Gen-Deletionsmutanten, die durch homologe Rekombination erzeugt werden, sind der Goldstandard für Genfunktionsstudien. Die OSCAR-Methode (Ein-Schritt-Konstruktion von Agrobacterium-Recombination-ready-Plasmiden) zur schnellen Erzeugung von Deletionskonstrukten wird beschrieben. Agrobacterium vermittelte Pilz-Transformation folgt. Schließlich wird eine PCR-basierte Bestätigungsmethode für Gendeletionen in Pilz-Transformanten vorgestellt.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Präzise Deletion von Gen (s) von Interesse, während der Rest des Genoms unverändert, bietet das ideale Produkt, um die bestimmte Gen-Funktion im lebenden Organismus zu bestimmen. In diesem Protokoll wird das OSCAR-Verfahren der präzisen und schnellen Deletions-Plasmid-Konstruktion beschrieben. OSCAR beruht auf dem Klonierungssystem, in dem eine einzelne Rekombinase-Reaktion durchgeführt wird, die die gereinigten PCR-amplifizierten 5'- und 3'-Flanken des Gens von Interesse enthält, und zwei Plasmide, pA-Hyg OSCAR (der Markervektor) und POSCAR (die Assembly Vektor). Die Bestätigung des korrekt zusammengebauten Löschungsvektors wird durch eine Restriktionsverdauungsabbildung durchgeführt, gefolgt von einer Sequenzierung. Agrobacterium tumefaciens wird dann verwendet , um die Einführung des Deletionskonstrukts in Pilzsporen (bezeichnet als ATMT) zu vermitteln. Schließlich wird ein PCR-Assay beschrieben, um zu bestimmen, ob das Deletionskonstrukt durch homologe oder nicht-homologe Rekombination integriert ist, was eine Gendeletion oderEktopische Integration. Dieser Ansatz wurde erfolgreich für die Deletion von zahlreichen Genen in Verticillium Dahlien und in Fusarium verticillioides unter anderen Arten verwendet .
Einleitung
Genetische Dissektion ist eine leistungsfähige Methode zur Bestimmung der funktionellen Bedeutung von Individuen oder Kombinationen von Genen. Ein Standardansatz, um die Rolle der spezifischen Gene zu verstehen, ist die Produktion von einzelnen Genmutanten, die in jedem anderen Gen unverändert sind. Der mächtigste und am wenigsten potenziell verwirrende Ansatz ist die vollständige und genaue Deletion eines offenen Leserahmens des Gen von Interesse (GOI ORF) ohne Schaden für jede andere Genfunktion.
Da Standard-Ligation Ansätze für die Deletion Plasmid-Generation erfordern mehrere Schritte, die rational für OSCAR 1 war, um eine schnellere in vitro Ansatz zu produzieren. Abbildung 1 zeigt den Montageprozess im OSCAR-Ansatz. Das hier beschriebene Verfahren hat den Vorteil, die schnelle Konstruktion einzelner Gendeletion-Vektoren in einer einzigen multipart-Reaktion in Kombination mit nachfolgendem Agrobacterium tumefaciens-vermittelten Transfo zu kombinierenRmation (ATMT). OSCAR ist sehr schnell und vergleicht sich gut mit anderen Strategien wie die Verwendung von Gibson Montage in Hefe 2 . Die OSCAR-Methode wurde erfolgreich mit mehreren Ascomycota-Arten von Pilzen verwendet. Zu diesen Arten gehören: Fusarium verticillioides (unveröffentlicht), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. Sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 und Dothistroma septosporum 9 und Sarocladium zeae (unveröffentlicht) .
Dieses Protokoll liefert eine Schritt-für-Schritt-Anweisung für das Verfahren einschließlich des Primerentwurfs, der Flanken-PCR-Amplifikation, der OSCAR-BP-Reaktion, der Deletionskonstruktstruktur-Bestätigung, der TransformationIon von Agrobacterium mit dem Konstrukt, gefolgt von einer ATMT-basierten Übertragung des Deletionskonstrukts in die Pilzzellen, und schließlich die Differenzierung von Pilz-Deletionsmutanten von denen mit ektopisch integrierten Deletionskonstrukten.
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Protokoll
1. Grundierung für die PCR-Verstärkung von Genflanken
- Laden Sie in eine Textverarbeitungsdatei die genomische Region des Gens von Interesse (GOI) einschließlich des offenen Leserahmens (ORF) und mindestens 2 kb, das das Gen auf jeder Seite von FungiDB oder einer anderen genomischen Datenquelle flankiert.
- Markieren Sie den ORF zum Löschen und Etikettenstart und stoppen Sie Codons.
- Identifizieren und markieren Sie benachbarte ORFs innerhalb der heruntergeladenen Sequenz.
- Verwenden Sie das 2 kb 5 'Ende des GOI ORF und das Primer Design Tool (siehe Material Liste), um das PCR Primer Paar O1 und O2 zu entwerfen, um ein Minimum Größe Produkt von 1 kb zu generieren. Achten Sie darauf, nicht auf benachbarte ORFs zu wirken.
- Füge die 2 kb 5 'Flanke in das Fenster "Sequence Entry" ein. Klicken Sie auf "Benutzerdefinierte Parameter anzeigen". Geben Sie die folgenden kundenspezifischen Designparameter ein: Primer TM 58 (min), 60 (opt) und 62 (max); Primer GC 40 (min), 50 (opt) und 60 (max); Primer Größe 22 (min), 24 (opt) und 26(Max); Amplicon Größe 1250 (min), 1500 (opt) und 2000 (max).
- Wählen Sie das Ergebnis, das den umgekehrten Primer (O2) am nächsten zum ORF platziert. Erfassen Sie einen Screenshot der Assays und kopieren und fügen Sie die Primer-Sequenzen in das Textverarbeitungsdokument ein.
- Wiederholen Sie den Vorgang für 3 'Flanke, um die Primer O3 und O4 zu generieren, diesmal wählen Sie das Ergebnis, das den Vorwärtsprimer (O3) am nächsten zum Ziel-ORF platziert.
- Füge entsprechende Anhänge an 5'-Enden der Primer 1 bis 4 hinzu (siehe Tabelle 1 ).
- Entwerfen und bestellen Sie ORF-spezifische Primer, die für die Löschbestätigung in Abschnitt 4 unten verwendet werden sollen. Die Parameter sollten die gleichen wie in Schritt 1.4.1 mit Ausnahme der Amplicon Größe 500 (min), 750 (opt) und 1000 (max) Einstellung für Länge des ORF, wenn nötig. Schließlich, zur Bestätigung von homologen Rekombinanten, erzeugen 5 'out und 3' out Primer, die direkt außerhalb der Flanken innerhalb des Chromosoms gefunden wurden. Diese "out" Primer werden mit verwendet werdenHygR (210) bzw. hygF (850) ( Fig. 2 ).
- Bestellen Sie Primer.
2. Herstellung von OSCAR-Konstrukten
- Mit einer Hallo-Treue Taq, führen Sie zwei Reaktionen, jeweils eine für die 5 'und 3' Flanken, mit Primern (100 μM) O1 und O2 in einer Reaktion und Primer O3 und O4 in der zweiten. Das Reaktionsgemisch enthält folgendes: 29,5 & mgr; l steriles destilliertes Wasser (SDW), 5 & mgr; l 10 × LA PCR-Puffer, 8 & mgr; l 2,5 mM dNTP-Mischung, 5 & mgr; l 25 mM MgCl 2 , 1 & mgr; l Schablone (50 ng / & mgr; l), 0,5 & mgr; l Hi- Treue Taq , 0,5 μl Primer O1 und 0,5 μl Primer O2 für 5 'Flanke (oder 0,5 μl Primer O3 und 0,5 μl Primer O4 für 3' Flanke) Die Reaktionsbedingungen sind wie folgt: 94 ° C für 1 min, dann 30 Zyklen 94 ° C für 30 s, 60 ° C für 30 s, 72 ° C für 2 min, dann letzte Schritte von 72 ° C für 5 min und dann bei 10 ° C unbegrenzt gehalten.
- Führen Sie 0,8%Agarose 1x TAE (40 mM Trisacetat pH 8,3, 1 mM EDTA) Gelelektrophorese für ca. 125 Vh in einer Standard-Minigel-Apparatur zur Bestimmung der Produktgröße und der relativen Konzentration. Pfostenfleck das Gel mit Nicht-Ethidium-Fleck nach den Anweisungen des Herstellers. Auf eine UV-Beleuchtung stellen.
- Wenn 5 'und 3' flanke Produkte in etwa gleichmäßiger Konzentration vorliegen, kombinieren sie diese und verwenden ein Affinitätssäulen-Kit (oder PEG-Präzipitation 90 μl kombinierte PCR-Produkte, 240 μl TE-Puffer pH 7,5, 160 μl 30% Polyethylenglykol PEG8000 30 mM MgCl 2 ) zur Co-Reinigung der PCR-Produkte nach dem Protokoll des Herstellers. Wenn sie nicht von gleicher Konzentration sind, kombinieren Sie alle Produkte mit niedriger Konzentration mit einer geschätzten gleichen Menge an Produkt aus der höheren Ausbeute.
- Verwenden Sie ein Spektrophotometer, um die gereinigte DNA-Konzentration zu messen.
- Durchführen der BP-Reaktion durch Mischen der folgenden: 1 & mgr; l 60 ng / & mgr; l POSCAR, 2 & mgr; l 60 ng /ΜL pA-Hyg-OSCAR, 1 & mgr; l 60 ng / & mgr; l kombinierte Flanken, 1 & mgr; l Clonase. 16 h bei 25 ° C inkubieren. Beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von 0,5 μl Proteinase K und inkubieren für 10 min bei 37 ° C.
- Verwandeln Sie hohe Kompetenz E. Coli Zellen. Sowohl handelsübliche kompetente Zellen als auch hausgemachte DH5 & agr; CaCl 2 kompetente Zellen wurden erfolgreich als Empfänger verwendet, wie durch die Anweisungen des Herstellers beschrieben. Platte auf niedrigem Natrium (0,5 g / l NaCl) LB, enthaltend 100 & mgr; g / ml Spectinomycin (Spec).
- Identifizieren Sie das korrekte Konstrukt, indem Sie DNA-Minipreps 10 der oben erzeugten Kolonien durchführen. Führen Sie die doppelte Verdauung mit Hin dIII und Kpn I wie folgt durch: pipette 5 μL DNA, 2 U jedes Enzyms, 2 μL geeigneter 10x Puffer mit SDW zu einem 20 μl Gesamtvolumen. Damit wird der Insert (ca. 4,5 kb mit 1,5 kb Genflanken) aus dem Vektor ( ca. 7 kb) freigesetzt und schneidet alle Standorte inFlanken, die vorhersagbare Bandgrößen liefern können.
- Sequenz 11 wählt Klone mit einem entsprechenden Streifenmuster aus.
3. Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation (ATMT) von Pilzen
- Transformieren des Agrobacterium tumefaciens Stammes AGL1 mit OSCAR Deletionskonstrukt 12 .
- Transformieren Sie den Pilz mit AGL1, der das GOI OSCAR-Deletions-Plasmid enthält. Führen Sie dazu folgende Schritte aus:
- Eine Pilzsporen-Suspension mit sterilem Wasser bei 2 x 10 6 Sporen / ml vorbereiten. Bestimmen Sie Sporen auf einem Hämocytometer oder einem automatisierten Zellzähler. Legen Sie 500 μl davon in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Diese Einrichtung ist für 4 Transformationsplatten.
- Verwenden Sie eine blaue sterile Einwegschleife, um einen leicht sichtbaren Becher hinzuzufügen (sollte etwa 20% des Schleifendurchmessers abdecken) des Deletionsplasmids, das AGL1 enthält, von 2-3 Tage altem LB-Spec 100 Medium (siehe MAterials Liste für die Zusammensetzung), die Platten enthält und in die Sporensuspension einmischen. Vortex bis Bakterienzellen gut dispergiert sind ( ca. 5 min mittlere Geschwindigkeit).
- 100 & mgr; l der Conidia-Agrosuspension auf die Mitte eines Cellulosemembranfilters pipettieren, der auf jedem von vier 6 cm Petrischalen, die das Kultivierungsmedium 12 enthalten, platziert ist.
- Verbreiten Sie die Suspension mit sterilen Glasperlen (ca. 4), um die gesamte Oberfläche des Membranfilters zu bedecken. Alternativ die Aufhängung mit einem herkömmlichen Streuerwerkzeug verteilen. Lassen Sie den Membranfilter ca. 10 min in einer Kapuze trocknen, mit Paraffinfolie umwickeln. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.2 und 3.2.3, um mehrere Transformationen einzurichten.
- Inkubieren Sie die Platte für 2 Tage bei Raumtemperatur, umgekehrt.
- Übertragen Sie den Membranfilter auf 6 cm Aspergillus- Selektionsmedium 12 Platten, die Hygromycin B (Hyg) enthalten, 150 μg / ml, 200 mM Cefotaxim und 100 μg / mlMoxalactam Inkubieren bei Raumtemperatur für 5-7 Tage vor der Isolierung von hyg resistenten Kolonien.
- Mit sterilen Zahnstochern, Transfer putative Transformanten auf 6 cm Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA) Platten mit 150 μg / ml Hyg, 100 μg / ml Kanamycin.
4. Streichung Mutante Identifizierung durch PCR
- Extrahieren von DNA für PCR aus Transformanten durch Thermolyse 13 .
- Sobald Transformanten Kolonien auf dem PDA aus Schritt 3.2.7 bilden, verwenden Sie einen sterilen Zahnstocher, um eine kleine Menge (2 mm x 2 mm) Myzel oder Hefezellen aus der Kolonie in 100 μl Lyse-Lösung (50 mM Natriumphosphat, pH-Wert) zu übertragen 7,4, 1 mM EDTA, 5% Glycerin) in einem Mikrozentrifugenröhrchen.
- Inkubieren Sie das Gemisch bei 85-90 ° C für 20-30 min. Den Rohextrakt, der genomische DNA enthält, bei -20 ° C bis zur Anwendung in Schritt 4.2 aufbewahren.
- 4 PCR-Reaktionen pro Transformanten durchführen, jeweils eine bis dHomogene Rekombination der 5'- und 3'-Flanken, jeweils eine für den selektierbaren Marker (Hygromycin-Phosphotransferase in diesem Fall) und eine für den GOI-ORF.
HINWEIS: Für diese Reaktionen verwenden wir in der Regel preiswerte Taq . Die Reaktionsbedingungen sind wie in Schritt 2.1 oben beschrieben und enthalten SDW 20 & mgr; l, 10 × Taq-Puffer 2,5 & mgr; l, dNTPS (10 mM) 0,5 & mgr; l, hausgemachter Taq 14 , 0,5 & mgr; l, Primer A (100 & mgr; M) 0,5 & mgr; l, Primer B (100 & mgr; M ) 0,5 & mgr; l, Schablone 0,5 & mgr; l Niedrigere Konzentrations-Primer-Bestände (10 μM) können gleich gut verwendet werden. - Führen Sie ein Agarosegel ( zB 0,8%) der PCR-Produkte aus. Deletionsmutanten produzieren die Hyg-Band, aber kein ORF-Produkt. Ektopische Integranten werden beide Bands zeigen. Wildtyp wird nur das ORF-Band produzieren.
- Permanent speichern Deletionsmutanten (und eine ektopische Transformante oder zwei für Kontrollen) für zukünftige Verwendung.
HINWEIS: 15% Glycerin wird an s verwendetUnsere Belastungen langfristig bei -80 ° C.
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Ergebnisse
Das OSCAR-Verfahren erzeugt in einer einzigen Reaktion ein Plasmid, das die Flanken des zu deletierenden Zielgens enthält, das die selektierbare Markerkassette umgibt. Die Produktion von Deletionskonstrukten mit OSCAR ist sehr effizient. Das System kann jedoch Teilkonstrukte erzeugen, die einige, aber nicht alle drei Fragmente enthalten (die beiden Genflanken und die selektierbare Markierung). Im Allgemeinen enthält die Mehrheit der E. coli- Transformanten das korrekte OSCAR-Kon...
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Diskussion
Ein Schritt Aufbau von Agrobacterium -Recombination-ready-Plasmiden (OSCAR) wurde erfolgreich mit einer ständig wachsenden Anzahl von Ascomycota Pilzen eingesetzt. Die Methode sollte auch leicht auf die Basidiomycota und Spezies von anderen Pilzphyla (mit geeigneten Promotoren, die selektierbare Markergene treiben) anwenden, wobei angenommen wird, dass Agrobacterium vermittelte Transformation und homologe Rekombination möglich sind. Zusätzliche Markervektoren wurden erzeugt, um die Auswahl der...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Die Autoren danken den folgenden Studenten und Gymnasiasten für ihre Arbeit, um OSCAR-Mutanten in Fusarium verticillioiodes zu generieren : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez , Ashli Crepsac, Jeff Delong, Christlicher König, Gi Jeong, Maria Belding, Christy Burre, Daniel O'Meara, Lauren (Victoria) Koch, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum Chris Benson, Louis Stokes, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre'Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin , Thi Ngoc Le und Angel Pham.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| FungiDB | Datenbank/ http://fungidb.org/fungidb/ | ||
| IDT PrimerQuest | IDT | Primer Design Online-Software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index | |
| Microsoft Word | Sequenz Dateimanipulation | ||
| Low Na LB Spec 100 medium | E. coli Transformantenauswahl, Zusammensetzung: 1 % Trypton, 0,05 % NaCl, 0,5 % Hefeextrakt, 1,5 % Agar für festes Medium | ||
| Co-Kultivierungsmedium | ATMT-Transformationsinduktion (Referenz 12) | ||
| Aspergillus minimales Medium mit Hygromycin | Pilz-Transformantenauswahl | ||
| PDA-Medium | Acumedia | 7149A | Einzelsporen-Schrägröhrchen |
| PDA-Hyg-Kan medium | Pilz-Ransformant-Isolierung, PDA mit 150 μa; g/mL Hygromycin B und 100 μ g/mL Kanamycin | ||
| Glasperlen | Genlantis | C400100 | Plattenaufstrich |
| Nitrozellulose Filter (47 mm) | Fisher | 09-719-555 | Co-Kultur für ATMT |
| Diverse Zentifugenröhrchen | mehrfach präps | ||
| Petriplatten (verschiedene) | Kultivierung von Bakterien und Pilzen | ||
| pA-Hyg OSCAR | Addgene | 29640 | Wählbarer Markervektor |
| pOSCAR | Addgene | 29639 | Assemblierungsvektor |
| DH5α One Shot Kompetente E. coli cells | Life Technologies | 12297-016 | BP-Reaktionsumwandlung |
| ccdB-Überleben E. coli-Zellen | Life Technologies | A10460 | Wartung von pOSCAR |
| Transferstäbe | Koloniestreifen | ||
| Zahnstocher | Koloniepicking | ||
| Mikrozentrifuge | Pelletierung von Bakterien etc. | ||
| Präparative Zentrifuge | Pilzsporensammlung | ||
| Präpariermikroskop | Einzel Sporenisolierung | ||
| Automatisierter Zellzähler | Berechnung der Sporensuspension | ||
| Verbundmikroskop | Hämozytometer Zellzählung | ||
| QIAquick PCR Aufreinigungskit | Qiagen | 28104 | PCR-Reinigung von Genflankenprodukten |
| TaKaRa LA Taq | Takara Bio | USA RR002A | Hi Fidelity taq Polymerase für die OSCAR-Flankengenerierung |
| Hygromycin B | InvivoGen | ant-hg-5 | |
| Spectinomycin | Sigma | 22189-32-8 | |
| Cefotaxim | TCI America | C2224 | |
| Kanamycin | 11815032 | ||
| Moxalactam | Sigma-Aldrich | 43963 | |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | Nachfärbung von Agarose-Gelen |
| Qiagen QIAquick PCR-Aufreinigungskit (Kat. Nr. 28104) | |||
| (OneShot_ Mach1TM T1R oder One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R von Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | C862003 | |
| Gateway BP Clonase II Enzymmischung | Thermo Fisher | Scientific 11789020 | Wird verwendet, um das Deletionskonstrukt in pOSAR zusammenzusetzen |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
