Method Article

Bedingte Reprogrammierung von Pediatric menschliche Speiseröhre Epithelzellen für den Einsatz im Tissue Engineering and Disease Investigation

DOI:

10.3791/55243

⸱

March 22nd, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, UConn Health, 2Department of Gastroenterology, Connecticut Children's Medical Center, 3Department of Surgery, Connecticut Children's Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erweiterung der menschlichen pädiatrischen Ösophagus-Epithelzellen Verwendung bedingten Neuprogrammierung bietet Ermittler mit einem Patienten-spezifische Population von Zellen, die für das Engineering-Ösophagus-Konstrukte für die autologe Implantation verwendet werden können Defekte oder Verletzungen und dienen als Reservoir für die therapeutische Screening-Assays zu behandeln.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Identifizierung und Erweiterung patientenspezifischer Zellen in Kultur für den Einsatz im Tissue Engineering und in der Krankheitsforschung kann eine große Herausforderung darstellen. Die Verwendung verschiedener Arten von Stammzellen zur Ableitung von Zelltypen von Interesse ist oft kostspielig, zeitaufwändig und höchst ineffizient. Darüber hinaus müssen unerwünschte Zelltypen vor der Verwendung dieser Zellquelle entfernt werden, was einen weiteren Schritt im Prozess erfordert. Um genügend Ösophagus-Epithelzellen zu erhalten, um das Lumen eines Speiseröhrenkonstrukts zu manipulieren oder therapeutische Ansätze zur Behandlung von Speiseröhrenerkrankungen zu screenen, müssen native Speiseröhrenepithelzellen expandiert werden, ohne ihre Genexpression oder ihren Phänotyp zu verändern. Die bedingte Reprogrammierung von Epithelgewebe der Speiseröhre bietet einen vielversprechenden Ansatz zur Expansion patientenspezifischer Epithelzellen der Speiseröhre. Darüber hinaus müssen diese Zellen nicht sortiert oder gereinigt werden und kehren in einen reifen Epithelzustand zurück, nachdem sie aus der bedingten Reprogrammierungskultur entnommen wurden. Diese Technik wurde in vielen Krebsfrüherkennungsstudien beschrieben und ermöglicht eine unbegrenzte Expansion dieser Zellen über mehrere Passagen. Die Möglichkeit, Ösophagus-Screening-Assays durchzuführen, würde dazu beitragen, die Behandlung von pädiatrischen Speiseröhrenerkrankungen wie der eosinophilen Ösophagitis zu revolutionieren, indem der Auslösemechanismus identifiziert wird, der die Symptome des Patienten verursacht. Für Patienten, die an einem angeborenen Defekt, einer Krankheit oder einer Verletzung der Speiseröhre leiden, könnte diese Zellquelle als Mittel verwendet werden, um ein synthetisches Konstrukt für die Implantation zu säen, um die betroffene Region zu reparieren oder zu ersetzen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Speiseröhren Tissue Engineering und eosinophile Ösophagitis (EoE) in den Mittelpunkt der Forschung in vielen Labors in den letzten zehn Jahren. Angeborene Defekte wie Ösophagusatresie, werden in etwa 1 : 4.000 Lebendgeburten gesehen, die in der unvollständigen Entwicklung der Speiseröhre führt zu der Unfähigkeit führt 1 zu essen. Die Inzidenz und Prävalenz von EoE sind auf dem Vormarsch , seit die Identifizierung des Krankheitsbild 1993 Die Inzidenz von EoE von 0,7 / 100.000 pro Person in einem Jahr bis 10 variiert und die Prävalenz von 0,2 bis 43 / 100.000 2 reichte. Eine neue attraktive chirurgischen Ansatz lange Lücke Ösophagusatresie Behandlung besteht Gewebekonstrukte für die Implantation bei der Erzeugung von patienteneigenen Zellen verwendet. Diese Zellen in Verbindung mit synthetischen Gerüst wird eine autologe Konstrukt zu erzeugen, die nicht Immunsuppression erfordert. Einige Gruppen haben bereits damit begonnen, die uns zu untersuchen7 - e der stielartigen Zellen für Speiseröhren Tissue Engineering 3 sowie die Verwendung von nativen Zellen der Speiseröhre epithelialen der Schleimhaut 4 neu zu besiedeln. Krankheiten, die in der Speiseröhre von pädiatrischen Patienten vorhanden sind, sind oft schwer ohne Eingriff zu diagnostizieren oder zu studieren. Darüber hinaus verewigt Verwendung von Tiermodellen oder in vitro - Modellen Zelllinie für Kinderkrankheiten wie EoE nicht die genaue Pathogenese der Erkrankung oder patientenspezifische Unterschiede umfassen 8. Daher ist die Fähigkeit eines Patienten Krankheitsprozess in vitro untersuchen , um bestimmte Krankheit auslösenden Antigene zu identifizieren, zu Grunde liegenden Mechanismen zu bewerten und medikamentöse Behandlungen zu untersuchen wäre neu und bieten Kliniker mit Informationen , die in der Patientenbehandlung helfen können.

Es wurden viele autolog oder patientenspezifische Zelltypen war die für die Verwendung in tissu vorgeschlagen wurden,e-Engineering und die menschliche Krankheit Pathogenese zu studieren. Einige dieser Zelltypen werden jedoch in ihrer Fähigkeit beschränkt genügend Zellen eines bestimmten Phänotyp zu erzeugen , ein großes Gerüst oder führen einen hohen Durchsatz in vitro Studien auf Saatgut. Die Verwendung von pluripotente oder multipotente Stammzellen hat das Thema vieler Forschungs Diskussion jedoch Einschränkungen und Nachteile für diese Zellen verwendet wurden und 9 beschrieben. Die Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen ist stark diskutiert und präsentiert viele ethische Fragen auf. Am wichtigsten ist , bilden diese Zellen Teratome, die auf einen Tumor ähnlich sind, wenn sie von ihren pluripotenten Zustand nicht differenziert werden, bevor sie in einen lebenden Wirt 10 liefert. Ferner kann die Verwendung von embryonalen Stammzellen nicht patientenspezifisch und könnte eine allogene Reaktion und die Notwendigkeit einer Immunsuppression 10 hervorzurufen. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) sind pluripotente Zellen, die könnenaus patienteneigenen Zellen abgeleitet werden. Somatische Zellen, wie Hautzellen kann zu einem pluripotenten Zustand mit einer Vielzahl von integrative und nicht-integrative Techniken induziert werden. Diese Zellen dienen dann als patientenspezifische Zellquellen für das Tissue Engineering oder Krankheit Untersuchung. Die Integration von unerwünschten genetischen Materials in diesen Zellen ist ein Anliegen , viele beschrieben haben , und selbst wenn Sequenzen vollständig entfernt iPSCs erscheinen eine epigenetische "Gedächtnis" in Richtung der Zelltyp zu erhalten , von denen sie 11 abgeleitet wurden. Diese Zellen werden auch Teratome in vivo bilden , wenn nicht mehr als 11 vor der Transplantation differenziert. Viele Differenzierungs Protokolle wurden auf epithelialen Abstammungslinien 12 untersucht Fokussierungs, 13, 14, jedoch ist es sehr wichtig zu beachten , dass die Zelltypen am Ende der Differenzierung resultierenden sind nicht homogen und only besitzen einen Bruchteil der Zelltyp von Interesse. Dies führt zu einer geringen Ausbeute und die Notwendigkeit, den gewünschten Zelltyp zu reinigen. Obwohl iPSCs Quelle eine potentielle patientenspezifische Zell sind, um das Verfahren ein Zelltyp von Interesse entweder für das Tissue Engineering oder Krankheit Untersuchung erhalten sehr ineffizient ist.

Lunge 15, der Brust 16, Dünndarm 17, Kolon 18, der Blase 19 und die Speiseröhre 20: menschliche Epithelzellen wurden aus einer Vielzahl von sowohl erkrankten und nicht erkrankten Geweben im menschlichen Körper einschließlich erfolgreich isoliert. Es ist wichtig zu beachten , dass die menschliche Primärzellen eine endliche Anzahl von Durchgängen aufweisen , in dem der Phänotyp 21, 22 gehalten wird. Unglücklicherweise bedeutet dies, dass die Anzahl der Zellen für die Krankheits Untersuchung benötigt wird oder für ein angelegtes Gerüst Animpfenzur Implantation nicht erreicht werden kann. Daher werden neue Techniken benötigt Patientenzellen zu erweitern, während immer noch eine epitheliale Phänotyp beibehalten wird. Bedingte Umprogrammierung von normalen und Krebszellen epithelialen Feeder - Zellen und ROCK - Inhibitor verwendet wurde im Jahr 2012 von Liu et al. 2 3. unter Verwendung von bestrahlten Feeder-Zellen, ROCK-Inhibitor und bedingte Umprogrammierung Medium Diese Technik wurde verwendet Krebs Epithelzellen aus Biopsien von Prostata- und Brustkrebs erhalten zu erweitern. Ziel war es , genügend Zellen für in vitro - Assays , wie beispielsweise Arzneimittel - Screening erzeugen. Diese Technik ist in der Lage von Epithelzellen auf unbestimmte Zeit durch "Reprogrammierung" dieser Zellen zu einem Stamm- oder Vorläuferähnlichen Zustand erweitert, die hochproliferative ist. Es wurde gezeigt, dass diese Zellen nicht-tumorigen und besitzen nicht die Fähigkeit , Teratome 23, 24 zu bilden. Weiterhin keineChromosomenanomalien oder genetische Manipulationen waren anwesend , nachdem diese Zellen in Kultur Passagierung mit dieser Technik 23, 24. Am wichtigsten ist, sind diese Zellen nur in der Lage, in der nativen Zelltyp von Interesse zu unterscheiden. Daher bietet diese Technik ein großes Reservoir an patientenspezifische Epithelzellen für Krankheit Untersuchung oder das Tissue Engineering, ohne die Notwendigkeit für Verewigung.

Gewinnung von Epithelgewebe von einem bestimmten Organ, um Krankheitsprozesse zu studieren, ist oft begrenzt und nicht immer möglich, da das Patientenrisiko. Für jene Patienten, die an Erkrankungen der Speiseröhre oder Defekte, endoskopische Biopsie Retrieval ist eine minimal-invasive Ansatz zur Gewinnung von Epithelgewebe leiden, die dissoziiert werden können und bedingt eine unbegrenzte Zellquelle bereitzustellen umprogrammiert, die auf die Schleimhaut dieses Patienten-Ösophagus spezifisch ist. Dies ermöglicht dann für in - vitro - Studiender Epithelzellen Krankheitsprozesse und Bildschirm für potenzielle Therapeutika zu bewerten. Ein Krankheitsprozess, die sich stark von diesem Ansatz profitieren könnten , ist eosinophile Ösophagitis, die als allergische Erkrankung der Speiseröhre 8 beschrieben wurde. Allergietests sowie therapeutische Ansätze könnten in vitro ausgewertet werden , um die eigene Epithelzellen des Patienten verwenden und diese Daten können dann auf den behandelnden Arzt übergeben werden individuelle Behandlungspläne zu entwickeln. Die Technik der bedingten Umprogrammierung in Verbindung mit endoskopischen Biopsien von pädiatrischen Patienten erhalten, bietet die Fähigkeit, normale Speiseröhre epithelialen Zellen von jedem Patienten auf unbestimmte Zeit zu erweitern. Diese Zellquelle daher zusammen mit natürlichen oder synthetischen Gerüst gepaart werden, um eine patientenspezifische chirurgische Option für Defekte, eine Krankheit oder ein Trauma zu liefern. eine unbestimmte Anzahl von Zellen zu haben würde helfen, Speiseröhren Konstrukte entwickeln, die eine vollständig reseeded besitzenzu helfen, erleichtern die Regeneration der verbleibenden Zelltypen mit Ösophagus-Epithelzellen, um das Lumen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ösophagus-Biopsien wurden nach Einverständniserklärung der Eltern / Erziehungsberechtigte der pädiatrischen Patienten und gemäß Institutional Review Board (IRB # 13-094) erhalten.

1. Sterilisation von Instrumenten und Gelatinelösung

  1. Autoklav Zange, Rasierklingen und Scheren vor Gewebe Handhabung Kontamination zu verhindern.
  2. Zu 200 ml 0,1% ige Gelatinelösung zu machen, zu kombinieren 200 ml destilliertem Wasser mit 0,2 g Gelatine. Autoklav und kühl vor dem Gebrauch.

2. Beschichtungsgewebekulturplatten

  1. Etwa 2 h vor der Zellisolierung, fügen Sie genug 0,1% Gelatine mit einer Gewebekulturschale zu decken (100 mm) und Inkubation bei 37 ° C in einer Zellkultur-Inkubator.
    ANMERKUNG: Diese Platten können auch vor der Zeit und gehalten in den Inkubator vor der Verwendung hergestellt werden.

3. Herstellung Enzymlösung für die Dissoziation

  1. Etwa 30 Minuten vor der Zellisolierung abzuwiegen10 Einheiten Dispase auf einer Waage auf der Basis der Einheiten pro Milligramm Konzentration auf dem Fläschchen. Legen Sie das Pulver in einem 15 ml konischen Röhrchen mit 10 ml Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) und in einem 37 ° C Wasserbad.

4. Herstellung Zellkulturmedium

  1. Um 50 ml bedingten Umprogrammierung Medium, mischen Sie die folgenden Bestandteile in einen sterilen konischen Röhrchen: 35 ml F12 (Ham-Medium), 11,5 ml DMEM, 0,5 ml L-Glutamin, 0,5 ml 100x Penicillin / Streptomycin, 2,5 ml fötales Rinderserum (FBS), 250 ug Humaninsulin, 500 ng des menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor (EGF).
  2. Zu machen, 500 ml 3T3-Medium, Mischungs 50 ml FBS, 5 ml 100x Penicillin / Streptomycin und 5 ml L-Glutamin mit 500 ml DMEM.
  3. Um 500 ml Keratinozyten-Serum-freiem Medium, tauen EGF und Rinder (BPE) Ergänzungen (mit den Medien zur Verfügung gestellt). Fügen Sie die Ergänzungen der 500-ml-Flasche Basismedium und mit 5 ml 100x Penicillin / Streptomycin

5. Die Anzucht und Bestrahlen 3T3-Zellen als Feeder Quelle

  1. Bereiten 3T3 Medium mit DMEM, 10% FBS, 1x Penicillin / Streptomycin und 2 mM L-Glutamin.
  2. Kultur 3T3 - Zellen in Gewebe behandelten T-75 - Flaschen mindestens 3 Tage vor der Ankunft von Patientenproben.
    1. Unmittelbar vor der Ankunft von Patientenproben, trypsinize 3T3-Zellen 5 ml 0,25% Trypsin-EDTA pro Kolben verwendet und für 5 min oder bis die meisten Zellen bei 37 ° C inkubieren schweben
  3. 5 ml 3T3-Medium, um die Reaktion zu stoppen. Absaugen die Zellsuspension und Transfer zu einem 15 ml konischen Röhrchen. Spin für 5 min bei 300 x g.
  4. Absaugen Mediums und Resuspendieren der Zellen in einem definierten Volumen von Trypan Blau zur Zellzählung. Kombinieren Sie 10 ul der Zellen mit 10 & mgr; l Trypanblau tote Zellen auszuschließen. Last 10 ul dieser Lösung auf ein Hämozytometer zur Zellzählung.
    HINWEIS: Für dieses Protocol, Einsaatdichte für bestrahlte 3T3 - Zellen ist 10.900 Zellen pro cm 2, die zu 600.000 Zellen pro 100 mm Platte gleich ist.
  5. Aliquot der Anzahl der Zellen notwendig, um eine 100-mm-Platte pro Patientenprobe und resuspendieren in 25 ml 3T3 Medium in einem 50 ml konischen Röhrchen an der Platte und mit 3000 rads bestrahlen.
  6. Nach der Bestrahlung Spin Zellen nach unten für 5 Minuten bei 300 g und Resuspendieren in bedingten Umprogrammierung Medium mit 5 ml pro 100 mm Platte.
  7. Stellen Sie den Schlauch zur Seite, bis die Beschichtung von Patientenzellen erfolgt später im Protokoll (siehe Schritt 7.6).

6. Beschaffung, Konservierung und Transport von Pediatric Ösophagus Biopsien

  1. 5 ml komplettes Keratinozyten-Serum-freiem Medium mit 100 ug / ml primocin bis 15 ml konische Röhrchen und bringen sie in die medizinische Einrichtung auf dem Eis.
    ANMERKUNG: Diese Rohre des Mediums kann für bis zu 2 Monate bei 4 ° C gelagert werden.
  2. Erhalten Sie ca. 8 Ösophagus Biopsien am timich der Endoskopie und getrennt wie folgt:
    1. Legen Sie sechs Biopsien in den 15 ml konischen mit vollständigen Keratinozyten-Serum freies Medium mit 100 ug / ml primocin und auf nassem Eis.
    2. Legen Sie eine Biopsie in 5 ml gepuffertem Formalin und auf nassem Eis.
    3. Legen Sie eine Biopsie in einer kleinen Biopsie cryomold mit optimalen Schnitttemperatur Verbindung.
      1. fallen sofort diese Form in einen Becher mit Isopentan in flüssigem Stickstoff gegeben. Einmal eingefroren, legen Sie die cryomold in einer Probe Beutel und lagern auf Trockeneis in einem Polystyrol-Schaumbehälter.
  3. Die Röhrchen Biopsien in Medium oder Formalin in einem verschließbaren Beutel und dann in einen Versandkarton enthält nassem Eis enthält. Siegel und beschriften Sie die Box mit einem Biohazard-Label und transportieren sie ins Labor.
    HINWEIS: Der Behälter, der das Trockeneis und gefrorene Biopsie enthält, wird auch mit einem biohazard Aufkleber verschlossen und beschriftet.

7. VerarbeitungPatientengewebe für Downstream Kultur und Analyse

  1. Bei der Ankunft im Labor, übertragen Sie die gefrorene Biopsie auf Trockeneis auf -80 ° C Gefrierschrank für nachgeschaltete Schnitte oder RNA-Extraktion. Legen Sie die Probe in Formalin. Speichern Sie in einem 4 ° C Kühlschrank und lassen über Nacht zu beheben.
  2. Drehen Sie die restlichen Biopsien nach unten bei 300 g und absaugen Medium. 10 ml Dispase-Lösung zu dem konischen Rohr, Dichtung und ermöglichen es für 15 min bei 37 ° C in einem Wasserbad inkubiert.
  3. Nach der Inkubation spinnen die Biopsien bei 300 x g nach unten. Absaugen Medium und resuspendieren Biopsien in 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA.
  4. Übertragen Sie die 5 ml Trypsin-EDTA die Biopsien zu einer 100 mm sterile Platte enthält und Hackfleisch die Biopsien mit 2 sterilisierten Rasierklingen so fein wie möglich.
  5. Übertragen Sie die 5 ml Trypsin-EDTA gehackten Biopsien zu einem neuen 15 ml konischen. Spülen Sie die Platte zweimal mit einem zusätzlichen 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA und fügen Sie dem konischenTube. Inkubieren Sie die Röhrchen für 10 Minuten in einem 37 ° C Wasserbad.
  6. Nach der Inkubation spinnen die Biopsien bei 300 g nach unten (1,4 RPM) für 5 min und das Medium absaugen. 5 ml bedingten Umprogrammierung Mediums zu dem konischen Rohr sowie die 5 ml bedingten Umprogrammierung Medium, das die bestrahlte feeder-Zellen enthält (siehe Schritt 5.7).
  7. Rock-Inhibitor (1 ul / ml) zu dem 10 ml Zellsuspension und der Platte, nachdem die Gelatine aus der Gewebekulturschale abgesaugt. Inkubieren bei 37 ° C.

8. Die Anzucht und Ausbau der Zellen

  1. Nach ca. 5 Tagen Kultur absaugen Ausgangsmedium die gehackten-Biopsie Stücke und spült die Kapsel 2-3 mal mit 5 ml sterilem PBS enthält. Neuen Medium auf die Platte einschließlich ROCK-Inhibitor bei 10 uM.
  2. Bei 70% Konfluenz erreichen, erweitern die Zellen. 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA zur Platte und Inkubation in einem 37 ° C Inkubator nicht mehr als 2,5 min zu entfernen the-Feeder-Zellen. Im Anschluss an diese Inkubation absaugen Trypsin-EDTA und spülen Sie die Platte mit 5 ml PBS.
  3. Saugen Sie das PBS und 5 ml 0,25% Trypsin-EDTA auf die Platte und Inkubation für 5-10 Minuten oder bis die Zellen von der Platte lose sind. Hinzufügen gleiche Mengen von Medium zu der Platte um die Reaktion zu stoppen und zu übertragen, die gesamte Flüssigkeit in ein 50 ml konisches Röhrchen und zentrifugieren bei 300 xg für 5 min.
  4. Die Zellen in einem definierten Volumen des bedingten Umprogrammierung Medium und 10 & mgr; l der Suspension mit 10 & mgr; l Trypanblau mischen. Zählen Sie auf einem Hämozytometer Gesamtzellzahl zu bestimmen.
  5. So erweitern Zellen, fügen Sie 1 Million menschliche Speiseröhre Zellen auf eine 150-mm-Platte zusammen mit 1,2 Millionen bestrahlten 3T3-Zellen in einem Gesamtvolumen von 15 ml. Fügen Sie frisches ROCK-Inhibitor bei 10 uM und fügen Sie die Zellsuspension auf eine mit Gelatine beschichtete 150-mm-Schale.

9. Einfrieren und Lagerung der menschliche Speiseröhre Epithelzellen

  1. Um Gefriermedium, mit 10%DMSO zu bedingten Umprogrammierung Medium. Nach Trypsinisierung und Zählen, Aliquotierung der Zellen in ein neues 50 ml konischen Röhrchen einzufrieren und bei 300 g für 5 min Spin-Down.
  2. Saugen Sie das Medium und fügen Sie in einem Volumen von 2 ml pro Cryovial Einfriermedium. Nachdem die Zellsuspension homogen, Aliquot 10 6 Zellen in vormarkiert cyrovials. In einem Gefrierbehälter bei -80 ° C für mindestens 24 h vor dem Bewegen der Phiolen zur langfristigen Lagerung in flüssigem Stickstoff.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine Zusammenfassung der wichtigsten Schritte in der Speiseröhre Epithelzellen von Patienten Biopsien Isolierung ist in Abbildung 1 zusammengefasst. Kolonien von Epithelzellen wird in etwa 4-5 Tagen bilden und wird von Fibroblasten - Feeder - Zellen (2A) umgeben sein. Da diese Kolonien erweitern werden sie mit anderen Kolonien verschmelzen zu größeren Kolonien (2B) bilden. Sobald die Kulturen 70% konfluent geworden sind, müssen sie erwei...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die wichtigsten Schritte, um Epithelzellen der Speiseröhre von Patienten-Biopsien zu isolieren und zu erweitern sind: 1) ausreichend Biopsiegewebe mit minimaler Zelltod dissoziierenden; 2) sorgen für ROCK-Inhibitor zu dem Zellkulturmedium bei jedem Mediumwechsel gegeben; 3) Nehmen Sie nicht mehr Feeder-Zellen verwenden als empfohlen; 4) halten eine saubere aseptischen Kultur; und 5) Passage Zellen unmittelbar vor dem Erreichen der Konfluenz.

Aufgrund der patientenbezogenen Unterschiede in Bi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir möchten dem Connecticut Children's Medical Center Strategic Research Funding für die Unterstützung dieser Arbeit danken.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PrimocinInVivogenant-pm2
IsopentanSigma Aldrich277258-1L
Gelatine aus SchweinehautSigma AldrichG1890-100G
DMEMThermofisher Scientific11965092
CryomoldTissueTek4565
Kryomatrix OCTThermofisher Scientific
15 mL konische RöhrchenDenville ScientificC1017-p
Vollständiges Keratinozytenserum Freies MediumThermofisher Scientific10724011
Penicillin StreptomycinThermofisher Scientific15140122
GlutamaxThermofisher Scientific35050061
InsulinlösungSigma AldrichI9278-5ml
Humaner epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)PeprotechAF-100-15
ROCK-Inhibitor (Y-27632)Fisher Scientific125410
F-12 Medium ThermofisherScientific 11765054
Fötales RinderserumDenvilleScientific FB5001
DispaseThermofisherScientific 17105041
0,05 % Trypsin-EDTAThermofisherScientific 25300062
0,25 % Trypsin-EDTAThermofisher Scientific25200072
100 mm SchalenDenville ScientificT1110-20
150 mm SchalenDenville ScientificT1115
50 mL ConicalsDenville Scientific  Nr. C1062-9 
Phosphatgepufferte KochsalztablettenFisher ScientificBP2944-100
5 mL PipettenFisher Scientific1367811D
10 mL PipettenFisher Scientific1367811E
25 mL PipettenFisherScientific 1367811
9" Pasteur PipettenFisher Scientific13-678-20D
NIH 3T3-ZellenATCC-CRL1658
6769006

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clark, D. C. Esophageal atresia and tracheoesophageal fistula. Am Fam Physician. 59 (4), 910-920 (1999).
  2. Soon, I. S., Butzner, J. D., Kaplan, G. G., deBruyn, J. C. Incidence and prevalence of eosinophilic esophagitis in children. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 57 (1), 72-80 (2013).
  3. Sjöqvist, S., et al. Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats. Nat Commun. 5, 3562(2014).
  4. Saxena, A. K. Esophagus tissue engineering: designing and crafting the components for the 'hybrid construct' approach. Eur J Pediatr Surg. 24 (3), 246-262 (2014).
  5. Saxena, A. K., Ainoedhofer, H., Höllwarth, M. E. Culture of ovine esophageal epithelial cells and in vitro esophagus tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 16 (1), 109-114 (2010).
  6. Saxena, A. K., Kofler, K., Ainodhofer, H., Hollwarth, M. E. Esophagus tissue engineering: hybrid approach with esophageal epithelium and unidirectional smooth muscle tissue component generation in vitro. J Gastrointest Surg. 13 (6), 1037-1043 (2009).
  7. Macheiner, T., Kuess, A., Dye, J., Saxena, A. K. A novel method for isolation of epithelial cells from ovine esophagus for tissue engineering. Biomed Mater Eng. 24 (2), 1457-1468 (2014).
  8. Mishra, A. Significance of Mouse Models in Dissecting the Mechanism of Human Eosinophilic Gastrointestinal Diseases (EGID). J Gastroenterol Hepatol Res. 2 (11), 845-853 (2013).
  9. Medvedev, S. P., Shevchenko, A. I., Zakian, S. M. Induced Pluripotent Stem Cells: Problems and Advantages when Applying them in Regenerative Medicine. Acta Naturae. 2 (2), 18-28 (2010).
  10. Metallo, C. M., Azarin, S. M., Ji, L., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Engineering tissue from human embryonic stem cells. J Cell Mol Med. 12 (3), 709-729 (2008).
  11. Lee, H., Park, J., Forget, B. G., Gaines, P. Induced pluripotent stem cells in regenerative medicine: an argument for continued research on human embryonic stem cells. Regen Med. 4 (5), 759-769 (2009).
  12. Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J Clin Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
  13. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2013).
  14. Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 5, 17297(2015).
  15. Ehrhardt, C., Kim, K. J., Lehr, C. M. Isolation and culture of human alveolar epithelial cells. Methods Mol Med. 107, 207-216 (2005).
  16. Zubeldia-Plazaola, A., et al. Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells. Front Cell Dev Biol. 3, 32(2015).
  17. Spurrier, R. G., Speer, A. L., Hou, X., El-Nachef, W. N., Grikscheit, T. C. Murine and human tissue-engineered esophagus form from sufficient stem/progenitor cells and do not require microdesigned biomaterials. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 906-915 (2015).
  18. Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol Med. 50, 15-20 (2001).
  19. Southgate, J., Hutton, K. A., Thomas, D. F., Trejdosiewicz, L. K. Normal human urothelial cells in vitro: proliferation and induction of stratification. Lab Invest. 71 (4), 583-594 (1994).
  20. Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nat Protoc. 7 (2), 235-246 (2012).
  21. Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).
  22. Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., et al. Molecular Cell Biology. , W.H. Freeman. New York. (2000).
  23. Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
  24. Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20035-20040 (2012).
  25. Davis, A. A., et al. A human retinal pigment epithelial cell line that retains epithelial characteristics after prolonged culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (5), 955-964 (1995).
  26. Carro, O. M., Evans, S. A., Leone, C. W. Effect of inflammation on the proliferation of human gingival epithelial cells in vitro. J Periodontol. 68 (11), 1070-1075 (1997).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Conditional ReprogrammingEsophageal Epithelial CellsTissue EngineeringPediatric EsophagusEndoscopic BiopsyFeeder Cell RemovalROCK InhibitorEpithelial Cell ExpansionEosinophilic Esophagitis3D Esophageal Scaffold

Related Articles