Bedingte Reprogrammierung von Pediatric menschliche Speiseröhre Epithelzellen für den Einsatz im Tissue Engineering and Disease Investigation

Zusammenfassung

Erweiterung der menschlichen pädiatrischen Ösophagus-Epithelzellen Verwendung bedingten Neuprogrammierung bietet Ermittler mit einem Patienten-spezifische Population von Zellen, die für das Engineering-Ösophagus-Konstrukte für die autologe Implantation verwendet werden können Defekte oder Verletzungen und dienen als Reservoir für die therapeutische Screening-Assays zu behandeln.

Zusammenfassung

Die Identifizierung und Erweiterung patientenspezifischer Zellen in Kultur für den Einsatz im Tissue Engineering und in der Krankheitsforschung kann eine große Herausforderung darstellen. Die Verwendung verschiedener Arten von Stammzellen zur Ableitung von Zelltypen von Interesse ist oft kostspielig, zeitaufwändig und höchst ineffizient. Darüber hinaus müssen unerwünschte Zelltypen vor der Verwendung dieser Zellquelle entfernt werden, was einen weiteren Schritt im Prozess erfordert. Um genügend Ösophagus-Epithelzellen zu erhalten, um das Lumen eines Speiseröhrenkonstrukts zu manipulieren oder therapeutische Ansätze zur Behandlung von Speiseröhrenerkrankungen zu screenen, müssen native Speiseröhrenepithelzellen expandiert werden, ohne ihre Genexpression oder ihren Phänotyp zu verändern. Die bedingte Reprogrammierung von Epithelgewebe der Speiseröhre bietet einen vielversprechenden Ansatz zur Expansion patientenspezifischer Epithelzellen der Speiseröhre. Darüber hinaus müssen diese Zellen nicht sortiert oder gereinigt werden und kehren in einen reifen Epithelzustand zurück, nachdem sie aus der bedingten Reprogrammierungskultur entnommen wurden. Diese Technik wurde in vielen Krebsfrüherkennungsstudien beschrieben und ermöglicht eine unbegrenzte Expansion dieser Zellen über mehrere Passagen. Die Möglichkeit, Ösophagus-Screening-Assays durchzuführen, würde dazu beitragen, die Behandlung von pädiatrischen Speiseröhrenerkrankungen wie der eosinophilen Ösophagitis zu revolutionieren, indem der Auslösemechanismus identifiziert wird, der die Symptome des Patienten verursacht. Für Patienten, die an einem angeborenen Defekt, einer Krankheit oder einer Verletzung der Speiseröhre leiden, könnte diese Zellquelle als Mittel verwendet werden, um ein synthetisches Konstrukt für die Implantation zu säen, um die betroffene Region zu reparieren oder zu ersetzen.

Einleitung

Speiseröhren Tissue Engineering und eosinophile Ösophagitis (EoE) in den Mittelpunkt der Forschung in vielen Labors in den letzten zehn Jahren. Angeborene Defekte wie Ösophagusatresie, werden in etwa 1 : 4.000 Lebendgeburten gesehen, die in der unvollständigen Entwicklung der Speiseröhre führt zu der Unfähigkeit führt ¹ zu essen. Die Inzidenz und Prävalenz von EoE sind auf dem Vormarsch , seit die Identifizierung des Krankheitsbild 1993 Die Inzidenz von EoE von 0,7 / 100.000 pro Person in einem Jahr bis 10 variiert und die Prävalenz von 0,2 bis 43 / 100.000 ² reichte. Eine neue attraktive chirurgischen Ansatz lange Lück....

Protokoll

Ösophagus-Biopsien wurden nach Einverständniserklärung der Eltern / Erziehungsberechtigte der pädiatrischen Patienten und gemäß Institutional Review Board (IRB # 13-094) erhalten.

1. Sterilisation von Instrumenten und Gelatinelösung

1. Autoklav Zange, Rasierklingen und Scheren vor Gewebe Handhabung Kontamination zu verhindern.
2. Zu 200 ml 0,1% ige Gelatinelösung zu machen, zu kombinieren 200 ml destilliertem Wasser mit 0,2 g Gelatine. Autoklav und kühl vor dem Gebrauch.

2. Beschichtungsgewebekulturplatten

1. Etwa 2 h vor der Zellisolierung, fügen Sie genug 0,1% Gelatine mit einer Gewebekulturschale zu....

Ergebnisse

Eine Zusammenfassung der wichtigsten Schritte in der Speiseröhre Epithelzellen von Patienten Biopsien Isolierung ist in Abbildung 1 zusammengefasst. Kolonien von Epithelzellen wird in etwa 4-5 Tagen bilden und wird von Fibroblasten - Feeder - Zellen (2A) umgeben sein. Da diese Kolonien erweitern werden sie mit anderen Kolonien verschmelzen zu größeren Kolonien (2B) bilden. Sobald die Kulturen 70% konfluent geworden sind, müssen sie erwei.......

Diskussion

Die wichtigsten Schritte, um Epithelzellen der Speiseröhre von Patienten-Biopsien zu isolieren und zu erweitern sind: 1) ausreichend Biopsiegewebe mit minimaler Zelltod dissoziierenden; 2) sorgen für ROCK-Inhibitor zu dem Zellkulturmedium bei jedem Mediumwechsel gegeben; 3) Nehmen Sie nicht mehr Feeder-Zellen verwenden als empfohlen; 4) halten eine saubere aseptischen Kultur; und 5) Passage Zellen unmittelbar vor dem Erreichen der Konfluenz.

Aufgrund der patientenbezogenen Unterschiede in Bi.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Primocin	InVivogen	ant-pm2
Isopentan	Sigma Aldrich	277258-1L
Gelatine aus Schweinehaut	Sigma Aldrich	G1890-100G
DMEM	Thermofisher Scientific	11965092
Cryomold	TissueTek	4565
Kryomatrix OCT	Thermofisher Scientific
15 mL konische Röhrchen	Denville Scientific	C1017-p
Vollständiges Keratinozytenserum Freies Medium	Thermofisher Scientific	10724011
Penicillin Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140122
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050061
Insulinlösung	Sigma Aldrich	I9278-5ml
Humaner epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)	Peprotech	AF-100-15
ROCK-Inhibitor (Y-27632)	Fisher Scientific	125410
F-12 Medium	Thermofisher	Scientific 11765054
Fötales Rinderserum	Denville	Scientific FB5001
Dispase	Thermofisher	Scientific 17105041
0,05 % Trypsin-EDTA	Thermofisher	Scientific 25300062
0,25 % Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25200072
100 mm Schalen	Denville Scientific	T1110-20
150 mm Schalen	Denville Scientific	T1115
50 mL Conicals	Denville Scientific	Nr. C1062-9
Phosphatgepufferte Kochsalztabletten	Fisher Scientific	BP2944-100
5 mL Pipetten	Fisher Scientific	1367811D
10 mL Pipetten	Fisher Scientific	1367811E
25 mL Pipetten	Fisher	Scientific 1367811
9" Pasteur Pipetten	Fisher Scientific	13-678-20D
NIH 3T3-Zellen	ATCC-CRL1658

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