Eine funktionale Bewertung der neuromuskulären Synapse (NMJ) kann wesentliche Informationen über die Kommunikation zwischen Muskeln und Nerven. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die NMJ und Muskel Funktionalität mit zwei verschiedenen Muskel-Nerv-Präparate, d.h. Soleus-Ischias und Membran-Phrenicus umfassend zu bewerten.
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Methodenartikel
Neuromuskuläre Synapse Messfunktionalität
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Neuromuskuläre Synapse (NMJ) Funktionalität spielt eine zentrale Rolle bei Krankheiten zu studieren, in denen die Kommunikation zwischen Motoneuron und Muskel, wie Altern und Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) vorliegt. Hier beschreiben wir ein experimentelles Protokoll, das verwendet werden kann, um NMJ Funktionalität zu messen, durch die Kombination von zwei Arten der elektrischen Stimulation: direkte Muskelstimulation Membran und die Stimulation durch den Nerv. Der Vergleich der Muskel-Reaktion auf diese zwei verschiedenen Stimulationen kann helfen, um zu definieren, auf der Funktionsebene, mögliche Änderungen in den NMJ, die funktionelle Rückgang der Muskulatur führen.
EX vivo Präparate eignen sich für gut kontrollierte Studien. Hier beschreiben wir eine intensive Protokoll um mehrere Parameter des Muskels und NMJ Funktionalität für die Vorbereitung der Soleus-sciatic Nerv und die Membran-Phrenicus Nerv Vorbereitung zu messen. Das Protokoll dauert ca. 60 Minuten und erfolgt ohne Unterbrechung durch eine maßgeschneiderte Software, die die Twitch-Kinetik-Eigenschaften, das Kraft-Frequenz-Verhältnis für Muskeln und Nerven Stimulationen und zwei Parameter spezifisch für NMJ Funktionalität, d.h. Neurotransmission scheitern und intratetanic Müdigkeit misst. Diese Methode wurde verwendet, um Schäden in Soleus und Zwerchfell Muskel-Nerv-Vorbereitungen mit SOD1G93A transgenen Maus, ein experimentelles Modell Alsen, die ubiquitär die mutierten antioxidative Enzym Superoxid-Dismutase 1 (SOD1) overexpresses zu erkennen.
Einleitung
Die neuromuskuläre Synapse (NMJ) ist eine chemische Synapse, die durch die Verbindung zwischen der motorischen Endplatte der Muskelfaser und das Motoneuron Axon terminal gebildet. Die NMJ nachweislich eine entscheidende Rolle zu spielen, wenn die Kommunikation zwischen Muskeln und Nerven beeinträchtigt, wie es bei Alterung oder Amyotrophe Lateralsklerose (ALS). Da Muskeln und Nerven in einer bidirektionalen Weg1,2 kommunizieren, kann NMJ Mängel getrennt vom Muskel Mängel Messen neue Einblicke in ihre pathophysiologischen Zusammenspiel vorsehen. In der Tat kann diese funktionale Bewertung helfen, um zu beurteilen, ob morphologische und biochemische Veränderungen Neurotransmission Signalisierung Funktionalität reduzieren.
Der Vergleich der Muskel kontraktile Antwort hervorgerufen durch Nervenstimulation und die Reaktion des gleichen Muskels hervorgerufen durch direkte Stimulation der seine Membran wurde vorgeschlagen, als eine indirekte Messung der NMJ Funktionalität. In der Tat können keine Unterschiede in den beiden kontraktilen Antworten seit Membran Stimulation von Umgehungsstraßen Neurotransmission Signalisierung, Änderungen in den NMJ zugeschrieben werden. Dieser Ansatz intensiv vorgeschlagen für Ratten3,4,5,6,7wurde, und auch verwendet, um Informationen über Maus-Modelle8,9,10,11,12zu sammeln.
Hier beschreiben wir ausführlich ein Verfahren zur Verbrauchsteuer und zwei Muskel-Nerv-Präparate, d. h. die Soleus-Ischias und Membran-Phrenicus Vorbereitungen zu testen. Mit einem maßgeschneiderten Software, entwickelt wir eine kontinuierliche Testprotokoll, das die Messung verschiedener Parameter kombiniert, die NMJ und Muskel Funktionalität charakterisieren damit eine umfassende Bewertung der NMJ Schaden separat von der Muskel nachgeben. Insbesondere misst das Protokoll Twitch Kraft, die Muskel-Kinetik, die Kraft-Frequenzkurve für direkte und Nerv Stimulationen, die Neurotransmission Fehler13 für eine feuern und tetanische Frequenzen, und die intratetanic Müdigkeit7.
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Protokoll
Alle Tierversuche wurden vom Ethikkomitee der Sapienza-Universität Rom – Abteilung für Histologie und Medizinische Embryologie genehmigt und gemäß der geltenden Fassung des italienischen Tierschutzgesetzes durchgeführt.
1. Experimenteller Aufbau
- Richten Sie das experimentelle System ein, das aus 1 Aktuator/Transduktor, 2 Stimulatoren, 1 in-vitro-Muskelapparatur, 1 präparativer Gewebewanne, 1 Saugnadelelektrode, 1 digitalem Oszilloskop, 1 Stereomikroskop, 1 Kaltlichtbeleuchtung, 1 Erfassungsplatine, 1 Anschlussblock und einem Personalcomputer besteht.
HINWEIS: Die Steuersoftware wurde hier in LabView programmiert und so konzipiert, dass hohe Flexibilität, Genauigkeit und Wiederholbarkeit der Stimulationsabläufe gewährleistet ist. Für jede Stimulation kann der Benutzer Pulsbreite, Frequenz und Dauer auswählen sowie festlegen, ob die Stimulation an die Membran oder über den Nerv erfolgen soll. Außerdem kann der Benutzer die Dauer der Ruhephase vor jeder Stimulation festlegen.
2. Untersuchungen der kontraktilen Eigenschaften der NMJ von Musculus soleus und Zwerchfellmuskulatur
- Systemaufwärmung
- Bereiten Sie den Krebs-Ringer-Puffer14 vor und geben Sie ihn in das Bad der Montagevorrichtung und in das vorbereitende Gewebabad. Stellen Sie eine 60-mm-Schale, die mit 4 ml Silikon vorbereitet wurde, in das vorbereitende Gewebabad.
- Schalten Sie das Zirkulationswasserbad ein und stellen Sie die Temperatur auf 30 °C für den Musculus soleus und auf 27 °C für den Zwerchfellmuskel ein.
- Lassen Sie ein Gemisch aus 95 % O2 und 5 % CO2 in beide Bäder strömen.
- Schalten Sie den Aktuator/Transducer und die beiden Impulsstimulatoren ein, und stellen Sie die Stromwerte auf 300 mA für die Membranstimulation und auf 5 mA für die Nervenstimulation ein.
HINWEIS: Es wurde bereits früher gezeigt, dass der Stromwert von 300 mA keine signifikante Kontraktion der Nervenäste induziert, wenn D-Tubocurarin der Lösung zugesetzt wird15. Der Stromwert von 5 mA entspricht der Menge an Strom, die erforderlich ist, um den Muskel über den Nerv zu stimulieren, ohne dabei eine Überlappung mit der durch die Lösung hervorgerufenen Membranstimulation zu erzeugen. Da der Abstand zwischen der Saugnadelelektrode und dem Muskel von der Nervenlänge abhängt, muss dieser Stromwert vor jedem Experiment sorgfältig angepasst werden, wie unten beschrieben.
- Präparation von Musculus soleus und Zwerchfell
- Töten Sie die Maus durch Halswirbelbruch, um Leiden zu minimieren, und entnehmen Sie unmittelbar danach die Muskeln zur Untersuchung wie folgt.
- Präparation, Dissektion und Aufbau des Musculus soleus mit Nervus ischiadicus
- Besprühen Sie das Bein der Maus mit 70 %igem Ethanol und entfernen Sie die Haut, die das Bein bedeckt. Machen Sie mit einer Schere einen Schnitt im oberen Teil des Beins und ziehen Sie die Haut fest nach außen. Isolieren Sie die Achillessehne von der Tibia und durchtrennen Sie anschließend die Achillessehne mit einer Schere.
- Klemmen Sie die Sehne mit einer Pinzette fest ein und ziehen Sie vorsichtig den Musculus gastrocnemius zusammen mit dem Musculus soleus nach außen. Sobald die proximale Sehne des Musculus soleus freigelegt ist, durchtrennen Sie den gesamten Unterschenkel mit einer Schere, während Sie die Achillessehne weiterhin festhalten. Legen Sie die Gewebeprobe unmittelbar in das vorbereitende Gewebabad.
- Stellen Sie das vorbereitende Bad unter das Stereomikroskop und fixieren Sie den Unterschenkel mit 0,20 mm Durchmesser umfassenden Edelstahlnadeln in der Silikonschale. Klemmen Sie mit einer Pinzette die proximale Sehne des Musculus soleus fest und ziehen Sie vorsichtig, um die Innervation durch den Nervus ischiadicus freizulegen.
- Sobald die Innervation freigelegt ist (Abbildung 1), entfernen Sie vorsichtig das umgebende Gewebe, um etwa 5 mm des Nervs freizulegen. Durchtrennen Sie den Nerv mit einer feinen Schere. Während Sie den Musculus soleus mit einer Pinzette an der proximalen Sehne fest eingespannt halten, ziehen Sie erneut leicht nach und entfernen ihn, indem Sie die Achillessehne mit einer Schere durchtrennen.
- Fädeln Sie einen Nylonfaden durch das Loch des Hebelarms des Aktuators/Transducers. Bilden Sie am Ende des Fadens eine Schlaufe und greifen Sie die Achillessehne, bevor Sie den Faden zurückziehen, bis der Muskel das Bad der Montagevorrichtung erreicht. Klemmen Sie die proximale Sehne in der festen Klemme ein und binden Sie den Nylonfaden um den Hebelarm. Lassen Sie den Muskel sich in der Lösung einkurzieren.
- Bestimmen Sie die anfängliche optimale Länge (L0).
- Dehnen Sie den Muskel zunächst, um ihn mit einer Vorspannung von 10 mN vorzuspannen (dieser Wert garantiert die maximale Zuckungskraft, basierend auf Erfahrung). Dehnen Sie den Muskel anschließend vorsichtig, um die Vorspannung zu verändern, und stimulieren Sie ihn mit einer Serie einzelner Impulse. Die optimale Länge ist erreicht, wenn die maximale Zuckungskraft gemessen wird.
- Präparation, Dissektion und Aufbau des Zwerchfells mit Nervus phrenicus
- Besprühen Sie die Haut der Maus mit 70 %igem Ethanol. Entfernen Sie die Haut, die den Zwerchfellmuskel bedeckt, indem Sie mit einer Schere einen Schnitt über dem Sternum machen und die Haut fest nach außen ziehen.
- Cutten Sie mit einer Schere den Bauch unterhalb des Sternums horizontal durch und entfernen Sie vorsichtig Darm und Organe mit einer Pinzette. Verwenden Sie eine dicke Schere, um die Wirbelsäule durchzutrennen.
- Cutten Sie die Rippen etwa 1 cm oberhalb des Sternums und fahren Sie horizontal fort. Entfernen Sie vorsichtig die äußeren Organe mit einer Pinzette und durchtrennen Sie die Wirbelsäule, um einen kreisförmigen Rippenring mit dem Zwerchfell zu erhalten.
- Spülen Sie die Präparation in einer Schale mit Krebs-Ringer-Puffer aus und legen Sie sie anschließend mit der Oberseite nach oben und dem Sternum nach vorne in die Silikonschale innerhalb des vorbereitenden Gewebebads.
- Entfernen Sie unter dem Stereomikroskop vorsichtig die Lungen und restlichen Organe; der Nervus phrenicus wird auf der rechten Seite sichtbar (Abbildung 2A).
- Kürzen Sie die Rippen so, dass ein Ring von etwa 2 mm entlang des gesamten Zwerchfells verbleibt.
- Befestigen Sie mit einer Pinzette eine 0,20 mm dicke Edelstahlnadel am zentralen Sehnenansatz des Zwerchfells an der Stelle, die der Innervation durch den Nervus phrenicus entspricht, und eine weitere Nadel an den Rippen auf derselben Achse, um den gewünschten Zwerchfellstreifen zu markieren.
- Befestigen Sie zwei weitere Nadeln am zentralen Sehnenansatz und jeweils zwei Nadeln an den Rippen auf beiden Seiten des ausgewählten Streifens, um das Zwerchfell auszuspannen. Falls erforderlich, reinigen Sie den Nervus phrenicus mit der Pinzette vom umgebenden Bindegewebe.
- Cutten Sie mit einer gekrümmten Klinge das Zwerchfell beidseits der Innervation durch, um einen Sehne-Muskel-Rippen-Streifen wie in Abbildung 2B dargestellt zu isolieren.
- Fädeln Sie einen Nylonfaden durch das Loch des Hebelarms des Aktuators/Transducers. Bilden Sie am Ende des Fadens eine Schlaufe und greifen Sie die Sehne, bevor Sie den Faden zurückziehen, bis der Muskel das Bad der Montagevorrichtung erreicht.
- Klemmen Sie die Rippen in der festen Klemme ein und binden Sie den Nylonfaden um den Hebelarm.
- Lassen Sie den Muskel sich in der Lösung einkurzieren und bestimmen Sie die anfängliche optimale Länge (L0).
- Dehnen Sie den Muskel, um ihn mit einer Vorspannung von 5 mN vorzuspannen. Dehnen Sie den Muskel vorsichtig, um die Vorspannung zu verändern, und stimulieren Sie ihn mit einer Serie einzelner Impulse. Die optimale Länge ist erreicht, wenn die maximale Zuckungskraft gemessen wird.
Abbildung 1 - Präparation von Musculus soleus und Nervus ischiadicus. Musculus soleus und Nervus ischiadicus während des chirurgischen Eingriffs für funktionelle Tests. Der Nervus ischiadicus wird mit einer Pinzette freigelegt. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 2 - Präparation des Zwerchfell-Phrenicus-Nerven. Die Abbildung zeigt eine Phase der Ausschneidung der Zwerchfell-Phrenicus-Nerven-Präparation (A) und den Streifen, der für funktionelle Tests montiert wird (B). Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Ansicht dieser Abbildung anzuzeigen.
- Bestimmung der NMJ-Eigenschaften unabhängig von der Muskelkontraktilität
- Stellen Sie die optimale Stromintensität für die Stimulation über den Nerv ein und überprüfen Sie, dass die durch die Saugnadelelektrode abgegebenen Stromimpulse keine Muskelkontraktion durch Streuung des Stroms im Bad verursachen.
- Platzieren Sie die Saugnadelelektrode in der Nähe des Muskels und ziehen Sie den Nerv hinein. Erhöhen Sie dabei vorsichtig die Stromintensität (beginnend bei 5 mA) und stimulieren Sie den Muskel mit einer Serie einzelner Impulse. Der optimale Stromwert wird erreicht, wenn die Zuckungskraft maximal ist.
- Schieben Sie den Nerv aus der Elektrode heraus und geben Sie einige einzelne Impulse ab. Stellen Sie sicher, dass der Muskel nicht aufgrund einer Überlappung mit der Membranstimulation durch die Lösung kontrahiert. Ziehen Sie den Nerv anschließend erneut in die Elektrode hinein.
- Starten Sie das Programm und wählen Sie die Eingabedatei aus, um das gewünschte Testprotokoll auszuführen.
HINWEIS: Die Eingabedatei enthält alle Stimulationsparameter, die für die Durchführung des gesamten Protokolls erforderlich sind. Obwohl dieselbe Protokollstruktur für beide Muskeln verwendet wird, unterscheiden sich die Stimulationsparameter je nachdem, ob es sich um das Musculus soleus oder das Zwerchfell handelt.- Stimulation des Musculus soleus über den Nervus ischiadicus (siehe Tabelle 1)
- Verwenden Sie für alle elektrischen Stimulationen folgende Impulsbreiten: 1,4 ms für die Stimulation des Nervus ischiadicus und 0,1 ms für die direkte Stimulation des Musculus soleus. Das vollständige Protokoll dauert etwa 65 Minuten.
- Stimulation des Zwerchfells über den Nervus phrenicus (siehe Tabelle 2)
- Verwenden Sie für alle elektrischen Stimulationen folgende Impulsbreiten: 1,8 ms für die Stimulation des Nervus phrenicus und 0,2 ms für die direkte Stimulation des Zwerchfells. Das vollständige Protokoll dauert etwa 55 Minuten.
- Messen Sie am Ende des experimentellen Protokolls die Länge und das Feuchtwicht des Muskels mit einem analogen Messschieber mit einer Genauigkeit von 0,05 mm bzw. einer Präzisionswaage mit einer Genauigkeit von 0,1 mg.
- Berechnen Sie die Querschnittsfläche (CSA), indem Sie die Muskelmasse durch das Produkt aus optimaler Faserlänge (Lf) und der Dichte des Skelettmuskels von Säugetieren (1,06 mg/mm3)16 teilen.
HINWEIS: Lf wird berechnet, indem L0 mit dem Verhältnis von Faserlänge zu Muskelänge multipliziert wird (0,71 für den Musculus soleus16 und 1 für den Musculus diaphragma17).
- Berechnen Sie die Querschnittsfläche (CSA), indem Sie die Muskelmasse durch das Produkt aus optimaler Faserlänge (Lf) und der Dichte des Skelettmuskels von Säugetieren (1,06 mg/mm3)16 teilen.
- Stimulation des Musculus soleus über den Nervus ischiadicus (siehe Tabelle 1)
- Stellen Sie die optimale Stromintensität für die Stimulation über den Nerv ein und überprüfen Sie, dass die durch die Saugnadelelektrode abgegebenen Stromimpulse keine Muskelkontraktion durch Streuung des Stroms im Bad verursachen.
| Art des Experiments | Häufigkeit | Dauer | Wiederholungen | Muskel- oder Nervenstimulation | Zweck |
| (Hz) | (s) | ||||
| Zuckung | Einzelimpuls | 1 | Muskel | Zuckungskraft und Kinetik | |
| Pause | 30 | ||||
| Zuckung | Einzelimpuls | 1 | Nerv | ||
| Pause | 30 | ||||
| Zuckung | Einzelimpuls | 1 | Muskel | ||
| Pause | 30 | ||||
| Zuckung | Einzelimpuls | 1 | Nerv | ||
| Pause | 120 | ||||
| Unvollständige Tetanie | 40 | 0,8 | 1 | Nerv | Kraft/Frequenz-Kurven für Nerven- und Muskelstimulationen |
| Pause | 180 | ||||
| Unvollständige Tetanie | 60 | 0,8 | 1 | Muskel | |
| Pause | 180 | ||||
| Vollständige Tetanie | 80 | 0,8 | 1 | Nerv | |
| Pause | 180 | ||||
| Unvollständige Tetanie | 20 | 0,8 | 1 | Muskel | |
| Pause | 180 | ||||
| Unvollständige Tetanie | 60 | 0,8 | 1 | Nerv | |
| Pause | 180 | ||||
| Vollständige Tetanie | 80 | 0,8 | 1 | Muskel | |
| Pause | 180 | ||||
| Unvollständige Tetanie | 20 | 0,8 | 1 | Nerv | |
| Pause | 180 | ||||
| Unvollständige Tetanie | 40 | 0,8 | 1 | Muskel | |
| Pause | 300 | ||||
| Ermüdungsparadigma | 35 | 0,8 | 1 Muskelstimulation gefolgt von 14 Nervenstimulationen mit jeweils 1,2 s Pause, 20-mal wiederholt | Neurotransmissionsausfall (NF) | |
| Pause | 900 | ||||
| Ermüdungsparadigma | 80 | 0,8 | 1 Muskelstimulation gefolgt von 14 Nervenstimulationen mit jeweils 1,2 s Pause, 20-mal wiederholt | Neurotransmissionsausfall (NF) und intratetanische Ermüdung (IF) | |
Tabelle 1 - Stimulationsprotokoll für Musculus soleus-sciaticus-Nerv-Präparat. Die Tabelle listet die Reihenfolge der Tests auf, die das vollständige Protokoll zur Untersuchung von Musculus soleus-sciaticus-Nerv-Präparaten bilden.
| Art des Experiments | Frequenz | Dauer | Wiederholungen | Muskel- oder Nervenstimulation | Zweck |
| (Hz) | (s) | ||||
| Zuckung | Einzelner Impuls | 1 | Muskel | Zuckungskraft und Kinetik | |
| Pause | 30 | ||||
| Zuckung | Einzelner Impuls | 1 | Nerv | ||
| Pause | 30 | ||||
| Zuckung | Einzelner Impuls | 1 | Muskel | ||
| Pause | 30 | ||||
| Zuckung | Einzelner Impuls | 1 | Nerv | ||
| Pause | 120 | ||||
| Unvollständige Tetanie | 60 | 0,5 | 1 | Nerv | Kraft-Frequenz-Kurven für Nerven- und Muskelstimulationen |
| Pause | 120 | ||||
| Vollständige Tetanie | 100 | 0,5 | 1 | Muskel | |
| Pause | 180 | ||||
| Unvollständige Tetanie | 40 | 0,5 | 1 | Nerv | |
| Pause | 120 | ||||
| Unvollständige Tetanie | 20 | 0,5 | 1 | Muskel | |
| Pause | 120 | ||||
| Unvollständige Tetanie | 80 | 0,5 | 1 | Nerv | |
| Pause | 150 | ||||
| Unvollständige Tetanie | 80 | 0,5 | 1 | Muskel | |
| Pause | 150 | ||||
| Unvollständige Tetanie | 20 | 0,5 | 1 | Nerv | |
| Pause | 120 | ||||
| Vollständige Tetanie | 100 | 0,5 | 1 | Muskel | |
| Pause | 150 | ||||
| Vollständige Tetanie | 100 | 0,5 | 1 | Nerv | |
| Pause | 180 | ||||
| Unvollständige Tetanie | 60 | 0,5 | 1 | Muskel | |
| Pause | 300 | ||||
| Ermüdungsparadigma | 35 | 0,33 | 1 Muskelstimulation gefolgt von 14 Nervenstimulationen mit jeweils 0,67 s Ruhezeit, 20-mal wiederholt | Neurotransmissionsausfall (NF) | |
| Pause | 900 | ||||
| Ermüdungsparadigma | 80 | 0,33 | 1 Muskelstimulation gefolgt von 14 Nervenstimulationen mit jeweils 0,67 s Ruhezeit, 20-mal wiederholt | Neurotransmissionsausfall (NF) und intratetanische Ermüdung (IF) | |
Tabelle 2 – Stimulationsprotokoll für Zwerchfell-Phrenikusnerv. Die Tabelle listet die Reihenfolge der Tests auf, die das vollständige Protokoll zur Untersuchung von Zwerchfell-Phrenikusnerv-Präparationen bilden.
3. Datenanalyse
HINWEIS: Am Ende des Protokolls alle gewünschten Parameter wie folgt berechnen.
- Von der Einzelimpulsstimulation
- Berechnen Sie die Zuckkraft (mN; maximale aktive Kraft während der Zuckung) und die spezifische Zuckkraft (mN/mm)2). Berechnen Sie sie, indem Sie den Ausgangsvorschubwert von der maximalen Kraft, die vom Muskel erzeugt wird, subtrahieren. Berechnen Sie die spezifische Zuckkraft als Zuckkraft geteilt durch die Querschnittsfläche des Muskels (CSA).
- Berechnen Sie die Zeit bis zur maximalen Spannung (TTP) (ms) als die Zeit vom Freigeben des Reizes bis zur Zuckkraft.
- Berechnen Sie die Halbrelaxationszeit (1/2RT) (ms) als die Zeit vom Zackenkraftmaximum bis zu 50 % der Zackenkraft.
- Berechnen Sie dF/dt (mN/ms) als den Maximalwert der Kraftableitung während der kontraktilen Phase.
- Berechnen Sie -dF/dt (mN/ms) als den Maximalwert der Kraftableitung während der Relaxationsphase.
- Von Pulszugstimulationen
- Berechnen Sie die unfundierte Kraft (mN) und die spezifische unfundierte Kraft (mN/mm)2). Berechnen Sie dies, indem Sie den Anfangswert der Vorspannung vom maximalen, vom Muskel erzeugten Kraftwert subtrahieren. Berechnen Sie die spezifische unfundierte Kraft als unfundierte Kraft dividiert durch die Muskel-Querschnittsfläche (CSA).
HINWEIS: Die unfundierte Kraft ist die maximale aktive Kraft, die während einer Reizfolge mit einer Frequenz unterhalb der tetanischen Frequenz erzeugt wird. - Berechnen Sie die tetanische Kraft (mN) und die spezifische tetanische Kraft (mN/mm²); die maximale Kraft entspricht der maximalen aktiven Kraft, die während einer Reizfolge mit tetanischer Frequenz erzeugt wird. Ermitteln Sie diese, indem Sie den Anfangs-Vorspannungswert von der maximalen, vom Muskel erzeugten Kraft subtrahieren. Berechnen Sie die spezifische tetanische Kraft, indem Sie die tetanische Kraft durch die Querschnittsfläche des Muskels (CSA) dividieren.
- Berechnen Sie die Kraft-Frequenz-Kurve. Tragen Sie den Wert der Kraft (oder spezifischen Kraft) für jede Stimulation gegen die zunehmende Stimulationsfrequenz auf. Typischerweise beginnt dies mit Einzelimpulsstimulation und endet bei der tetanischen Frequenz.
- Berechnen Sie die unfundierte Kraft (mN) und die spezifische unfundierte Kraft (mN/mm)2). Berechnen Sie dies, indem Sie den Anfangswert der Vorspannung vom maximalen, vom Muskel erzeugten Kraftwert subtrahieren. Berechnen Sie die spezifische unfundierte Kraft als unfundierte Kraft dividiert durch die Muskel-Querschnittsfläche (CSA).
- Aus Ermüdungs-Paradigmen
- Berechnen Sie das Versagen der Neurotransmission (NF) wie folgt:
wobei MF der Kraftabfall nach Muskelstimulation und F der Kraftabfall nach Nervenstimulation ist, gemessen am ersten Pulstraining nach Muskelstimulation. - Berechnen Sie die intratetanische Ermüdung (IF) wie folgt:
wobei Flp ist die Kraft, die der Muskel beim letzten Reizimpuls erzeugt, und Fm ist die maximale Kraft, die der Muskel während derselben Reizfolge erzeugt. Bezüglich der Nervenstimulation berechne die intratetanische Ermüdung anhand der ersten Reizfolge unmittelbar nach der direkten Stimulation.
- Berechnen Sie das Versagen der Neurotransmission (NF) wie folgt:
4. Statistische Analyse
HINWEIS: Die Modelle für die statistische Analyse müssen abhängig davon ausgewählt werden, ob die Muskelreaktion auf Nerven- und Membranstimulationen innerhalb desselben Tiermodells oder zwischen zwei verschiedenen Tiermodellen verglichen wird18,19.
- Verwenden Sie den t-Test nach Student für TTP, 1/2RT, dF/dt, -dF/dt, wenn ausschließlich Muskelantworten auf direkte und indirekte Stimulationen verglichen werden. Wenn Muskelpräparationen von zwei verschiedenen Mausstämmen verglichen werden, verwenden Sie eine zweifaktorielle Varianzanalyse (2-way ANOVA) mit Stimulationstyp und Mausstamm als feste Faktoren. Falls die zweifaktorielle Varianzanalyse ein signifikantes Ergebnis liefert, verwenden Sie Tests für multiple Vergleiche, um statistische Unterschiede zu ermitteln.
- Für die Kraft-Frequenz-Kurve (bei ausschließlicher Gegenüberstellung von Muskelantworten auf direkte und indirekte Stimulationen) verwenden Sie eine zweifaktorielle Varianzanalyse (2-way ANOVA) mit Stimulationstyp und Stimulationsfrequenz als feste Faktoren. Verwenden Sie gegebenenfalls Tests für multiple Vergleiche.
- Wenn Muskelpräparationen von zwei verschiedenen Mausstämmen verglichen werden, verwenden Sie eine dreifaktorielle Varianzanalyse (3-way ANOVA) mit Stimulationstyp, Stimulationsfrequenz und Mausstamm als feste Faktoren.
- Falls die dreifaktorielle Varianzanalyse einen signifikanten Einfluss der Faktoren Mausstamm und Stimulationstyp ergibt, verwenden Sie eine zweifaktorielle Varianzanalyse (2-way ANOVA), um signifikante Unterschiede zwischen jeweils zwei Gruppen zu identifizieren. Beispielsweise können Unterschiede in der Muskelantwort beider Gruppen auf Membranstimulation oder Unterschiede in der Muskelantwort auf direkte und indirekte Stimulation innerhalb einer Gruppe analysiert werden.
- Wenn Muskelpräparationen von zwei verschiedenen Mausstämmen verglichen werden, verwenden Sie eine dreifaktorielle Varianzanalyse (3-way ANOVA) mit Stimulationstyp, Stimulationsfrequenz und Mausstamm als feste Faktoren.
- Intratetanische Ermüdung
HINWEIS: Da das Protokoll so konzipiert ist, dass bereits bei Kontrollmäusen Ermüdung als Reaktion auf Nervenstimulation hervorgerufen wird, kann dieser Parameter nur zur Untersuchung von Unterschieden zwischen zwei Mausstämmen verwendet werden. Eine statistische Analyse innerhalb einer einzelnen Gruppe würde stets signifikante Unterschiede ergeben.- Zum Vergleich zweier Gruppen verwenden Sie eine dreifaktorielle Varianzanalyse (3-way ANOVA) mit Stimulationstyp, Zeit und Mausstamm als festen Faktoren. Falls die dreifaktorielle Varianzanalyse einen signifikanten Einfluss der Faktoren Mausstamm und Stimulationstyp ergibt, verwenden Sie eine zweifaktorielle Varianzanalyse (2-way ANOVA), um signifikante Unterschiede zwischen jeweils zwei Gruppen zu ermitteln, analog zur Kraft-Frequenz-Kurve.
- Für die Untersuchung von Neurotransmissionsausfällen verwenden Sie eine zweifaktorielle Varianzanalyse (2-way ANOVA) mit Mausstamm und Zeit als feste Faktoren. Falls signifikante Ergebnisse vorliegen, verwenden Sie Tests für multiple Vergleiche, um statistische Unterschiede zu ermitteln.
HINWEIS: Da dieser Parameter pro Mausstamm nur einen einzelnen Wert liefert, ermöglicht er den Vergleich verschiedener Mausmodelle. - Für Muskelgewicht, -länge und Querschnittsfläche (CSA) verwenden Sie den t-Test nach Student, um Unterschiede bei Muskel-Nerv-Präparationen aus verschiedenen Tiermodellen zu untersuchen.
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Ergebnisse
Das Protokoll, die, das wir beschrieben, informiert über funktionelle Denervierung in verschiedenen neuromuskulären Erkrankungen oder Alterung Sarkopenie. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um festzustellen, ob (und wenn ja, auf welcher Ebene) Muskel Änderungen sind durch selektive Veränderungen, die im Muskel selbst oder in der neuromuskulären Übertragung auftreten. Die unten angezeigten Daten sind die Ergebnisse der bisherigen Arbeit von unserer Gruppe18, au...
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Diskussion
Das experimentelle Protokoll beschriebenen bietet eine ideale Möglichkeit Mess-und diskriminieren funktionellen Veränderungen, die direkt in den Muskel oder eingetreten, indirekt auf die neuromuskuläre Synapse-Ebene. Da diese Technik auf eine indirekte Messung der NMJ Funktionalität basiert, kann es verwendet werden, um festzustellen, ob Mängel zu morphologischen Veränderungen oder biochemische Veränderungen zusammenhängt. Im Gegensatz dazu bietet es ein wirksames Mittel zur Feststellung, ob keine morphologische und bioc...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Arbeit im Labor der Autoren wurde unterstützt von Fondazione Roma und Telethon (keine zu gewähren. GGP14066).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Dual-Mode-Hebelsystem | Aurora Scientific Inc. | 300B | Aktuator/Wandler |
| Bi-Phasen-Hochleistungsstimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | Impulsstimulator (Nerv) |
| Zweiphasen-Hochleistungsstimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | Pulsstimulator (Muskel) |
| In-vitro-Muskelapparat | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Vorbereitendes Gewebebad | Radnoti | 158400 | |
| Monopolare Saugelektrode | A-M Systems | 573000 | mit einer hausgemachten Referenz |
| Oszilloskop | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomikroskop | Nikon | SMZ 800 | |
| Kaltlichtbeleuchtung | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Erfassungskarte | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Anschlussblock | National Instruments | NI 2110 | |
| PC | AMD Phenom II x4 970 | Prozessor 3,50 Ghz mit Windows 7 | |
| LabView 2012 Software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bikarbonat Puffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiologischer Puffer |
| Natriumbicarbonat | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calciumchlorid CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | wasserfrei, Pulver, ≥ 97% |
| Puffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | &ge≥ 99,5% (Titration) |
| Schalen 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrol |
| Silikon | Sylgard | 184 Silikon | Elastomer-Kit & nbsp; 0,5 kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pumpe | Newa Mini | MN 606 | für Aquarium |
| Hitzebeständigkeit Thermokabel | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Eimer | beliebig 10 Liter | Polypropylen | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mischgas | |
| #5 Pinzette | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 Stück |
| Federschere - 8 mm Klingen | Fine Science Tools | 15024-10 | Nervenexzision |
| Scharfe Schere | Feine wissenschaftliche Werkzeuge | 14059-11 | Muskelentfernung |
| Zarte Schere | Wagner | 02.06.32 | Außenseite des Tieres |
| Student Skalpellgriff #3 | Feinwissenschaftliche Werkzeuge | 91003-12 | |
| Skalpellklingen #10 | Feinwissenschaftliche Werkzeuge | 10010-00 | |
| Skalpellklingen #11 | Feinwissenschaftliche Werkzeuge | 10011-00 | |
| Nylondraht & Oslash; 0,16 mm | beliebig |
Referenzen
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871(2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
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