Biophysikalische Charakterisierung von Flagellenmotors Funktionen

Zusammenfassung

Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass bakterielle Flagellenmotoren eine Vielzahl von Umweltsignalen wahrnehmen und sich als Reaktion darauf umgestalten. Es wird erwartet, dass die hier diskutierten Bead-Assays dazu beitragen, die Rolle des Umbaus bei der zellulären Anpassung an Umweltstressoren zu erklären.

Zusammenfassung

Die Rolle von Flagellenmotoren bei der bakteriellen Motilität und Chemotaxis ist gut verstanden. Jüngste Entdeckungen deuten darauf hin, dass Flagellenmotoren in der Lage sind, sich als Reaktion auf eine Vielzahl von Umweltreizen umzugestalten und zu den Auslösern für Oberflächenbesiedlung und Infektionen gehören. Die genauen Mechanismen, mit denen Motoren die zelluläre Anpassung umgestalten und fördern, hängen wahrscheinlich von wichtigen motorischen Attributen ab. Die hier vorgestellte Photomultiplier-basierte Bead-Tracking-Technik ermöglicht eine genaue biophysikalische Charakterisierung motorischer Funktionen, einschließlich Anpassungen der Motordrehzahl und der Schaltdynamik. Dieser Ansatz bietet den Vorteil des Echtzeit-Trackings und die Möglichkeit, das motorische Verhalten über längere Zeiträume zu untersuchen. Die diskutierten Protokolle können leicht erweitert werden, um Flagellenmotoren in einer Vielzahl von Bakterienarten zu untersuchen.

Einleitung

Flagellenmotoren ermöglichen Zellen durch Drehen Schraubenextrazellulären Filamente zu schwimmen. Der Betrag des Drehmoments des Motors für eine gegebene Länge des Flagellums erzeugen kann (dh die viskose Last) bestimmt die Schwimmgeschwindigkeit. Auf der anderen Seite, seine Fähigkeit, die Drehrichtung steuert, die Zellmigration in Reaktion auf Chemikalien, ein Verfahren bekannt, wie Chemotaxis zu wechseln. Chemotaxis und Beweglichkeit sind Virulenzfaktoren ^1-3, Flagellenmotoren wurden ⁴ über die Jahre gut charakterisierte. Montage Hinweise darauf , nun , dass der Motor als Mechanosensor wirkt - es erkennt , mechanisch das Vorhandensei....

Protokoll

1. Zellpräparation

1. Wachsen über Nacht Kulturen der gewünschten Stamm der klebrigen fliC Allel ^15,22 in Trypton - Bouillon tragen (TB, 1% Pepton, 0,5% NaCl) , gefolgt von der Inokulation bei 1: 100 Verdünnung in 10 ml frischem TB. Die Kultur bei 33 ° C in einem Schüttelinkubator bis OD ₆₀₀ = 0,5.
2. Pelletieren Sie die Zellen bei 1.500 xg für 5 bis 7 min und re-dispergieren das Pellet kräftig in 10 ml filtersterilisiert Motilität Puffer (MB; 10 mM Phosphatpuffer: 0,05-0,06 M NaCl, 10 ^-4 M EDTA, 1 & mgr; M Methionin, pH 7,0).
3. Wiederholen Sie Schritt 1.2 zwei weitere Male und das endgültige Pellet in ....

Ergebnisse

Der Photomultiplier Aufbau ist in 1A gezeigt. Es ist wichtig, dass die PMT von den Kügelchen von Interesse verstreut hohe Empfindlichkeiten über den Bereich von Wellenlängen aufweisen. Die PMT hier beschäftigt arbeiten im sichtbaren und im nahen Infrarot-Bereich, und waren in der Lage Licht von Perlen mit einem Halogenlichtquelle beleuchtet verstreut zu erkennen. Die optimale Lichtverhältnisse und Versorgungsspannungen werden von einer Einrichtung zur anderen variieren. .......

Diskussion

Um tethered Wulst-Tracking und korrekte Schätzung der Motor-Drehmomente zu erleichtern, sollten die folgenden Informationen überprüft werden. Wenn diese Messungen mit flagellated Zellen durchgeführt wird, Scherung ist ein kritischer Schritt. Shearing reduziert die Flagellenfilamenten auf eine bloße stub, wodurch sichergestellt wird, dass die viskose Last auf dem Motor zu dem Wulst überwiegend aus und kann innerhalb von 10% Fehler ¹⁶ geschätzt werden. Shearing verbessert auch die Chancen mit dicht verteilten E.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Poly-L-Lysin-Lösung (0,1%)	Sigma-Aldrich	P8920	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US
Polybead-Mikrosphären	Polysciences, Inc.	7307	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US
1 mL Luer-Slip-Tip-Spritze	Exel Int.	26048	http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php
Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23 Gauge	Becton, Dickinson and Company	427565	http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp
Polyethylenschlauch	Harvard Apparatus	59-8325	http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html
Photomultiplier Röhren	Hamamatsu	R7400U-20	Spektraler Empfindlichkeitsbereich von 300 bis 920 nm, Peakwellenlänge 630 nm, Ansprechzeit von 0,78 ns http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html
3 x 1 mm Präzisionsschlitze	Edmund Optics	NT39-908	2 Schlitze rechtwinklig zueinander montiert auf Photomultiplier-Röhren
Oszilloskop	Tektronix	TBS 1032B	Alternative Marken sind akzeptabel. Digitales Oszilloskop, TBS 1000B-Serie, 2 analog, 30 MHz, 500 MSPS, 2,5 kpts  http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope
8 Pole LP/HP Filter	Krohn-Hite	3384	Alternative Marken sind akzeptabel. Empfohlen wird ein Frequenzbereich von 0,1 Hz bis 200 kHz.     http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf
Optiphot Mikroskop	Nikon	NA	Jedes aufrechte oder inverse Phasenmikroskop kann verwendet werden. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754
50:50 (R:T) Würfelstrahlteiler	ThorLabs	BS013