Ein Rapid-Filtereinsatz-basierte 3D-Kultursystem für die primäre Prostata Zelldifferenzierung

Das übergeordnete Ziel dieses auf Filtereinsätzen basierenden 3D-Kultursystems für patientengewonnene Primärzellen ist es, ein biologisch relevanteres in vitro Modellsystem für die Prostatakrebsforschung zu etablieren. Durch die Verwendung primärer humaner Zellen kann diese Methode helfen, Schlüsselfragen in der Entwicklungsbiologie der Prostata sowie bei Prostatakrebs zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine relativ schnelle In-vitro-Methode zur Etablierung differenzierter primärer Prostatazellen handelt, die auch die schnelle Isolierung von Biomolekülen wie RNA, DNA und Protein ermöglicht.

visuelle Demonstration dieser Methoden ist von entscheidender Bedeutung, da die Verarbeitung von Zellen auf dem Filtereinsatz für die Histologie oder für die RNA- und Proteinsammlung heikel und zeitkritisch ist. Um die Diffusion zwischen den Kammern in einer biologischen Sicherheitswerkbank zu begrenzen, tragen Sie eine dünne Schicht 0,1 % Gelatine auf die Unterseite der Einsätze auf und lassen Sie sie trocknen. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch zwei weitere Male.

Geben Sie dann die Zellen in die innere Kammer der mit Gelatine überzogenen Einsätze und kultivieren Sie sie bis zu zwei Wochen lang. Nach zwei Wochen wenden Sie die kultivierten Filtereinsätze direkt auf eine der entsprechenden nachgelagerten Anwendungen an, die im Folgenden beschrieben werden. Um diesen Vorgang zu starten, aspirieren Sie PBS aus der äußeren Kammer und entfernen Sie vorsichtig PBS aus der inneren Kammer.

Die kultivierten Inserts können kurz in PBS aufbewahrt werden, bis die Anwendung beginnen kann, lassen Sie die Membran jedoch nicht austrocknen. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter 0,25% Trypsin EDTA in jede innere Kammer. Dann inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Kratzen Sie anschließend mit einer 200-Mikroliter-Pipette kurz und vorsichtig die Zellen auf der Membranoberfläche ab, während Sie auf und ab pipettieren. Dann inkubieren Sie sie eine Minute lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie nach einer Minute 250 Mikroliter konditioniertes Medium in die erste Innenkammer und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um den Filter zu spülen.

Anschließend werden die resuspendierten Zellen in die benachbarte Filterkammer mit den gleichen Medienbedingungen übertragen und das Auf- und Abpipettieren wiederholt. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Einfügung einer einzelnen Bedingung. Sammeln Sie dann die Zellen und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Spülen Sie jede Innenkammer mit weiteren 100 bis 200 Mikrolitern konditioniertem Medium, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln und in das 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu geben. Anschließend drehen Sie die Zellen in einer Mikrozentrifuge bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Anschließend wird der Überstand abgesaugt und das Zellpellet einmal mit 1.000 Mikrolitern PBS gewaschen.

Schleudern Sie die Zellen erneut in einer Mikrozentrifuge bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Nach fünf Minuten aspirieren Sie das PBS und frieren die Probe bei minus 80 Grad Celsius für die spätere Verwendung ein. Bei diesem Verfahren werden 200 Mikroliter Guanidiniumthiocyanat, Phenol, Chloroform oder ein ähnliches Extraktionsreagenz in die innere Kammer gegeben und die Zellen auf der Membranoberfläche durch Auf- und Abpipettieren kurz gerührt.

Dann inkubieren Sie die Zellen im Extraktionsreagenz fünf Minuten lang bei Raumtemperatur und lassen Sie die äußere Kammer trocknen. Waschen Sie anschließend die Filtermembran, indem Sie die Extraktionslösung auf und ab pipettieren. Sammeln Sie so viel Extraktionsreagenz wie möglich, indem Sie die Sechs-Well-Platte kippen und die Restflüssigkeit ansaugen.

Bitte beachten Sie, dass sich der Filter vom Einsatz lösen kann. Waschen Sie die dissoziierte Filtermembran, falls angebracht. Sammeln Sie dann so viel Extraktionsreagenz wie möglich und befolgen Sie das Protokoll des Herstellers für die Reinigung und Rückgewinnung von DNA, RNA oder Protein.

Beim Waschen der Zellen und des Filters mit Guanidiniumthiocyanat ist Vorsicht geboten, da übermäßiges Rühren zu RNA von schlechter Qualität führen kann. Um das Protein aus dem Filtereinsatz zu isolieren, legen Sie den Filtereinsatz in die Sechs-Well-Platte auf Eis. Geben Sie dann 10 Mikroliter Proteinlysepuffer in die innere Kammer.

Rühren und kratzen Sie die Zellen mit einer 20-Mikroliter-Pipette auf der Membranoberfläche, während Sie auf und ab pipettieren und vermeiden Sie die Bildung von Blasen im Lysepuffer. Inkubieren Sie anschließend die Sechs-Well-Platte mit Filtereinsätzen zehn Minuten lang auf Eis. Wiederholen Sie das Schaben und spülen Sie dann die Membranoberfläche mit dem Lysepuffer ab.

Sammeln Sie die Lysate von den sechs Einsätzen und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf Eis. Spülen Sie anschließend die erste Membran mit weiteren 10 Mikrolitern Lysepuffer und übertragen Sie sie in den nächsten Filter. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Einsätze einer bestimmten Versuchsbedingung, sammeln Sie die restliche Lysepufferlösung und geben Sie sie in das 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Inkubieren Sie die Probe weitere fünf Minuten auf Eis. Dann drehen Sie es 15 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit bei vier Grad Celsius. Wenn dies erledigt ist, pipettieren Sie das Lysat in ein frisches 1,5-Millimeter-Röhrchen.

Fahren Sie dann mit der Analyse der Proteinkonzentration fort oder lagern Sie die Lysate bei minus 80 Grad Celsius. Bei diesem Verfahren werden 500 Mikroliter bzw. ein Milliliter 10%NBF in die innere bzw. äußere Kammer gegeben. Inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius.

Am nächsten Tag aspirieren Sie NBF aus der äußeren Kammer und geben Sie einen Milliliter HEA-Prozessgel in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Schmelzen Sie die Agarose langsam in einer Mikrowelle mit geringer Leistung und wiederholten 10-Sekunden-Impulsen, bis die Agarose geschmolzen ist. Bewahren Sie den HEA in einem 37 Grad Celsius warmen Bad auf, um eine Verfestigung zu verhindern, bis er gebrauchsfertig ist.

Entfernen Sie anschließend NBF aus der inneren Kammer. Tragen Sie 25 Mikroliter geschmolzenes HEA auf die innere Kammer auf und lassen Sie die Agarose zwei bis fünf Minuten lang erstarren. Befeuchten Sie dann zwei Schaumstoff-Histologiepads mit 10% NBF und legen Sie ein Pad in eine Einbettkassette.

Die Sicherung der Integrität der Zellschichten auf dem Filtereinsatz mit HistoGel ist ein entscheidender Schritt für die Konservierung der intakten Zellschicht für die histologische Schnitte. Verwenden Sie danach ein Skalpell mit der Klinge Nummer 11, um den Filter von der Unterseite der Kunststoffeinsatzkammer zu kratzen und ihn teilweise zu lösen. Geben Sie 100-200 Mikroliter NBF in eine Petrischale und tauchen Sie den teilweise gelösten Filter in den NBF.

Drücken Sie mit einem Skalpell mit der Klinge Nummer 10 vorsichtig von der Innenseite der Einsatzkammer gegen die Mitte des Filters, um den Filter vollständig aus dem Einsatzzylinder zu lösen. Wenn noch ein Teil des Filters am Zylinder befestigt ist, trennen Sie ihn mit dem Skalpell. Schneiden Sie anschließend den HEA-beschichteten Filter in zwei Hälften.

Legen Sie jede Hälfte des Filters auf das Schaumstoffpolster in der vorbereiteten Histologiekassette. Geben Sie dann den zweiten 10%NBF getränkten Schwamm in die Kassette und legen Sie den Filter in ein Sandwich. Verschließen Sie anschließend die Kassette.

Legen Sie es in NBF und inkubieren Sie es über Nacht. Dieses Hellfeldbild zeigt mehrschichtige Zellschichten auf der porösen Membran. Gezeigt werden die einzelnen Fluoreszenzbilder für die Zellkerne, P63 und den Androgenrezeptor sowie die Verschmelzung aller drei Fluoreszenzmarker.

Schließlich wird ein zusammengesetztes Hellfeld- und Immunfluoreszenz-Overlay gezeigt, das die Lokalisierung des Fluoreszenzsignals relativ zu den Zellen und dem Filter festlegt. Hier wird ein Schnittbild unseres Filtereinsatzes gezeigt, verglichen mit den duktalen Epithelschichten einer intakten Prostata. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in zwei Wochen durchgeführt werden, wobei eine abschließende Isolierung der Zellen und des Filtereinsatzes oder des gewünschten Biomoleküls weniger als 30 Minuten dauert, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, immer daran zu denken, bei der Arbeit mit den Filtereinsätzen Vorsicht walten zu lassen, damit keine Beschädigung der Zellschicht oder des darunterliegenden Filters auftritt. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Western Blots, RNA-Microarrays und Proteomanalysen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Signalweganalyse und zur Krebszellanalyse zu beantworten. Diese Technik wird dazu beitragen, Forschern auf dem Gebiet des Prostatakrebses den Weg zu ebnen, um die Biologie der Prostata sowie die Grundlagen von Prostatakrebs anhand von primären Prostatazellen besser zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein hervorragendes Verständnis dafür haben, wie Sie kultivierte primäre Prostatazellen aus diesem 3D-Kultursystem richtig einrichten und gewinnen.