	20	0,5	1	Nerv
Ruhepause		Nr. 120
Fusionierter Tetanus	100	0,5	1	Muskel
Ruhepause		150
Fusionierter Tetanus	100	0,5	1	Nerv
Ruhepause		180
Nicht verschmolzener Tetanus	60	0,5	1	Muskel
Ruhepause		300
Ermüdungsparadigma	35	0,33	1 Muskelstimulation gefolgt von 14 Nervenstimulationen mit einer Ruhezeit von je 0,67 s, 20 mal wiederholt		Versagen der Neurotransmission (NF)
Ruhepause		900
Ermüdungsparadigma	80	0,33	1 Muskelstimulation gefolgt von 14 Nervenstimulationen mit einer Ruhezeit von je 0,67 s, 20 mal wiederholt		Neurotransmissionsversagen (NF) und intratetanische Müdigkeit (IF)

Tabelle 2 - Protokoll zur Stimulation des Zwerchfell-Zwerchfellnervs. In der Tabelle ist die Abfolge der Tests aufgeführt, die das vollständige Protokoll für die Untersuchung von Zwerchfell-Sprenicus-Präparaten bilden.

3. Datenanalyse

HINWEIS: Am Ende des Protokolls berechnen Sie alle gewünschten Parameter wie folgt.

1. Von der Einzelpulsstimulation
   1. Berechnen Sie die Zuckungskraft (mN; maximale aktive Kraft, die während des Zuckens erzeugt wird) und die spezifische Zuckkraft (mN/^{mm 2}). Berechnen Sie sie, indem Sie den anfänglichen Vorspannungswert von der maximalen Kraft subtrahieren, die vom Muskel erzeugt wird. Berechnen Sie die spezifische Zuckungskraft als Zuckkraft geteilt durch den Muskel-CSA.
   2. Berechnen Sie die Zeit bis zur Spitzenspannung (TTP) (ms) als Zeit von der Impulsfreigabe bis zur Zuckungskraft.
   3. Berechnen Sie die halbe Relaxationszeit (1/2RT) (ms) als die Zeit von der Zuckenkraft bis zu 50 % der Zuckenkraft.
   4. Berechnen Sie dF/dt (mN/ms) als Maximalwert der Kraftableitung während der kontraktilen Phase.
   5. Berechnen Sie -dF/dt (mN/ms) als Maximalwert der Kraftableitung während der Relaxationsphase.
2. Von Impulsfolge-Stimulationen
   1. Berechnen Sie die nicht abgesicherte Kraft (mN) und die spezifische nicht abgesicherte Kraft (mN/mm²). Berechnen Sie sie, indem Sie den anfänglichen Vorspannungswert von der maximalen Kraft subtrahieren, die vom Muskel erzeugt wird. Berechnen Sie die spezifische nicht gesicherte Kraft als nicht gesicherte Kraft dividiert durch den Muskel CSA.
      HINWEIS: Die nicht abgesicherte Kraft ist die maximale aktive Kraft, die während einer Impulsfolge mit einer Frequenz erzeugt wird, die niedriger als die tetanische Frequenz ist.
   2. Berechnen Sie die tetanische Kraft (mN) und die spezifische tetanische Kraft (mN/mm2); die maximale Kraft ist die maximale aktive Kraft, die während einer Impulsfolge mit tetanischer Frequenz erzeugt wird. Berechnen Sie sie, indem Sie den anfänglichen Vorspannungswert von der maximalen Kraft subtrahieren, die vom Muskel erzeugt wird. Berechnen Sie die spezifische tetanische Kraft als tetanische Kraft geteilt durch den Muskel CSA.
   3. Berechnen Sie die Kraft-Frequenz-Kurve. Stellen Sie den Wert der Kraft (oder spezifischen Kraft), die für jede Stimulation erhalten wird, im Vergleich zur zunehmenden Häufigkeit der Stimulation dar. Typischerweise beginnt sie mit der Einzelpulsstimulation und endet mit der tetanischen Frequenz.
3. Von Ermüdungsparadigmen
   1. Berechnen Sie das Versagen der Neurotransmission (NF) als:
      
      wobei MF die Kraftabnahme nach Muskelstimulation und F die Kraftabnahme nach Nervenstimulation ist, gemessen an der ersten Pulsfolge nach der Muskelstimulation.
   2. Berechnen Sie die intratetanische Ermüdung (IF) als:
      
      wobei F_lp die Kraft ist, die der Muskel beim letzten Stimulationsimpuls erzeugt, und F_m die maximale Kraft ist, die der Muskel während desselben Pulslaufs erzeugt. Hinsichtlich der Nervenstimulation ist die intratetanische Ermüdung auf der ersten Pulsfolge unmittelbar nach der direkten Stimulation zu berechnen.

4. Statistische Analyse

HINWEIS: Die statistischen Analysemodelle müssen danach ausgewählt werden, ob die Muskelreaktion auf Nerven- und Membranstimulationen innerhalb desselben Tiermodells oder zwischen 2 verschiedenen Tiermodellen verglichen wird^18,19.

1. Verwenden Sie den Student's t-Test für TTP, 1/2RT, dF/dt, -dF/dt, wenn Sie nur Muskelreaktionen auf direkte und indirekte Stimulationen vergleichen. Beim Vergleich von Muskelpräparaten, die aus 2 verschiedenen Mausstämmen gewonnen wurden, verwenden Sie die 2-Wege-ANOVA mit Stimulationstyp und Mausstamm als feste Faktoren. Wenn die 2-Wege-ANOVA ein signifikantes Ergebnis zurückgibt, verwenden Sie mehrere Vergleichstests, um nach statistischen Unterschieden zu suchen.
2. Für die Kraft-Frequenz-Kurve (wenn nur Muskelreaktionen mit direkten und indirekten Stimulationen verglichen werden) verwenden Sie eine 2-Wege-ANOVA mit Stimulationstyp und Häufigkeit der Stimulation als feste Faktoren. Verwenden Sie bei Bedarf mehrere Vergleichstests.
   1. Beim Vergleich von Muskelpräparaten, die aus 2 verschiedenen Mausstämmen gewonnen wurden, verwenden Sie die 3-Wege-ANOVA mit Stimulationstyp, Häufigkeit der Stimulation und Mausstamm als feste Faktoren.
      1. Wenn die 3-Wege-ANOVA einen signifikanten Effekt der Faktoren Tierstamm und Stimulationstyp hat, verwenden Sie die 2-Wege-ANOVA, um signifikante Unterschiede zwischen jeweils 2 Gruppen zu identifizieren. So können beispielsweise Unterschiede zwischen der Muskelreaktion der 2 Gruppen auf Membranstimulation oder zwischen der Muskelreaktion auf direkte und indirekte Stimulationen innerhalb einer Gruppe beurteilt werden.
3. Intratetanische Ermüdung
   HINWEIS: Da das Protokoll so konzipiert wurde, dass es auch bei Kontrollmäusen eine Ermüdung als Reaktion auf Nervenstimulation induziert, kann dieser Parameter nur zur Untersuchung von Unterschieden zwischen 2 Mausstämmen verwendet werden, und eine statistische Analyse innerhalb einer einzigen Gruppe würde immer signifikante Unterschiede ergeben.
   1. Um zwei Gruppen zu vergleichen, verwenden Sie die 3-Wege-ANOVA mit Stimulationstyp, Zeit und Mausbelastung als feste Faktoren. Wenn die 3-Wege-ANOVA einen signifikanten Effekt der Faktoren Tierstamm und Stimulationstyp ergibt, verwenden Sie die 2-Wege-ANOVA, um signifikante Unterschiede zwischen jeweils 2 Gruppen zu identifizieren, wie bei der Kraft-Frequenz-Kurve.
4. Bei Neurotransmissionsfehlern verwenden Sie eine 2-Wege-ANOVA mit tierischer Belastung und Zeit als feste Faktoren. Wenn signifikante Ergebnisse zurückgegeben werden, verwenden Sie mehrere Vergleichstests, um nach statistischen Unterschieden zu suchen.
   HINWEIS: Da dieser Parameter nur einen Wert für jede Mausbelastung zurückgibt, können verschiedene Mausmodelle verglichen werden.
5. Verwenden Sie für Muskelgewicht, -länge und -intelligenz den Student's t-Test, um Unterschiede beim Vergleich von Muskel-Nerven-Präparaten aus verschiedenen Tiermodellen zu untersuchen.

Ergebnisse

Das Protokoll, die, das wir beschrieben, informiert über funktionelle Denervierung in verschiedenen neuromuskulären Erkrankungen oder Alterung Sarkopenie. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um festzustellen, ob (und wenn ja, auf welcher Ebene) Muskel Änderungen sind durch selektive Veränderungen, die im Muskel selbst oder in der neuromuskulären Übertragung auftreten. Die unten angezeigten Daten sind die Ergebnisse der bisherigen Arbeit von unserer Gruppe¹⁸, au...

Diskussion

Das experimentelle Protokoll beschriebenen bietet eine ideale Möglichkeit Mess-und diskriminieren funktionellen Veränderungen, die direkt in den Muskel oder eingetreten, indirekt auf die neuromuskuläre Synapse-Ebene. Da diese Technik auf eine indirekte Messung der NMJ Funktionalität basiert, kann es verwendet werden, um festzustellen, ob Mängel zu morphologischen Veränderungen oder biochemische Veränderungen zusammenhängt. Im Gegensatz dazu bietet es ein wirksames Mittel zur Feststellung, ob keine morphologische und bioc...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dual-Mode-Hebelsystem	Aurora Scientific Inc.	300B	Aktuator/Wandler
Bi-Phasen-Hochleistungsstimulator	Aurora Scientific Inc.	701B	Impulsstimulator (Nerv)
Zweiphasen-Hochleistungsstimulator	Aurora Scientific Inc.	701C	Pulsstimulator (Muskel)
In-vitro-Muskelapparat	Aurora Scientific Inc.	800A
Vorbereitendes Gewebebad	Radnoti	158400
Monopolare Saugelektrode	A-M Systems	573000	mit einer hausgemachten Referenz
Oszilloskop	Tektronix	TDS2014
Stereomikroskop	Nikon	SMZ 800
Kaltlichtbeleuchtung	Photonic Optics	PL 3000
Erfassungskarte	National Instruments	NI PCIe-6353
Anschlussblock	National Instruments	NI 2110
PC	AMD Phenom II x4 970		Prozessor 3,50 Ghz mit Windows 7
LabView 2012 Software	National Instruments
Krebs-Ringer Bikarbonat Puffer	Sigma-Aldrich	K4002	physiologischer Puffer
Natriumbicarbonat	Sigma-Aldrich	S5761
Calciumchlorid CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901	wasserfrei, Pulver, ≥ 97%
Puffer HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	&ge≥ 99,5% (Titration)
Schalen 60mm x 15mm	Falcon	353004	Polystyrol
Silikon	Sylgard	184 Silikon	Elastomer-Kit & nbsp; 0,5 kg.
Thermostat	Dennerle	DigitalDuomat 1200
Pumpe	Newa Mini	MN 606	für Aquarium
Hitzebeständigkeit Thermokabel	Lucky Reptile	61403-1	50/60Hz 50W
Eimer	beliebig 10 Liter		Polypropylen
O2 + 5%CO2	siad		Mischgas
#5 Pinzette	Fine Science Tools	11252-20	2 Stück
Federschere - 8 mm Klingen	Fine Science Tools	15024-10	Nervenexzision
Scharfe Schere	Feine wissenschaftliche Werkzeuge	14059-11	Muskelentfernung
Zarte Schere	Wagner	02.06.32	Außenseite des Tieres
Student Skalpellgriff #3	Feinwissenschaftliche Werkzeuge	91003-12
Skalpellklingen #10	Feinwissenschaftliche Werkzeuge	10010-00
Skalpellklingen #11	Feinwissenschaftliche Werkzeuge	10011-00
Nylondraht & Oslash; 0,16 mm	beliebig