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Methodenartikel

Murine Lymphocyte Kennzeichnung von

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DOI:

10.3791/55270

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29. April 2017

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1Werner Siemens Imaging Center, Department of Preclinical Imaging and Radiopharmacy, Eberhard Karls University Tübingen, 2Department of Dermatology, Eberhard Karls University Tübingen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Nach der Herstellung eines 64 Cu-modifizierte monoklonale Antikörperbindung an einem transgenen Maus - T - Zell - Rezeptor, sind T - Zellen radioaktiv markiert in vivo, analysiert auf ihre Lebensfähigkeit, Funktionalität, Etikettieren Stabilität und Apoptose und adoptiv transferiert in Mäuse mit einem Atemweg Allergien vom verzögerten Typ Reaktion zur nichtinvasiven Bildgebung durch Positronen-Emissions-Tomographie / Computertomographie (PET / CT).

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt die Herstellung von 64 Cu und die Chelator Konjugation / radioaktive Markierung eines monoklonalen Antikörpers (mAb) , gefolgt von murine Lymphozyten - Zellkultur und 64 Cu-Antikörper - Rezeptor der Zellen abzielen. In - vitro - Bewertung der radioaktive Markierung und nicht-invasiven in vivo - Zellverfolgung in einem Tiermodell einer Atemwegs verzögerten Typ Überempfindlichkeitsreaktion (DTHR) von PET / CT beschrieben.

Im Detail wird die Konjugation eines mAb mit dem Chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure (DOTA) gezeigt. Nach der Herstellung von radioaktivem 64 Cu, radioaktiver Markierung der DOTA-konjugierten mAb beschrieben. Als nächstes werden die Erweiterung der Hühnerovalbumin (COVA) -spezifische CD4 + Interferon (IFN) -γ-produzierende T - Helferzellen (COVA-TH1) und die anschließende radioaktive Markierung der Cova-TH1 - Zellen dargestellt. Verschiedene in vitro - Techniken werden zur Veranschaulichung der ef auszuwertenkungen von 64 Cu-Radiomarkierungs auf den Zellen, wie die Bestimmung der Lebensfähigkeit der Zellen durch Trypanblau-Ausschluß, die Färbung auf Apoptose mit Annexin V für die Durchflusszytometrie und die Beurteilung der Funktionalität , die durch IFN-γ enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) . Darüber hinaus ist die Bestimmung der radioaktiven Aufnahme in die Zellen und die Markierungsstabilität im Detail beschrieben. Dieses Protokoll weiter beschrieben, wie Zell Tracking-Studien in einem Tiermodell für einen Atemweg DTHR und daher durchzuführen, die Induktion von COVA-induziertem akuten Atemweg DHTR in BALB / c-Mäusen ist enthalten. Schließlich ist eine robuste PET / CT-Workflow inklusive Bildaufnahme, Rekonstruktion und Analyse vorgestellt.

Der Cu-64 - Antikörper - Rezeptor - Targeting - Ansatz mit nachfolgender Rezeptor - Internalisierung hohe Spezifität und Stabilität, reduzierte zelluläre Toxizität bereitstellt, und niedrigen Efflux Raten im Vergleich zu herkömmlichem PET-Tracer für die Markierung von Zellen, beispielsweise 64 Cu-pyruvaldehyde bis (N4-methylthiosemicarbazon) (64-PTSM Cu). Schließlich ermöglicht unser Ansatz nicht-invasive in vivo Zellverfolgung durch PET / CT mit einem optimalen Signal-Rausch - Verhältnis für 48 Stunden. Dieser experimentelle Ansatz kann auf verschiedenen Tiermodellen und Zelltypen mit membrangebundenen Rezeptoren übertragen werden, die internalisiert werden.

Einleitung

Nicht-invasive Zellverfolgung ist ein vielseitiges Werkzeug , Zellfunktion, Migration und Homing in vivo zu überwachen. Recent Zellverfolgung Studien haben sich auf mesenchymale 1, 2 oder Knochenmark stammende Stammzellen 3 im Rahmen der regenerativen Medizin, autologem peripherer weißer Blutzellen in einer Entzündung oder T - Lymphozyten in adoptiven Zelltherapien gegen Krebs 3, 4 konzentriert. Die Aufklärung der Wirkorte und die zugrunde liegenden biologischen Prinzipien der zellbasierten Therapien ist von großer Bedeutung. CD8 + zytotoxische T - Lymphozyten, genetisch chimäres Antigen - Rezeptor (CAR) oder T - Zellen tumorinfiltrierende Lymphocyten engineered (TILs) wurden in großem Umfang als der Goldstandard. Allerdings Tumor-assoziiertes Antigen-spezifische TH1 - Zellen haben sich als eine wirksame alternative Behandlungsoption 4, sein </ sup> 5, 6, 7.

Als wichtige Akteure bei der Entzündung, organspezifischen Autoimmunerkrankungen (zB rheumatoide Arthritis oder Asthma bronchiales), und Zellen von großen Interesse in der Krebsimmuntherapie, ist es wichtig , die zeitliche Verteilung und Referenzierung Muster von TH1 - Zellen zu charakterisieren. Nicht - invasive in - vivo - Bildgebung durch PET stellt eine quantitative, hochempfindliche Methode 8 Zellmigrationsmuster, in vivo Referenzierung und die Seiten der T - Zell - Antworten und die Aktion während der Entzündung, Allergien, Infektionen oder Tumorabstoßungs 9, 10, 11 zu untersuchen.

Klinisch 111 In-Oxin ist für Leukozyten - Szintigraphie für die Unterscheidung von Entzündung und Infektion 12, während 2-deoxy-2- (18 verwendet ,F) fluoro-D-glucose (18 F-FDG) wird für die Zell Tracking - Studien von PET 3, 13 verwendet. Ein wesentlicher Nachteil dieses PET - Tracer, jedoch ist die kurze Halbwertszeit des Radionuklide 18 F bei 109,7 min und der niedrigen intrazelluläre Stabilität , die Bildübertragung zu späteren Zeitpunkt nach der Adoptivzelle behindert. Für längerfristige in - vivo - Studien Zellverfolgung von PET, obwohl instabil in den Zellen, 64 Cu-PTSM häufig unspezifisch eingesetzt zu etikettieren Zellen 14, 15 mit minimierten nachteiligen Wirkungen auf T - Zell - Lebensfähigkeit und Funktion 16.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur weiteren nachteiligen Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu reduzieren und die Funktion eines T-Zell-Rezeptor (TCR) -spezifischen radiomarkierten mAb verwendet. Zunächst wird die Herstellung der Radioisotop 64 Cu, die Konjugation des mAb KJ1-26 mit the Chelator DOTA und die nachfolgenden 64 Cu-Radiomarkierungs gezeigt. In einem zweiten Schritt wird die Isolierung und Expansion von COVA TH1-Zellen von DO11.10 Spendermäusen und die radioaktive Markierung mit 64 Cu belasteten DOTA-konjugierten mAb KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) werden im Detail beschrieben. Die Beurteilung der Aufnahmewerte und Ausströmen von Radioaktivität mit einem Dosiskalibrator und y-Zählung jeweils sowie die Bewertung der Wirkungen von 64 Cu-Radiomarkierungs auf die Lebensfähigkeit der Zellen durch Trypanblau-Ausschluss und Funktionalität mit IFN- & gamma; ELISA vorgestellt . Für nicht-invasive in vivo - Zellverfolgung, das Hervorrufen von einem Maus - Modell von COVA-induzierter akuten Atemweg DTHR und Bildaufnahme von PET / CT nach dem adoptiven Zelltransfer beschrieben.

Darüber hinaus kann diese Kennzeichnung Ansatz zu verschiedenen Krankheitsmodellen, Maus-T-Zellen mit unterschiedlichen TCRs oder allgemeinen Zellen von Interesse mit membrangebundenen Rezeptoren oder Ausdruck mar übertragen werdenkers kontinuierlichen Membran Basiswert 17 pendelt.

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Protokoll

Sicherheitshinweise: Bei der Radioaktivität Handhabung speichern 64 Cu hinter 2-Zoll dicken Bleiziegel und verwenden entsprechende Abschirmung für alle Schiffe , die Aktivität. Verwenden Sie geeignete Werkzeuge, um indirekt ungeschirmte Quellen verarbeiten zu direkten Handkontakt zu vermeiden und minimieren Exposition gegenüber radioaktivem Material. Tragen Sie immer Strahlendosimetrie Überwachung Abzeichen und persönliche Schutzausrüstung und prüfen Sie sich selbst und der Arbeitsbereich für Kontamination unverzüglich es zu adressieren. Entsorgen Sie möglicherweise kontaminierte persönliche Schutzausrüstung vor dem Verlassen den Bereichs, in dem radioaktive Material verwendet wird. Lagern Sie die gesamten radioaktiven Abfälle hinter Bleiabschirmung , bis das radioaktive 64 Cu abgeklungen ist (ca. 10 Halbwertszeiten = 127 h) , bevor ein ausreichende Entsorgung.

1. 64 Cu Produktion

HINWEIS: Das Radioisotop 64 Cu 64 Ni über die (p, n) 64 Cu - Kernreaktion unter Verwendung eines PETT hergestellt wirdrace Zyklotron gemäß einem modifizierten Protokoll von McCarthy et al. 18.

  1. Bei 64 Cu Produktion, bestrahlen 64 Ni, die auf einer Platin / Iridium Platte (90/10), mit 30 & mgr; A für 6 h mit einem Protonenstrahl von 12,4 MeV elektroplattiert wird.
  2. Erhitzen Sie das Platin / Iridium - Target auf 100 ° C in einer dedizierten Polyetheretherketon (PEEK) Kammer und Inkubation für 20 min in 2 ml konzentrierter HCl 64 Cu / Ni 64 aufzulösen.
  3. Fügen Sie eine weitere 1 ml konzentrierter HCl und 10 min inkubiert.
  4. Man dampft HCl Argonstrom verwendet und die Kammer auf Raumtemperatur abkühlen.
  5. Spülen Sie die Kammer mit 3 ml 4% 0,2 M HCl und 96% Methanol (v / v) gelöst und diese Lösung in eine Ionenaustauschsäule, die war vorbehandelt mit 4% 0,2 M HCl in Methanol für mindestens 15 min. Der Durchfluss kann zu recyceln 64 Ni verwendet werden.
  6. Waschen Sie die 64 Cu in der Säule mit 4% 0,2 M HCl i beibehaltenn Methanol.
  7. Eluieren 64 Cu mit 70% 1,3 M HCl / 30% Isopropanol (v / v) in ein Sammelgefäß, um die Lösung in einem Argonstrom verdampfen und die Phiole auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
  8. Man löst 64 Cu in 140-210 ul 0,1 M HCl.

2. Antikörperkonjugation mit DOTA und anschließenden 64 Cu-Radiomarkierungs

HINWEIS: Der Chelator DOTA wird funktionelle Aminogruppen des mAb von N-Hydroxysuccinimid (NHS) -Ester Chemie und das Konjugat wird anschließend mit 64 Cu 19 radiomarkiert verknüpft werden.

  1. Stellen Sie die Konzentration des KJ1-26-mAb bis 8 mg / ml und Diafiltrat 1 ml mAb - Lösung gegen 0,1 M Na 2 HPO 4 pH 7,5 , behandelt mit 1,2 g / l eines chelatbildenden Ionenaustauscherharzes mit einem Molekulargewicht unter Verwendung abgeschnitten ( MWCO 30 kDa) Zentrifugalfiltereinheit. Anwenden 3 anschließende Waschschritte mit 14 ml des Puffers. Nach dem letzten Waschschritt,Konzentrat wieder die Lösung auf 1 ml. Quantifizierung der Antikörperkonzentration von OD 280nm Messungen.
  2. Vorbereiten eine DOTA-NHS-Lösung in ultrareinem oder PCR-graden Wasser bei einer Konzentration von 10 mg / ml unmittelbar vor der Verwendung. Lassen Sie das Fläschchen auf Raumtemperatur vor dem Öffnen einstellen Kondensation von Wasser zu vermeiden und sorgfältig DOTA-NHS mit einem Plastikspatel entfernen. Hinzufügen 216 ul dieser DOTA-NHS-Lösung bis 8 mg der diafiltrierten KJ1-26-mAb-Lösung gründlich mischte, und inkubiere für 24 h bei 4 ° C auf einem Taumelmischer.
  3. Diafiltrat die DOTA-KJ1-26-mAb gegen 0,25 M Ammoniumacetat, pH 7,0, behandelt mit 1,2 g / l einem chelatbildenden Ionenaustauscherharzes mit einem Molekulargewicht abgeschnitten unter Verwendung von (MWCO 30 kDa) Zentrifugalfiltereinheit. Bewerben 7 Waschschritte. Konzentriere das mAb auf ein Endvolumen von 1 ml und messen erneut die Proteinkonzentration wurde durch OD 280 nm Messungen.
  4. Vor der Radiomarkierung, tauschen den Puffer des DOTA-KJ1-26-mAb zu PBS über size-exclusion Chromatographie unter Anwendung von Gelfiltrations-. Damit entfällt auch Potential niedermolekulare Verunreinigungen.
  5. Herstellung von 100 MBq 64 CuCl 2 -Lösung in 10 mM HCl und Einstellen des pH - Werts auf 6-7 mit 10 - fach PBS. In 200 ug DOTA-KJ1-26-mAb. bei 37 ° C für 60 min inkubieren.
  6. Zur Qualitätskontrolle durchführt Dünnschichtchromatographie mit 0,1 M Natriumcitrat (pH 5) als mobiler Phase und durch Autoradiographie analysiert. Mindestens 90% der Aktivität sollte an den Antikörper gebunden werden und somit am Startfleck erkannt werden. Ungebundene Aktivität wird durch die Citrat-basierte mobile Phase und den Streifen zu der Lösungsmittelfront chelatisiert. Als Referenz wird die Verwendung von 64 CuCl2 beraten.

3. Hühnerovalbumin spezifische TH1 (COVA-TH1) Zellisolierung und Expansion

HINWEIS: Die Kultur von Th1 - Zellen ist beschrieben gemäß zuvor veröffentlichten Studien 16, 17.

  1. Isolieren Milzen und extraperitoneal Lymphknoten (LK) von DO11.10 - Mäusen.
    1. Opfern, um die Maus nach Bundesvorschriften. Desinfizieren des Tieres mit 70% Ethanol und fixieren es mit einem Klebeband für die Entfernung der Milz und LNs. Machen Sie einen Medianschnitt und trennen die Haut vor dem Peritoneum durch seitlich es an jedem Standort zu ziehen.
    2. Suchen Sie den Gebärmutterhals, axial, brachial und Leisten LNs. Entferne sie mit stumpfer Pinzette und legen sie in 1% fötales Kälberserum (FCS) / PBS-Puffer.
    3. Öffnen Sie das Peritoneum und suchen Sie die Milz. Trennt die Milz aus der Bauchspeicheldrüse und das Bindegewebe und sie in 1% FCS / PBS-Puffer. Für weitere Hinweise siehe Referenzen 20,21.
  2. Mince Milz und LNs durch ein 40 um-Filter in ein 50 ml Schraubdeckel Rohr des Kolbens einer Spritze. Spülen der Filter mit 10 ml 1% FCS / PBS-Puffer.
  3. Zentrifuge bei 400 × g für 5 min und entfernen Sie den Überstand. SubsequenTLY, durch Zugabe von Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Lysispuffer (1,5 ml pro Spendertier) für 5 min bei Raumtemperatur Lyse der Erythrozyten durchzuführen. 8.5 ml 1% FCS / PBS-Puffer (pro Spendertier).
  4. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 xg für 5 min und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die Zellen in 10 ml 1% FCS / PBS-Puffer, Zentrifugieren bei 400 xg für 5 Minuten und der Überstand entfernt.
  5. Für die magnetische Zelltrennung, Resuspendieren der Zellen in 1% FCS / PBS-Puffer und fügen CD4 + Mikrobeads. Wenden Sie sich an die Anweisungen des Herstellers für das Puffervolumen und die Menge an CD4 + Mikrokügelchen zu verwenden.
  6. Inkubieren für 20 min bei 4 ° C. Dann werden 1% FCS hinzu / PBS-Puffer bis zu 50 ml, Zentrifugieren der Zellen bei 400 · g für 5 min, und den Überstand entfernen.
  7. Weiter mit CD4 + T - Zell - Isolierung unter Verwendung handelsüblicher magnetische Trennsäulen und einen jeweiligen Magnetständer nach dem Protokoll des Herstellers. Passen die eluierten CD4 + T - Zellen auf eine concentration von 10 6 Zellen / ml in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem FCS, 2,5% Penicillin / Streptomycin, 1% HEPES - Puffer, 1% MEM - Aminosäuren, 1% Natriumpyruvat und 0,2% 2-Mercaptoethanol und store sie bei 4 ° C.
  8. Sammeln Sie die Säulenentladung in einem 50 ml-Schraubdeckel Rohr Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) herzustellen. Zentrifugiere die Säulenentladung bei 400 xg für 5 Minuten und der Überstand entfernt.
  9. In 10 ug / ml anti-CD4 (Klon: GK1.5), 10 ug / ml anti-CD8 (Klon: 5367,2) und 10 ug / ml Maus-anti-Ratte-mAb (MAR18.5) und 1,5 ml Kaninchen-Komplement. bei 37 ° C für 45 min inkubieren.
  10. Zentrifugieren der Zellen bei 400 · g für 5 min, entfernen Sie den Überstand und 3 ml Medium. Bestrahlen der APCs auf einer γ-Strahlen oder Röntgenquelle mit 30 Gy insgesamt. Danach stellen Sie die APCs auf eine Konzentration von 5 x 10 6 Zellen / ml.
  11. Je 100 & mgr; l von CD4 + T - Zellen und 100 & mgr; l von APCs auf einem 96-Well - plate zusammen mit 10 ug / mL cOVA 323-339-Peptid, 10 & mgr; g / ml Anti-IL-4-mAb, 0,3 uM CPG1668-Oligonukleotiden und 5 U / ml IL-2.
  12. In 50 U / ml IL-2 jeden zweiten Tag. Nach 3 - 4 Tagen, Transfer der Zellen von 96-Well-Platten auf 24-Well-Platten. Kombinieren 3-5 Vertiefungen von der 96-Well-Platte in einer Vertiefung auf der Platte mit 24 Vertiefungen. Zugabe von 100 U / ml IL-2 enthaltenden Medium in einem 1: 1-Verhältnis.
  13. Nach weiteren 2-3 Tagen, übertragen die Zellen von der Platte mit 48 Vertiefungen zu 175 cm 2 Zellkulturflaschen (1 x 48-Well - Platte pro Kolben). Füllen Sie mit Medium in einem Verhältnis 1: 1. In 50 U / ml IL-2 jeden zweiten Tag.
  14. Aufgeteilt, die Zellen nach der Zelldichte und 50 U / ml IL-2 jeden zweiten Tag. Auf diese Weise Kultur die Zellen für weitere 10 Tage.

4. COVA-Th1-Zellen radioaktive Markierung

ANMERKUNG: Der 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb kultiviert wird COVA TH1-Zellen angewandt werden , die intrazelluläre radioaktive Markierung zu ermöglichen.

  1. Für Cova-TH1 cell radioaktive Markierung, zeichnet 37 MBq des radiomarkierten 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb in einer Spritze ohne Totvolumen einen Dosiskalibrator verwenden. 1 ml Kochsalzlösung eine 37 MBq / ml Lösung zu erhalten.
  2. Suspend COVA TH1-Zellen im Medium bei 2 x 10 6 Zellen / ml , und fügen in einer 48-Well - Platte in jede Vertiefung 0,5 ml der Zellsuspension.
  3. Fügen Sie 20 & mgr; l der frisch hergestellten 37 MBq / ml 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb - Lösung in jede Vertiefung der 48-Well - Platte. Das endgültige Verhältnis für die Markierung ist 0,7 MBq pro 10 6 Zellen in einem Volumen von 520 & mgr; L. Inkubieren bei 37 ° C und 7,5% CO 2 für 30 min.
  4. Nach der Inkubation resuspendieren sorgfältig die Zellen in jeder Vertiefung und übertragen die Zellsuspension aus der 48-Well-Platte in 50 ml einer Kappenschraube Rohr. Zur Minimierung des Zellverlustes, spülen Sie jede Vertiefung mit vorgewärmten Medium.
  5. Zentrifugierte die COVA TH1-Zellsuspension bei 400 xg für 5 Minuten, Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in 10 ml vorgewärmtem PBS. Entfernen eines einerliquot der Zellsuspension zur Zellzählung. Wiederholen Sie den Waschschritt.
  6. Count lebensfähige COVA TH1-Zellen in einer geeigneten Verdünnung mit Trypan-Blau-Färbung.
  7. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 5 × 10 7 Zellen / ml für die intraperitoneale (ip) Injektion von 10 7 Zellen in 200 & mgr; l PBS.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 4,3-4,5 COVA-TH1 - Zellen radioaktiv zu markieren mit Mengen an Aktivität zu erhöhen, beispielsweise 1,4 oder 2,1 MBq MBq pro 10 6 Zellen.
    1. Um die Zellen mit 1,4 MBq pro 10 6 Zellen radioaktive Markierung, verwendet werden 40 ul des 37 MBq / ml 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb - Lösung und 60 & mgr; l zum radioaktiven Markierung mit 2,1 MBq pro 10 6 Zellen. Führen Sie die Schritte 4,3-4,7 mit 0,7 MBq, 1,4 MBq und 2,1 MBq 64 Cu-PTSM aber die Beschriftungszeit auf 3 h für vergleichende Untersuchungen 17 erhöhen.
    2. Gehen Sie zu Schritt 5 die optimale Menge an Aktivität zu bestimmen.

5. In - vitro - Bewertung der Wirkung der radioaktiven Markierung auf Cova-Th1 - Zellen

HINWEIS: Die Charakterisierung der Einflüsse des radioaktiven Markers auf den TH1 - Zellen wird über Trypanblau-Ausschluss - Assay für die Lebensfähigkeit durchgeführt, IFN-y - ELISA zur Beurteilung Funktionalität und PE-Annexin V - Färbung für die Induktion der Apoptose 16, 17. Die Bestimmung der intrazellulären Aufnahme und dem Ausströmen von Radioaktivität wird ebenfalls weiter unten beschrieben. Als Vergleich, 64 Cu-PTSM-markierte COVA-TH1 - Zellen können auch verwendet werden.

  1. Wirkung auf die Lebensfähigkeit durch Trypanblau-Ausschluss
    1. Justieren mindestens 18 x 10 6 COVA-TH1 - Zellen radiomarkiert mit 0,7 MBq / 10 6 Zellen, 1,4 MBq / 10 6 Zellen und 2,1 MBq / 10 6 Zellen jeweils bis zu einer Konzentration von 2 x 10 6 Zellen / ml und führen Schritte 5.1. 2-5.1.7 Dosis für jede Aktivität. Verwenden Sie nicht-radioactive KJ1-26-mAb COVA-TH1-Zellen und unmarkierte COVA-TH1-Zellen als Kontrollen bezeichnet.
    2. Pipettieren von 1 ml der Zelllösung in 9 Vertiefungen einer 24-Well-Platte.
    3. Sammeln Sie den Inhalt von 3 Vertiefungen in 3 separaten 15 ml-Röhrchen mit Schraubverschluss, 3 h nach dem anfänglichen radioaktiven Markierung.
    4. Spülen Sie die nun leeren Vertiefungen mit vorgewärmtem Medium Zellverlust zu minimieren und um das Medium zu dem entsprechenden 15 mL hinzufügen Schraubdeckel Röhrchen aus Schritt 5.1.3.
    5. Zentrifugieren der 15 ml-Röhrchen bei 400 xg für 5 Minuten und Resuspendieren des resultierenden Zellpellets in 1 ml vorgewärmtes Medium.
    6. Zählen sowohl lebensfähigen und toten Zellen in Trypanblau getrennt für jede 15-ml-Röhrchen und berechnet den Prozentsatz von lebensfähigen Zellen.
    7. Wiederholen Sie die Schritte 5.1.3-5.1.6 24 und 48 h nach 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radioaktiver Markierung.
  2. Auswirkungen auf die Funktionalität , die durch IFN- & gamma; ELISA bestimmt
    HINWEIS: Um die Wirkung der 64 Cu-DOTA-KJ1 26-mAb radioaktiven Markierung auf IFN-γ productio zu beurteilenn als Marker für die Funktionalität, einen IFN-γ ELISA von einem kommerziellen Anbieter durchzuführen und 17 beziehen sich für weitere Einzelheiten Bezug zu nehmen.
    1. Disperse 10 5 lebensfähige Zellen in 100 ul Medium auf eine 96-Well - Platte, 3 h nach 64 Cu-DOTA-KJ1-26 radioaktive Markierung der COVA TH1-Zellen mit 0,7 MBq, 1,4 MBq oder 2,1 MBq. Verwenden unbeschriftet, nicht-radioaktive KJ1-26-mAb-markierte oder 64 Cu-PTSM-markierte COVA TH1-Zellen als die Kontrollen.
    2. Stimulieren IFN-γ - Produktion in 10 64 5 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-markierten COVA-TH1 - Zellen in 100 & mgr; L Medium , das mit 10 ug / ml Peptid COVA, 5 U / ml IL-2 und 5x10 5 APCs in 100 ul Medium für 24 h bei 37 ° C und 7,5% CO 2. Weitere Kontrollen können die anderen Bedingungen ohne Zugabe des COVA Peptid sein.
    3. Analysieren Sie den Überstand durch ELISA nach den Anweisungen des Herstellers.
    4. Wiederholen Sie Schritt 5.2.2. 5.2.3. 24 und 48 h nach dem Markierungsverfahren.
  3. Induktion der Apoptose durch PE-Annexin V - Färbung für die Durchflusszytometrie bestimmt
    ANMERKUNG: Um Apoptose - Induktion durch den 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radioaktiven Marker, mit einem im Handel erhältlichen Kits für die Durchflusszytometrie und Zellproben vorzubereiten gemäß den Anweisungen des Herstellers zu bewerten , bevor mit Annexin V für Phosphatidylserin exposition auf der Zellmembran Anfärben .
    1. Bei 3, 24 und 48 h nach 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radioaktiver Markierung der COVA-TH1 - Zellen, fleck Triplikaten mit mindestens 10 6 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-markierten COVA TH1-Zellen mit der Annexin V-Kit nach den Anweisungen des Herstellers und innerhalb der nächsten Stunde analysieren. Verwendung von nicht-radioaktiven KJ1-26-mAb-markierten, 64-PTSM Cu-markierten und unmarkierten COVA-TH1 - Zellen als Kontrollen. Siehe 17 für weitere Details verweisen.
  4. Uptake und Ausstrom
    HINWEIS: Die Aufnahme des 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb in die Zellen in einem Dosis-Kalibrator und der Efflux von Radioaktivität gemessen wird, in einem γ-counting Assay gemessen 0, 5, 24 und 48 h nach dem radioaktiven Markierung.
    1. Bereiten zehn γ-Zählröhrchen jeweils für 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-markierte COVA-TH1 - Zellen, den jeweiligen Überstand und den Waschschritt.
    2. 10 6 64 Cu Transfer-DOTA-KJ1-26-mAb-markierte COVA-TH1 - Zellen in 1 ml Medium in jedem der zehn γ-Zählröhrchen direkt nach dem radioaktiven Markierung. Für jeden der Zeitpunkt 5, 24 und 48 h nach dem radioaktiven Markierung, behalten mindestens 10 7 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-markierte COVA TH1-Zellen in Medium auf 24-well Zellkulturplatten in einem Inkubator bei 37 ° C und 7,5% CO 2.
    3. Zentrifugierte die γ-Zählröhrchen bei 400 xg für 5 min und den Überstand in zehn neue γ-Zählröhrchen.
    4. Wasche die Zellen einmal in 1 ml Medium des ungebundenen Fraktion von 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ein entfernend den Überstand in zehn neuen γ-Zählröhrchen sammeln.
    5. 1 ml neues Medium zu den COVA TH1-Zellen und bestimmen Sie den anfänglichen Aufnahmewert in einem Dosiskalibrator. Die Rohre können auch in einem Inkubator bei 37 ° C und 7,5% CO 2 aufbewahrt werden.
    6. Wiederholen Sie die Schritte nach 5.4.2 bis 5.4.5 5, 24 und 48 h und Messung alle Röhrchen in einem γ-Zähler nach dem Protokoll des Herstellers. Zur Korrektur für radioaktiven Zerfall und zur quantitativen Analyse, verwenden, um einen Standard mit einer definierten Dosis der Radioaktivität.

6. OVA-induzierten akuten Airway DTHR

HINWEIS: Die Migrationsdynamik und Homing - Muster von adoptiv übertragen und radiomarkierten Cova-TH1 - Zellen an dem Ort der Entzündung wird visualisiert und für Cova-induzierten Atemwegs-DTHR 16, 17 in einem Tiermodell quantifiziert werden.

  1. Injizieren 8 Wochen alte BALB / c - Mäuse ip mit einer Mischung aus 150 & mgr; l aluminum Gel / 50 & mgr; l COVA-Lösung (10 & mgr; g in 50 & mgr; l PBS), um die Mäuse zu immunisieren.
  2. Zwei Wochen nach der Immunisierung, betäubt die Mäuse mit 100 mg / kg Ketamin und 5 mg / kg Xylazin durch ip - Injektion. Legen Sie die Versuchsmäuse auf dem Rücken und pipettieren langsam 100 ug Cova, gelöst in 50 & mgr; l PBS in die Nase der Tiere. Die Tiere werden die Lösung tropfen einatmen.
  3. Wiederholen Sie nach 24 h. Für stärkere Atemwegs DTHR Induktionen, wiederholen Sie nach ca. 48 h.
  4. Um die spezifische Migration der übertragenen Cova-TH1-Zellen zu analysieren, induzieren Atemwegs-DTHR mit Truthahn-oder Fasanen-OVA als Kontrolle. Daher wiederholen Sie die Schritte 6,1-6,3 durch die jeweilige OVA-Protein verwendet wird.

7. In vivo - Bildgebung unter Verwendung von PET / CT

HINWEIS: In - vivo - Bildgebung von 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-markierten COVA-TH1 - Zellen in COVA-DTHR erkrankte Mäuse und Kontrolltiere demonstrieren den spezifischen homing und migration Dynamik der Cova-TH1-Zellen. Daher erfassen statischen PET-Scans und anatomische CT-Scans nacheinander 3, 24 und 48 h nach dem Zelltransfer adoptiven.

  1. Direkt nach dem radioaktiven Markierung, stellen die 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-markierten COVA-TH1 - Zellen auf 5 x 10 7 Zellen / ml für ip - Injektion von 10 7 Zellen in 200 & mgr; l.
  2. Unter Verwendung einer 1 ml Spritze und einer 30-Gauge - Nadel, zeichnen 200 & mgr; l des 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-markierten COVA TH1-Zellsuspension und injizieren die Zellen ip in die COVA-DTHR erkrankten Tieren zwischen der 4 und 5. Nippel. Um die gesamte injizierten Menge an Radioaktivität zu bestimmen, messen die Spritze in einem Dosis-Kalibrator vor und nach der Injektion.
  3. Anesthetize die Mäuse, 10 min vor der gewünschten Aufnahmezeit mit 1,5% Isofluran in 100% Sauerstoff (Strömungsrate: 0,7 l / min) in einem temperaturgesteuerten Anästhesie Kasten.
  4. In der Zwischenzeit Coausrichtung zu erleichternvon PET- und CT - Bildern während der Bildanalyse, fixieren Glaskapillaren 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb - Lösung oder freie 64 CuCl 2 -Lösung unter dem Maus - Bett enthalten.
    1. Daher wird eine Lösung von 0,37 MBq / ml herzustellen und Glaskapillaren mit einem Volumen von 10 ul dieser Lösung füllen. Da Zellen abgeleiteten Radioaktivität Signale von Natur aus schwach sind, keine hohen Mengen an Aktivität verwenden, um sicherzustellen, dass der Marker nicht mit Zellen abgeleiteten Signalen in Mäusen stören.
  5. Nach dem chirurgischen Toleranz zu erreichen, wie es durch den Verlust des Pedal Ziehreflexes des Hinterbeins angedeutet, übertragen Sie die Maus auf ein PET-CT-kompatible und Kleintierbett mit einem geeigneten Rohrsystem versehen Anästhesie aufrechtzuerhalten.
  6. Immobilisieren die Maus auf dem Kleintierbett Wattestäbchen und chirurgisches Klebeband. Bewerben Augensalbe Trocknen der Augen zu vermeiden.
  7. Übertragen Sie die Maus Bett auf den PET-Scanner, zentriert um das Sichtfeld mit einem focus auf der Lunge und erwerben ein 20 min statischen PET-Scan mit einem Energiefenster von 350-650 keV.
  8. Übertragen Sie die Maus Bett auf den CT-Scanner. Via Scout Ansicht, zentriert um das Sichtfeld auf der Lunge. Erwerb ein planar-CT-Bild über 360 Projektionen während einer 360 ° -Drehung in dem „step and Shoot“ Modus mit einer Belichtungszeit von 350 ms und Binning-Faktor 4.

8. Bildanalyse

  1. Rekonstruieren PET list-Modus-Daten, indem sie mit einer Pixelgröße von 75 um statistischen iterativ geordnete Teilmenge Erwartungsmaximierungs (OSEM) 2D-Algorithmus und CT-Scans in eine 3D-Bild angewandt wird.
  2. Für die Bild Coausrichtung in einer geeigneten Bildanalysesoftware (zB Inveon Forschung Arbeitsplatz oder Pmod), verwenden Sie die automatische Coausrichtung Tool. Wenn dies nicht gelingt, verwenden Sie die Glaskapillaren unter der Maus Bett als Anleitung, um die rekonstruierten PET und CT-Bilder räumlich in axialer, koronaler und sagittaler Ansicht zusammen zu registrieren.
  3. Korrigieren Sie die PET - Bilderfür radioaktiven Zerfalls des radioaktiven Zerfallsgesetz und die Halbwertszeit des Radionuklids 64 Cu bei 12,7 h verwendet wird . Für die Bildnormalisierungs Wählen eines Bildes (A) als Referenz und stellen die Intensität der Bilddarstellung in der jeweiligen Bildanalyse-Software.
    1. Unter Verwendung der eingestellten Werte nur für das Referenzbild (A), die injizierte Aktivität (A) und die injizierte Aktivität für die anderen Bilder (X), normalisieren die anderen Bilder nach der folgenden Gleichung: (injizierter Aktivität (X) / injizierten Aktivität ( A)) x Intensitätswerte (A).
  4. Zeichnen Sie 3D-Volumen von Interesse (VOI) auf dem normalisierten PET Signal des Lungen und perithymic LNs.
  5. Bestimmen , um den Prozentsatz der injizierten Dosis pro cm 3 (% ID / cm 3) unter Verwendung der folgenden Gleichung: (mittlere Aktivität in VOI / Aktivität in der Maus) x 100. Für weitere Hinweise zur Bildanalyse, siehe Referenzen 22, 23.

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Ergebnisse

Abbildung 1 fasst die Etikettierung von COVA TH1-Zellen mit dem 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb und der Versuchsplan für die in - vitro- und in - vivo - Studien in diesem Protokoll.

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Abbildung 1: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb Etikettiervorgang & Experimentelles Design. ...

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Diskussion

Dieses Protokoll stellt eine zuverlässige und einfache Methode zum stabilen Zellen für in vivo - Tracking von PET radioaktive Markierung. Unter Verwendung dieses Verfahrens COVA-TH1 - Zellen, isoliert und in vitro aus Spendermäusen erweitert, könnte mit 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb und dessen homing wurde in einem die pulmonalen und perithymic LNs als Gebiete von COVA Präsentation nachgeführt radiomarkiert wird COVA-induzierten akuten Atemweg DTHR.

Die Modifikation des ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Julia Mannheim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant sowie Natalie Altmeyer für die Unterstützung während der Experimente und Datenanalyse. Diese Arbeit wurde von der Werner Siemens-Stiftung, die DFG durch den SFB685 (Projekt B6) und Fortuné (2309-0-0) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
HCl, SuprapurMerck, Darmstadt, Deutschland1.00318<sup>64Cu Herstellung
Methanol, SuprapurMerck, Darmstadt, Deutschland1.0600764Cu Herstellung
Isopropanol, SuprapurMerck, Darmstadt, Deutschland1.010464Cu Herstellung
Pt/Ir (90/10) Platte& Ouml; gussaSonderanfertigung64Cu Herstellung
PEEK KammerWKLSonderanfertigung64Cu Produktion
64NiChemotrade64Cu Herstellung
Polygramm SIL G/UV 254 PlatteMacherey-Nagel80502164Cu Herstellung
Ionenaustausch Ionenaustausch SäuleBioRadAG1-X864Cu Herstellung
Festkörper-Target-System für PETtraceWKLcustomum made64Cu production
64Cu AufarbeitungsmodulWKLcustomum made64Cu Herstellung
DosiskalibratorCapintecCRC-25R
PETtrace ZyklotronGeneral Electric Medical Systems
DOTA-NHSMakrozyklikaB-280DOTA-Konjugation
Anti-cOVA-TCR-Antikörper (KJ1-26)Isoliert aus Hybridom-ZellkulturDOTA-Konjugation
Na2HPO4Sigma-Aldrich71633DOTA-Konjugation
H+ Chelex 100Sigma-AldrichC7901DOTA-Konjugation
Amicon Ultra-15 FiltereinheitMerck MilliporeUFC910008DOTA-Konjugation
Rotipuran ReinstwasserCarl RothHN68.3DOTA-Konjugation
AmmoniumacetatSigma-Aldrich32301DOTA-Konjugation
PBSUniversität TübingenDOTA-Konjugation
Micro Bio-spin P-6 SäuleBio-Rad Laboratories7326221DOTA-Konjugation
NatriumcitratSigma-Aldrich71497DOTA-Konjugation
Cyclone Plus PhosphorImager Perkin-ElmerL2250116DOTA-Konjugation
DMEMMerck Millipore102568Zutat für T-Zell-Medium 
FCSMerck MilliporeS0115/1004BInhaltsstoff für T-Zell-Medium
NatriumpyruvatMerck MilliporeL0473Inhaltsstoff für T-Zell-Medium 
MEM-AminosäurenMerck MilliporeK0293Inhaltsstoff für T-Zell-Medium 
HEPES Merck MilliporeL 1613Inhaltsstoff für T-Zell-Medium
  Penicillin/StreptomycinMerck MilliporeA2212Inhaltsstoff für T-Zell-Medium 
0,05 mM 2-β-MercaptoethanolSigma-AldrichM3148Inhaltsstoff für T-Zell-Medium 
DO11.10 MäuseInhouse-ZüchtungTH1 Zellkultur
DPBSGibco14190144TH1 Zellkultur
Zellsieb 40 µ M Corning352340TH1 Zellkultur
ACK Lysing BufferLonza10-548ETH1 Zellkultur
CD4 MicroBeads, MausMiltenyi Biotech130-097-145TH1 Zellkultur
QuadroMACS SeparatorMiltenyi Biotech130-090-976TH1 Zellkultur
LS SäuleMiltenyi Biotech130-042-401TH1 Zellkultur
Anti-CD4-Antikörper (Gk1.5)Isoliert aus Hybridom-ZellkulturTH1-Zellkultur-Anti-CD8-Antikörper
(5367.2)Isoliert aus Hybridom-ZellkulturTH1-Zellkultur
Anti-Ratten-Antikörper (MAR18.5)Isoliert aus Hybridom-ZellkulturTH1-Zellkultur
Kaninchen-Komplementär MAtebu-BioCL3221TH1-Zellkultur
Anti-IL-4 Antikörper (11B11)Isoliert aus einer Hybridom-ZellkulturTH1-Zellkultur
cOVA 323-339-peptid EMV-micro-collectionsSonderanfertigungTH1 Zellkultur
CPG1668-OligonukleotideEurofins MWG OperonSonderanfertigungTH1 Zellkultur
IL-2Novartis65483-116-07TH1 Zellkultur
96-Well-PlattenGreiner 655180TH1 Zellkultur
24-Well-PlattenGreiner 662160TH1
Zellkultur-ZellkulturflascheGreiner660175TH1-Zellkultur
48-Well-PlattenGreiner 677 180Zellmarkierung
Gammacell 1000Beste Theratronicsvia Anfrage 
Gulmay RT225Gulmayvia Anfrage 
TrypanblauMerck MilliporeL6323in vitro Auswertung
Maus IFN-& gamma ELISABD Biosciences558258in vitro Bewertung
PE Annexin V Apoptose-Nachweiskit BD Biosciences559763in vitro Bewertung
Röhrchen 5 mLSarstedt55.476in vitro Bewertung
Röhrchen mit rundem Boden BD Biosciences352008in vitro Auswertung
Wizard γ-counterPerkin-Elmer2480-0010in vitro Auswertung
ELISA Reader MultiscanEXThermo Fisher Scientific51118177in vitro Auswertung
MikroskopLeicavia Anfrage in vitro Auswertung
BD LSRII BD Biosciencesvia Anfrage in vitroAuswertung
BALB/c MäuseCharles River028in vivo Zelltransport
AluminiumgelServa Elektrophorese12261.01in vivo Zellhandel
XylazinBayer HealthCareBestellt via Universitätsklinikumin vivo Zellhandel
KetaminRatiopharmBestellt via Universitätsklinikin vivo Zelltransport
IsofluranCP-PharmaBestellt via Universitätsklinikumin vivo Zelltransport
30 G NadelBD Biosciences304000in vivo Zellhandel Spritze
BD Biosciences11612491in vivo Zelltransport
Kapillaren 10 & Mikro; LVWR612-2439
Inveon PET-ScannerSiemens Healthineersnicht mehr lieferbarin vivo Zellhandel, alternative Firmen: Bruker, Mediso 
Inveon SPECT/CT-ScannerSiemens Healthineersnicht mehr lieferbarin vivo Zellhandel
Inveon Research WorkplaceSiemens HealthineersBildanalyse, alternative Software: Pmod

Referenzen

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