Intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie zu identifizieren Lymphozytensubpopulationen in Murine Aorta, Niere und Lymphknoten in einem Modell von Hypertonie

Fanny Laroumanie; Bethany L. Dale; Mohamed A. Saleh; Meena S. Madhur

doi:10.3791/55266

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Methodenartikel

Intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie zu identifizieren Lymphozytensubpopulationen in Murine Aorta, Niere und Lymphknoten in einem Modell von Hypertonie

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DOI:

10.3791/55266

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28. Januar 2017

Fanny Laroumanie¹ , Bethany L. Dale² , Mohamed A. Saleh³ , Meena S. Madhur¹

¹Department of Medicine, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center, ²Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, ³Department of Pharmacology and Toxicology, Faculty of Pharmacy, Mansoura University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel enthält detaillierte Methodik zur Identifizierung und funktionelle T-Lymphozyten-Untergruppen, die innerhalb Maus Niere, Aorta und der Lymphknoten durch die intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie zu quantifizieren. Das Modell der Angiotensin-II-induzierte Hypertonie wurde zu erklären, ausgewählt, Schritt-für-Schritt, die Verfahren und die grundlegenden Prinzipien der Durchflusszytometrie und intrazelluläre Färbung.

Zusammenfassung

Es ist mittlerweile allgemein bekannt, dass T-Lymphozyten eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung mehrerer Herz-Kreislauf-Erkrankungen spielen^1,2,3,4,5. Zum Beispiel haben Studien aus unserer Gruppe gezeigt, dass Bluthochdruck mit einer übermäßigen Ansammlung von T-Zellen in den Gefäßen und der Niere während der Entwicklung der experimentellen Hypertonie verbunden ist⁶. In diesen Geweben produzieren T-Zellen mehrere Zytokine, die sowohl die Gefäß- als auch die Nierenfunktion beeinflussen und zu Vasokonstriktion sowie Natrium- und Wasserretention führen^1,2. Um vollständig zu verstehen, wie T-Zellen Herz-Kreislauf- und Nierenerkrankungen verursachen, ist es wichtig, die spezifischen T-Zell-Untergruppen in diesen Geweben identifizieren und quantifizieren zu können. T-Zell-Untergruppen werden durch eine Kombination von Oberflächenmarkern, den von ihnen sezernierten Zytokinen und den von ihnen exprimierten Transkriptionsfaktoren definiert. Die Komplexität der T-Zellpopulation macht die Durchflusszytometrie und die intrazelluläre Färbung zu einer unschätzbaren Technik, um die Phänotypen der im Gewebe vorhandenen Lymphozyten zu entschlüsseln. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Identifizierung der oberflächen- und intrazellulären Marker (Zytokine und Transkriptionsfaktoren) in T-Zellen zur Verfügung, die aus murinen Nieren-, Aorta- und Aortendrainage-Lymphknoten in einem Modell der Angiotensin-II-induzierten Hypertonie isoliert wurden. Folgende Schritte werden detailliert beschrieben: Isolierung der Gewebe, Erzeugung der Einzelzellsuspensionen, ex vivo Stimulation, Fixierung, Permeabilisierung und Färbung. Darüber hinaus werden mehrere grundlegende Prinzipien der durchflusszytometrischen Analyse diskutiert, einschließlich der Auswahl der richtigen Kontrollen und geeigneter Gating-Strategien.

Einleitung

Neuere Erkenntnisse zeigen , dass das adaptive Immunsystem, insbesondere T - Lymphozyten, eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung verschiedener kardiovaskulärer Erkrankungen ^1,2,3,4,5 spielen. Beispielsweise im Modell der Angiotensin - II induzierten Bluthochdruck, eine Anhäufung von T - Zellen in den Gefäßen und den Nieren der Mäuse wurde ⁶ beschrieben. Das vaskuläre Akkumulation überwiegend in der Adventitia und des perivaskulären Fett. In der Niere akkumulieren T-Zellen sowohl in der Medulla und Nierenrinde. Je nachdem , welche Teilmenge beteiligt ist, geben diese T - Zellen zu unterschiedlichen Zytokine, vaskulären und renalen Funktion ....