Ein Rapid-Filtereinsatz-basierte 3D-Kultursystem für die primäre Prostata Zelldifferenzierung

Die Identifizierung und Nutzung von Krebstherapien, die auf Einzelpersonen personalisiert sind ein vorrangiges Ziel in der Krebsforschung. Kürzlich wurden neue Konzepte entwickelt, die in die Einrichtung von primären Zellkulturen für größere Leichtigkeit ermöglichen, möglicherweise Weisen sowohl die Identifizierung und Prüfung personalisierten Therapien bieten. Zum Beispiel kann der R-spondin Basis Prostata organoiden Ansatz ¹ für dreidimensionale (3D) Kultivierung von normalen und metastatischen Prostatakrebszellen in einer kommerziellen extrazellulären Matrix (beispielsweise Matrigel), während die Bedingter Reprogrammierung von Zellen (CRC) Verfahren an der Georgetown ^{2 entwickelt,} nutzt ³ weitere Standard - 2D - Kulturbedingungen. Insbesondere führen die Kombination aus einem Rho - Kinase - Inhibitor (Y-27632) und bestrahlten J2 Maus - Fibroblasten - Feeder - Zellen auf unbestimmte Zeit Kultivierung von Keratinozyten CRCs ^2. Die CRC-Methodik istextrem robust, mit primären Zelllinien erfolgreich etabliert und auf unbestimmte Zeit aus der Prostata und viele andere normalen und malignen epithelialen Geweben ³ gehalten. Wichtig ist, dass unsere CRC-Technologie für die schnelle Identifizierung der ursächlichen Basis für rezidivierende Atemwegs Papillomatose bei einem Patienten erlaubt, die eine Reihe von früheren medikamentösen Behandlungen versagt hatte. Darüber hinaus mit normalen und tumorabgeleiteten CRCs genehmigte die erfolgreiche Identifizierung eines FDA Droge, Vorinostat, wurde innerhalb von zwei Wochen nach der anfänglichen Gewebebiopsie gemacht. Der Patient wurde auf vorinostat platziert, in der erfolgreichen Behandlung ihrer Erkrankung ⁴ führt.

Die normale Prostata wird von Luminal, basal umfasste und den seltenen neuroendokrinen Zellen ^5. Luminalen Zellen bilden die säulen Epithelschicht der Drüse und drücken den Androgen-Rezeptor (AR), sowie andere luminalen Marker wie Zytokeratine 8 und 18 und Prostate-spezifischen Antigens (PSA) ^6. Im Gegensatz dazu sind die basale Zellen unterhalb der luminalen Schicht lokalisiert und Zytokeratin 5 und p63 exprimieren, aber geringe Mengen des AR ^5. Wir haben ^{7, 8, 9} und andere ¹⁰ haben erfolgreich Prostata CRCs in präklinischen mechanistischen Arzneimittelempfindlichkeit Untersuchungen verwendet. Wenn jedoch unter Standard - 2D - Gewebekulturbedingungen gezüchtet, versagen diese Zellen vollständig AR Signalisierung ¹⁰ zu beteiligen. Wichtig ist gesetzt, wenn sie unter die Nierenkapsel von immungeschwächten Mäusen, gewann die CRCs normalen Prostatadrüsen Architektur und Funktion anzeigt, dass Prostata CRCs ihre Abstammung Engagement beibehalten, wenn sie in einer permissiven Umgebung platziert. Die Entwicklung des Filtereinsatzes basierenden Zellkultur hier beschriebene System ermöglicht eine schnelle (2 Wochen) in vitro Differenzierung von Prostata CRCs als belegt by die erhöhte Expression des AR und AR Zielgene sowie verringerte Mengen an p63.

Die Filtereinsätze verwendet werden, enthalten Polycarbonatmembranen (Porengröße 0,4 & mgr; m), die die Kultivierung von Säugetierzellen zu unterstützen. Das System, wie entwickelt, macht Gebrauch von normalen und malignen Prostata CRCs, 6-Well-Kulturschalen und die Filtereinsätze. Zellkulturmedien bedingt durch J2 - Zellen ¹¹ ist in der unteren Kammer und der Prostata Differenzierungsmedien in der oberen Kammer angeordnet. Die hierin beschriebenen Techniken Prostata luminalen Zelldifferenzierung innerhalb einer 2-wöchigen Zeitraum, im Einklang mit den Zielen der personalisierten Medizin zu unterstützen. Es war auch zwingend notwendig, die Methoden zu entwickeln, die für die umfassende molekulare, genetische und zelluläre Profilierung der Kulturen ermöglichen. Ansätze zur Isolierung von DNA, RNA und Protein aus Zellen von der Filteroberfläche gelöst wurden für eine genaue Wiederholungsprobenverarbeitung entwickelt und rationalisiert. Finally, Einbettung zu ermöglichen, die Methode zum Entfernen des Filters erforderlich ist, Schneiden und für H & E, immunhistochemischen und Immunfluoreszenzfärbung wird vollständig beschrieben.

1. Aufbau des 3D-Zellkultur Insert System

1. Platzieren 2 Polycarbonat Zellkultureinsätze in einer umgekehrten Ausrichtung (Filterseite nach oben) nach unten in einer 6 - Well - Platte (1A).
2. Tragen Sie eine dünne Schicht von 0,1% Gelatine in Wasser auf die Unterseite des Einsatzes und erlauben (10-20 min) in einem biologischen Sicherheitsschrank trocknen Sterilität aufrecht zu erhalten.
3. Wiederholen Sie Schritt 1.2 zwei weitere Male für insgesamt 3-Anwendungen von 0,1% Gelatine auf die Einsätze.
   HINWEIS: Die Gelatinebeschichtung Grenze Diffusion zwischen den Kammern helfen.
4. Um die primäre CRCs von Standardkulturbedingungen sammeln, 5 ml PBS, die Kulturflasche zu waschen.
   1. Trypsinize die Zellen unter Verwendung von (1 ml für eine T-25 und 2 ml für eine T-75) 0,25% Trypsin-EDTA für 5 min bei 37 ° C. Klopfen Sie leicht auf die Seite des Kolbens in Verdrängen der Zellen zu unterstützen. Dann gehen die Trypsin Reaktion zu stoppen und die Zellen zu sammeln, indem 5 ml komplettem DMEM.
   2. Sammeln die Zellen in ein 15 ml Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 4 ° C und 188 xg und zählen eine automatisierte Zellzähler oder eine Zählkammer.
   3. Re-suspend 600.000 CRCs in 250 & mgr; l konditioniertes Medium (CM) und zu der richtig ausgerichtet (Filterseite nach unten) Kultureinsatz (Abbildung 1B). Dies wird bezeichnet als die innere Kammer.
      Anmerkung: CM ist F-Medien durch bestrahlte J2 - Zellen konditioniert und enthält 10 & mgr; m Y-27632 , wie vorstehend beschrieben , ^{7, 8, 9, 11.}
5. Bewerben 2 ml CM in die äußere Kammer des 6-Well-Platte und Inkubation über Nacht bei 37 ° C (für mindestens 18 h).
6. Entfernen Sie vorsichtig die CM auf der inneren Kammer mit einer 1 ml oder 200 & mgr; l-Pipette und langsam Differenzierungsmedium (DM) in die innere Kammer mit einer 1-ml-Pipette bis zur vollständigen hinzuzufügen. Seien Sie vorsichtig, um nicht die Zellschicht stören.

1. Überprüfen Sie jeden Tag die Kulturen. Gesunde Zellen erscheinen , wie in Abbildung 2 dargestellt.
2. Ändern des CM in der äußeren Kammer jeden Tag oder jeden zweiten Tag in Abhängigkeit vom Stoffwechsel der Zellen.
3. Wenn die Medien der inneren Kammer ändert sich die Farbe (gelb), sorgfältig die Medien auf der inneren Filterkammer zu entfernen mit einem 1 ml oder 200 & mgr; l-Pipette.
4. Saugen Sie das Medium in der Kammeraußen 6-Well-Platte mit einem saugenden Spitze.
5. Unter Verwendung einer 1 ml Pipette gelten langsam frisch DM in die innere Kammer bis zur vollständigen. Achten Sie darauf, nicht zu kratzen oder auf andere Weise die Zellschicht entfernen.
6. Ersetzen Sie die Medien in die äußere Kammer mit 2 ml frischem CM.
7. Pflegen die Kulturen für 2 Wochen und dann die Verarbeitung für die gewünschte Isolations bimolekularen fortzufahren.
   HINWEIS: Jede Zeile in der 6 - Well - Platte, insgesamt sechs Einsätze (Abbildung 1B), sollte pro Experiment verarbeitet werden , um genügend Zellen für die DN zu erwerbenA, RNA oder Protein, für die Analyse.
8. Aspirat Medien in der äußeren Kammer und Spülen mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
9. Sorgfältig Medien aus der inneren Kammer mit einer 1 ml Pipette oder 200 & mgr; l zu entfernen und 500 & mgr; l PBS hinzu. Vermeiden Abkratzen oder anderweitig stören die Zellen auf der Membran.
10. Aspirat PBS von der äußeren Kammer und vorsichtig PBS aus der inneren Kammer mit einer 1 ml oder 200 & mgr; l-Pipette entfernen. Sobald die PBS entfernt wurde, gehen direkt an die entsprechende Anwendung weiter unten beschrieben. Nicht in die Membran austrocknen. Die Kultur kann kurz in der PBS gehalten werden, bis die Anwendung bereit ist, zu beginnen.

3. Die Verarbeitung der Filter für die Pellet-Banking

1. Füge 100 & mgr; l 0,25% Trypsin-EDTA zu jeder Innenkammer und Inkubieren bei 37 ° C für 5 min.
2. Kurz und vorsichtig rühren / kratzen die Zellen auf der Membranoberfläche mit einer 200 & mgr; l Pipette beim Pipettieren nach oben und unten (vermeiden puncTuring die Membran). Inkubieren für 1 min bei 37 ° C.
3. Fügen Sie 250 ul von CM zu der ersten inneren Kammer und Pipette nach oben und unten vorsichtig den Filter zu spülen.
4. Transfer-Zellen zu der benachbarten Filterkammer resuspendiert, die dieselben Medienbedingungen enthält und wiederholen Auf- und Abpipettieren.
5. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden der Einsätze aus einem einzigen Zustand. Sammeln und zu transferieren Zellen in ein 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen.
6. Spülen jede innere Kammer mit einer zusätzlichen 100-200 uL CM alle verbleibenden Zellen zu sammeln. In den 1,5 ml Zentrifugenröhrchen in Schritt 3.5.
7. Dreh die Zellen bei 423 · g in einer Mikrozentrifuge bei 4 ° C für 5 min.
8. Den Überstand aspirieren und waschen einmal das Zellpellet mit 1000 ul PBS.
9. Spin wieder bei 423 xg in einer Mikrozentrifuge bei 4 ° C für 5 min.
10. Absaugen PBS und Einfrieren bei -80 ° C für die spätere Verwendung.

4. Die Verarbeitung der Filter für die RNA oder DNA-Isolierung

Der Zellkultureinsatz basiertes System ist ein relativ einfaches und schnelles Verfahren für die 3D-Kulturen von Prostata-CRCs produzieren, die luminale Zelldifferenzierung unterstützt. Eine schematische Darstellung des Systems gezeigt (Abbildung 1A) , die Anwendung der Gelatinebeschichtung an der unteren Oberfläche des Filtereinsatzes hervorhebt. Die Einsätze sind nur für die Anwendung der Gelatine umgeworfen. In 1B sind die Filter in der geeigneten Orientierung für die Kultivierung. Mit Hilfe einer transparenten Zelle einfügen, ein repräsentatives Bild einer gesunden Prostata 3D CRC Kultur gezeigt (10X) (Abbildung 2). Die dichte Schichtung von gesunden CRCs gezeigt ist typisch nach Einrichtung und können mit Standard-Lichtmikroskopie sichtbar gemacht werden. Während der anfänglichen Einrichtung, ist es entscheidend, um die Schicht von Zellen, um sicherzustellen, gebildet zu visualisieren, dass das Verfahren mit einer bestimmten Zelllinie kompatibel ist und dass geeignete Befestigung und laYering von Zellen aufgetreten sind.

HEA ist an der Innenseite des Einsatzes aufgebracht, wie oben beschrieben. Nach dem Aufbringen der HEA muss darauf geachtet werden , wenn die Filter scoring es aus dem Einsatz (3A, 3B) zu entfernen. In allen Schritten (3A-3D), muss darauf geachtet werden auch auf dem Filter mit Zellen zu minimieren unnötige Bewegung der HEA Schicht ausgeübt werden. Die CRC - Schicht kann leicht während der Übertragung auf die H & E - Kassette (3D) gestört und beschädigt werden. Nach Exzision des HEA beschichtete Filter aus dem Kunststoffgehäuse (3A-3C), kann der Filter halbiert und zur Sektionierung und Färbung unter Verwendung von Standardeinbettungs Kassetten (3D) verarbeitet werden. den Filter in zwei Hälften teilt ist wichtig, die zur Verfügung stehende Fläche für Querschliff auf H & E und IF zu maximieren.

Immunofluoreszenzfärbungsowie Hellfeld (BF) Bilder der kultivierten Zellen auf der Filterschicht wurden unter Verwendung eines Mikroskops mit DSU (Disk Scan Unit) Drehscheiben-konfokale Fähigkeiten gesammelt. Repräsentative Ergebnisse für die Histologie und H & E - Färbung sind in einem Querschnitt des Filtereinsatzes und Zellen (20X) (Figur 4) gezeigt ist . Mit der richtigen Pflege, zeigen wir, dass eine CRC-Schicht auf den Filtereinsätze geschnitten werden kann und fleckig, wie gängige Praxis für die Gewebe Histologie. Während des Schneidens ist es möglich , dass die CRCs aus dem Filter als intakte Schicht aus Zellen abgelöst zu werden , wie gezeigt (Figur 4). Das BF Bild zeigt mehrschichtige Zellschichten auf der Oberseite der porösen Membran (5A). Die einzelnen Fluoreszenzbilder für Kerne (DAPI, 5B), p63 (Figur 5C) und die AR (5D) gezeigt, wie die Zusammenführung aller drei Fluoreszenzmarker (5E). Schließlich ist ein composite BF und IF - Overlay (5f Bild) gezeigt wird , die Lokalisation des Fluoreszenzsignals relativ zu den Zellen und dem Filter herzustellen. Die Überlagerung der DAPI-Färbung mit dem p63 IF-Färbung zeigt deutlich einige Zellen noch in einem proliferativen Zustand. Die Lokalisierung von AR IF-Färbung im Zellkern ist ein Hinweis auf funktionelle Reaktivierung von AR in Prostatazellen.

Ein Vergleich zwischen der IF unserer Filtereinsatz System und einem Prostatagewebe geschnitten dargestellt (6A, 6B) , um die Ähnlichkeit in der Entwicklung unserer CRC Einsatzschicht zu der des Prostata - Epithel zu demonstrieren. Die Prostata Kanal zeigt die Expression von p63, im Einklang mit der Prostata basalen Zellen. p63-Färbung wird auch in den CRCs an dem Einsatz gesehen. Eine höhere p63 Prozentsatz Zellen exprimiert, wurde in unserem Einsatz im Vergleich zum intakten Gewebeschnitt beobachtet. Darüber hinaus sind sowohl Kern- und cytoplasmatische AR sind in der Prostata tis gesehen Abschnitt klagen und während die CRCs auf dem Filtereinsatz zeigen insgesamt weniger AR Ausdruck, sowohl nukleare als AR-Expression und zytoplasmatische Färbung ist zu sehen, ähnlich wie bei der intakten Prostata.

Abbildung 1: Repräsentative Bilder der 6-Well - Kulturschale und einfügen, um das 3D Culture System enthalten. (A) Inverted Einsätze zum Aufbringen der Gelatinebeschichtung auf die Unterseite des Filters (Pfeil). Ein größeres Bild des Einsatzes und Filter zeigen (kleines Bild). (B) richtig platziert Einsätze. Die inneren und äußeren Kammern des Systems gezeigt sind (Pfeile). Die boxed Reihe in B zeigt, wie mehrere Proben werden für einen bestimmten experimentellen Bedingungen erhalten. Am Ende der 2 Wochen Wachstumszeit diese Einsätze können gebündelt werden, um ausreichend Material für die Analyse zu erhalten."Target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: ein repräsentatives Bild von einer Schicht von gesunden CRCs Gesetzt auf eine transparente Filter Membrane gezeigt. Inneren und äußeren Kammern enthaltenen konditionierten Medien. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: ein repräsentatives Bild eines Filters Halbierte in zwei Abschnitte und in eine Paraffin Kassette für Embedding. (A) Filtereinsatz mit HEA Beschichtung nach dem Ritzen und vor dem Entfernen. (B) Das freigesetzte Filtereinsatz aus dem Polycarbonat barrel. ( (D) Die richtige Platzierung und Ausrichtung der beiden Hälften in der Einbettungskassette. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: Eine repräsentative H & E Stained Querschnitt des Filtereinsatzes und Zellen (20X). Sowohl die Membran (unten) und Zellschicht (oben) gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5: Eine Reihe von repräsentativen Hellfeld (BF) und Immunfluoreszenz (IF) BilderDie Zellen Teilte auf dem Filter (40X). Querschnitte der Filter und Zellen gezeigt. Eine ungefärbte BF Bild der Zellen auf der Filteroberfläche (5A) von Bildern für das DAPI gefärbt Kern (5B) und Immunfluoreszenzfärbung für zwei verschiedene Proteine, p63 (5C) und dem Androgen Rezeptor (AR, 5D) begleitet. Eine zusammengesetzte Überlagerung der Zellabschnitte (5E, F) definiert Lokalisierung der ZF - Signale im Zusammenhang mit den Zellen und Filter. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6: Eine repräsentative Immunfluoreszenz (IF) Bild von Zellen auf dem Filter im Vergleich zu einem Abschnitt von Prostata - Epithel von Gewebeteilte (20X).Ein Querschnittsbild der Filtereinsatz gezeigt (6A) im Vergleich zu den duktalen Epithel - Schichten einer intakten Prostata (6B). Die Färbung von p63, die AR und der Kern wurde wie in Figur 5 durchgeführt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.