Name: Ein Rapid-Filtereinsatz-basierte 3D-Kultursystem für die primäre Prostata Zelldifferenzierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Erfahren Sie ein schnelles 3D-Kultursystem mit Filtereinsätzen für die Differenzierung primärer Prostatazellen. Diese Methode ermöglicht die effiziente Isolierung von Biomolekülen wie RNA, DNA und Protein für die Krebsforschung.

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Diese Forschung wurde von T32 (CA 9686-18) und TL1 (TL1TR001431) Postdoc-Stipendium Auszeichnungen (LT), DOD PC140268 (CA) unterstützt, W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA) sowie U01 PAR-12-095 (Kumar) und P30 CA051008-21 (Weiner). Beispiel Fixierung, Schneiden und Färben wurde in der Lombardi Comprehensive Cancer Center Histologie und Tissue Shared Resource ausgeführt. Wir danken Richard Schlegel für hilfreiche Diskussionen. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Position des National Cancer Institute oder dem National Institutes of Health vertreten.

1. Aufbau des 3D-Zellkultur Insert System <ol><li> Platzieren 2 Polycarbonat Zellkultureinsätze in einer umgekehrten Ausrichtung (Filterseite nach oben) nach unten in einer 6 - Well - Platte (1A). </li><li> Tragen Sie eine dünne Schicht von 0,1% Gelatine in Wasser auf die Unterseite des Einsatzes und erlauben (10-20 min) in einem biologischen Sicherheitsschrank trocknen Sterilität aufrecht zu erhalten. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.2 zwei weitere Male für insgesamt 3-Anwendungen von 0,1% Gelatine auf die Einsätze. HINWEIS: Die Gelatinebeschichtung Grenze Diffusion zwischen den Kammern helfen. </li><li> Um die primäre CRCs von Standardkulturbedingungen sammeln, 5 ml PBS, die Kulturflasche zu waschen. <ol><li> Trypsinize die Zellen unter Verwendung von (1 ml für eine T-25 und 2 ml für eine T-75) 0,25% Trypsin-EDTA für 5 min bei 37 ° C. Klopfen Sie leicht auf die Seite des Kolbens in Verdrängen der Zellen zu unterstützen. Dann gehen die Trypsin Reaktion zu stoppen und die Zellen zu sammeln, indem 5 ml komplettem DMEM. </li><li> Sammeln<html> die Zellen in ein 15 ml Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 4 ° C und 188 xg und zählen eine automatisierte Zellzähler oder eine Zählkammer. </li><li> Re-suspend 600.000 CRCs in 250 &amp; mgr; l konditioniertes Medium (CM) und zu der richtig ausgerichtet (Filterseite nach unten) Kultureinsatz (Abbildung 1B). Dies wird bezeichnet als die innere Kammer. Anmerkung: CM ist F-Medien durch bestrahlte J2 - Zellen konditioniert und enthält 10 &amp; mgr; m Y-27632 , wie vorstehend beschrieben , 7, 8, 9, 11. </li></ol></li><li> Bewerben 2 ml CM in die äußere Kammer des 6-Well-Platte und Inkubation über Nacht bei 37 ° C (für mindestens 18 h). </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die CM auf der inneren Kammer mit einer 1 ml oder 200 &amp; mgr; l-Pipette und langsam Differenzierungsmedium (DM) in die innere Kammer mit einer 1-ml-Pipette bis zur vollständigen hinzuzufügen. Seien Sie vorsichtig, um nicht die Zellschicht stören. </li></ol>le &quot;&gt; 2. Wartung von 3D-Kulturen <ol><li> Überprüfen Sie jeden Tag die Kulturen. Gesunde Zellen erscheinen , wie in Abbildung 2 dargestellt. </li><li> Ändern des CM in der äußeren Kammer jeden Tag oder jeden zweiten Tag in Abhängigkeit vom Stoffwechsel der Zellen. </li><li> Wenn die Medien der inneren Kammer ändert sich die Farbe (gelb), sorgfältig die Medien auf der inneren Filterkammer zu entfernen mit einem 1 ml oder 200 &amp; mgr; l-Pipette. </li><li> Saugen Sie das Medium in der Kammeraußen 6-Well-Platte mit einem saugenden Spitze. </li><li> Unter Verwendung einer 1 ml Pipette gelten langsam frisch DM in die innere Kammer bis zur vollständigen. Achten Sie darauf, nicht zu kratzen oder auf andere Weise die Zellschicht entfernen. </li><li> Ersetzen Sie die Medien in die äußere Kammer mit 2 ml frischem CM. </li><li> Pflegen die Kulturen für 2 Wochen und dann die Verarbeitung für die gewünschte Isolations bimolekularen fortzufahren. HINWEIS: Jede Zeile in der 6 - Well - Platte, insgesamt sechs Einsätze (Abbildung 1B), sollte pro Experiment verarbeitet werden , um genügend Zellen für die DN zu erwerbenA, RNA oder Protein, für die Analyse. </li><li> Aspirat Medien in der äußeren Kammer und Spülen mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Sorgfältig Medien aus der inneren Kammer mit einer 1 ml Pipette oder 200 &amp; mgr; l zu entfernen und 500 &amp; mgr; l PBS hinzu. Vermeiden Abkratzen oder anderweitig stören die Zellen auf der Membran. </li><li> Aspirat PBS von der äußeren Kammer und vorsichtig PBS aus der inneren Kammer mit einer 1 ml oder 200 &amp; mgr; l-Pipette entfernen. Sobald die PBS entfernt wurde, gehen direkt an die entsprechende Anwendung weiter unten beschrieben. Nicht in die Membran austrocknen. Die Kultur kann kurz in der PBS gehalten werden, bis die Anwendung bereit ist, zu beginnen. </li></ol> 3. Die Verarbeitung der Filter für die Pellet-Banking <ol><li> Füge 100 &amp; mgr; l 0,25% Trypsin-EDTA zu jeder Innenkammer und Inkubieren bei 37 ° C für 5 min. </li><li> Kurz und vorsichtig rühren / kratzen die Zellen auf der Membranoberfläche mit einer 200 &amp; mgr; l Pipette beim Pipettieren nach oben und unten (vermeiden puncTuring die Membran). Inkubieren für 1 min bei 37 ° C. </li><li> Fügen Sie 250 ul von CM zu der ersten inneren Kammer und Pipette nach oben und unten vorsichtig den Filter zu spülen. </li><li> Transfer-Zellen zu der benachbarten Filterkammer resuspendiert, die dieselben Medienbedingungen enthält und wiederholen Auf- und Abpipettieren. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden der Einsätze aus einem einzigen Zustand. Sammeln und zu transferieren Zellen in ein 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Spülen jede innere Kammer mit einer zusätzlichen 100-200 uL CM alle verbleibenden Zellen zu sammeln. In den 1,5 ml Zentrifugenröhrchen in Schritt 3.5. </li><li> Dreh die Zellen bei 423 · g in einer Mikrozentrifuge bei 4 ° C für 5 min. </li><li> Den Überstand aspirieren und waschen einmal das Zellpellet mit 1000 ul PBS. </li><li> Spin wieder bei 423 xg in einer Mikrozentrifuge bei 4 ° C für 5 min. </li><li> Absaugen PBS und Einfrieren bei -80 ° C für die spätere Verwendung. </li></ol> 4. Die Verarbeitung der Filter für die RNA oder DNA-Isolierung <ol&gt; <li> Mit 200 &amp; mgr; l Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform oder ähnlichen Extraktionsreagens zu der inneren Kammer und kurz auf die Zellen auf der Membranoberfläche agitieren durch Auf- und Abpipettieren. </li><li> Inkubieren in dem Extraktionsreagenz für 5 min bei Raumtemperatur mit der äußeren Kammer trocken. <ol><li> Da der Filter aus dem Einsatz distanzieren kann, waschen Sie die distanzierte Filtermembran durch Auf- und Abpipettieren der Extraktionslösung. Sammeln Sie so viel des Extraktionsreagenz wie möglich durch die 6-Well-Platte Kippen und Restflüssigkeit abgesaugt. </li></ol></li><li> Folge dem Protokoll des Herstellers zur Reinigung und Rückgewinnung von DNA, RNA oder Protein. </li></ol> 5. Die Verarbeitung der Filter für die Proteinisolierung <ol><li> Setzen Sie den Filtereinsatz in der 6-Well-Platte auf Eis. Zu der inneren Kammer, mit 10 ul Puffer Protein Lyse, supplementiert mit 1 mM Natriumfluorid (NaF), 1 mM Natriumvanadat (NaV), 100 mM dithiothreITOL (DTT) und 100 &amp; mgr; l anti-Protease-Cocktail. </li><li> Rühre / kratzen die Zellen auf der Membranoberfläche mit einer Pipette 20 ul beim Pipettieren nach oben und unten. Vermeiden Blasen in dem Lysepuffer erzeugen. </li><li> Inkubieren Sie die 6-Well-Platte mit Filtereinsätzen auf Eis für 10 min. </li><li> Wiederholen Sie kratzen und dann spülen Sie die Membranoberfläche mit dem Lysepuffer. </li><li> Sammeln Sie die Lysate aus den 6-Einsätze und Transfer in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis. </li><li> Spülen der ersten Membran mit zusätzlichen 10 &amp; mgr; l Lysepuffer und Transfer zum nächsten Filter. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5.6 für alle Einsätze, restliche Lyse-Pufferlösung zu sammeln und zu der 1,5 ml-Röhrchen (Schritt 5.5). </li><li> Inkubieren Sie die Probe auf Eis für weitere 5 min. </li><li> Spin bei maximaler Geschwindigkeit (16.873 xg in einer Tischzentrifuge) für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Pipette Lysatüberstand in ein frisches 1,5 ml-Röhrchen. </li><li> Fahren Sie mit der Analyse der Proteinkonzentration oder store Lysate bei -80 ° C. </li></ol> 6. Verarbeitung für H &amp; E und Immuno-Färbung <ol><li> Fügen 500 ul und 1 ml 10% NBF (neutral gepuffertes Formalin) zu der inneren und der äußeren Kammer und ließ über Nacht bei 4 ° C inkubieren. </li><li> Absaugen NBF von der äußeren Kammer und 1 mL hydroxyethyl Agarose (HEA) Verarbeiten Gel auf eine 1,5-ml-Zentrifuge. Langsam schmelzen die Agarose in einem Mikrowellen niedriger Leistung mit und 10-20 s Impulse wiederholt, bis die Agarose geschmolzen ist. </li><li> Halten Sie die HEA in einem 37 ° C warmen Bad Erstarrung zu verhindern, bis sofort einsatzbereit. </li><li> Entfernen Sie die NBF aus der inneren Kammer und anzuwenden 25 ul geschmolzenes HEA in die innere Kammer und damit die Agarose für 2-5 min verfestigt. </li><li> Wet 2 Schaum Histologie Pads in 10% NBF und legen Sie ein Pad in einer Einbettungskassette (siehe 3D). </li><li> Verwenden Sie ein # 11 Klinge Skalpell (was eine sehr scharfe hat, fein spitzer Klinge), um den Filter von der Unterseite des Einsatzes zu punktenKammer, indem Sie sie teilweise aus der Kunststoffeinsatz Kammer. </li><li> Legen Sie eine kleine Menge (100-200 ul) NBF in einer Petrischale und tauchen Sie den teilweise verdrängt Filter in der NBF (3A). </li><li> Mit einem # 10 Skalpellklinge, drücken leicht gegen die Mitte des Filters, von der Innenseite des Einsatzkammer, um vollständig den Filter aus dem Einsatz barrel (3B) entfernen. Wenn es irgendein Teil des Filters ist, die noch an der Trommel angebracht ist, trennen sie mit dem Skalpell. </li><li> Schneiden Sie die HEA-beschichteten Filter in der Hälfte mit dem # 10 Klinge Skalpell (3C). </li><li> Platzieren Sie jede Hälfte des Filters auf das Schaumstoffpolster in der Kassette Histologie vorbereitet in Schritt 6.4 (3D). </li><li> In den zweiten 10% NBF getränkten Schwamm in die Kassette, zwischen denen die Filter. </li><li> Snap-Siegel der Kassette, in NBF und über Nacht inkubiert. </li><li> Prozessfilter in Paraffinblöcke für das Schneiden und Färben alszuvor beschrieben 12. </li></ol>

<ol><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).</li>
<li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+reprogrammed+cells+to+identify+therapy+for+respiratory+papillomatosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis.</a> N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).</li>
<li>Signoretti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63+is+a+prostate+basal+cell+marker+and+is+required+for+prostate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development.</a> Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).</li>
<li>Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Prostate cancer stem cells.</a> J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).</li>
<li>Ringer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+the+p53+tumor+suppressor+protein+bridges+the+apoptotic+and+autophagic+signaling+pathways+to+regulate+cell+death+in+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).</li>
<li>Pollock, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strigolactone+analogues+induce+apoptosis+through+activation+of+p38+and+the+stress+response+pathway+in+cancer+cell+lines+and+in+conditionally+reprogrammed+primary+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).</li>
<li>Crogliom, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26910887">Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair.</a> Oncotarget. , (2016).</li>
<li>Saeed, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Drug+Testing+of+Patient-derived+Conditionally+Reprogrammed+Cells+from+Castration-resistant+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer.</a> Eur Urol. , (2016).</li>
<li>Palechor-Ceron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+induces+diffusible+feeder+cell+factor%28s%29+that+cooperate+with+ROCK+inhibitor+to+conditionally+reprogram+and+immortalize+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells.</a> Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).</li>
<li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> J Vis Exp. (99), e52868(2015).</li>
<li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Primäre Zelllinien sind ein wichtiges und sich schnell entwickelnde Plattform für die Krebsforschung. Die Kultureinsatz-basierte 3D-Kultursystem unterstützt die Differenzierung von primären Prostata CRCs innerhalb einer zweiwöchigen Frist. Der CRC-Filter-Methode stellt eine neue, mittlere Durchsatzverfahren für Prostata-Forschung. Bestehende Maus PDX-Modelle sind zeitaufwendig und extrem teuer, und viele der PDX Proben nicht in Kultur gezüchtet werden, Forschern initiierte Experimente und ihre Nützlichkeit begrenzen. Da...

Die Identifizierung und Nutzung von Krebstherapien, die auf Einzelpersonen personalisiert sind ein vorrangiges Ziel in der Krebsforschung. Kürzlich wurden neue Konzepte entwickelt, die in die Einrichtung von primären Zellkulturen für größere Leichtigkeit ermöglichen, möglicherweise Weisen sowohl die Identifizierung und Prüfung personalisierten Therapien bieten. Zum Beispiel kann der R-spondin Basis Prostata organoiden Ansatz 1 für dreidimensionale (3D) Kultivierung von normalen und metastatischen Prostatakrebszellen in einer kommerziellen extrazellulären Matrix (beispielsweise Matrigel), während die Bedingter Reprogrammierung von Zellen (CRC) Verfahren an der Georgetown 2 entwickelt, nutzt 3 weitere Standard - 2D - Kulturbedingungen. Insbesondere führen die Kombination aus einem Rho - Kinase - Inhibitor (Y-27632) und bestrahlten J2 Maus - Fibroblasten - Feeder - Zellen auf unbestimmte Zeit Kultivierung von Keratinozyten CRCs 2. Die CRC-Methodik istextrem robust, mit primären Zelllinien erfolgreich etabliert und auf unbestimmte Zeit aus der Prostata und viele andere normalen und malignen epithelialen Geweben 3 gehalten. Wichtig ist, dass unsere CRC-Technologie für die schnelle Identifizierung der ursächlichen Basis für rezidivierende Atemwegs Papillomatose bei einem Patienten erlaubt, die eine Reihe von früheren medikamentösen Behandlungen versagt hatte. Darüber hinaus mit normalen und tumorabgeleiteten CRCs genehmigte die erfolgreiche Identifizierung eines FDA Droge, Vorinostat, wurde innerhalb von zwei Wochen nach der anfänglichen Gewebebiopsie gemacht. Der Patient wurde auf vorinostat platziert, in der erfolgreichen Behandlung ihrer Erkrankung 4 führt. Die normale Prostata wird von Luminal, basal umfasste und den seltenen neuroendokrinen Zellen 5. Luminalen Zellen bilden die säulen Epithelschicht der Drüse und drücken den Androgen-Rezeptor (AR), sowie andere luminalen Marker wie Zytokeratine 8 und 18 und Prostate-spezifischen Antigens (PSA) 6. Im Gegensatz dazu sind die basale Zellen unterhalb der luminalen Schicht lokalisiert und Zytokeratin 5 und p63 exprimieren, aber geringe Mengen des AR 5. Wir haben 7, 8, 9 und andere 10 haben erfolgreich Prostata CRCs in präklinischen mechanistischen Arzneimittelempfindlichkeit Untersuchungen verwendet. Wenn jedoch unter Standard - 2D - Gewebekulturbedingungen gezüchtet, versagen diese Zellen vollständig AR Signalisierung 10 zu beteiligen. Wichtig ist gesetzt, wenn sie unter die Nierenkapsel von immungeschwächten Mäusen, gewann die CRCs normalen Prostatadrüsen Architektur und Funktion anzeigt, dass Prostata CRCs ihre Abstammung Engagement beibehalten, wenn sie in einer permissiven Umgebung platziert. Die Entwicklung des Filtereinsatzes basierenden Zellkultur hier beschriebene System ermöglicht eine schnelle (2 Wochen) in vitro Differenzierung von Prostata CRCs als belegt by die erhöhte Expression des AR und AR Zielgene sowie verringerte Mengen an p63. Die Filtereinsätze verwendet werden, enthalten Polycarbonatmembranen (Porengröße 0,4 &amp; mgr; m), die die Kultivierung von Säugetierzellen zu unterstützen. Das System, wie entwickelt, macht Gebrauch von normalen und malignen Prostata CRCs, 6-Well-Kulturschalen und die Filtereinsätze. Zellkulturmedien bedingt durch J2 - Zellen 11 ist in der unteren Kammer und der Prostata Differenzierungsmedien in der oberen Kammer angeordnet. Die hierin beschriebenen Techniken Prostata luminalen Zelldifferenzierung innerhalb einer 2-wöchigen Zeitraum, im Einklang mit den Zielen der personalisierten Medizin zu unterstützen. Es war auch zwingend notwendig, die Methoden zu entwickeln, die für die umfassende molekulare, genetische und zelluläre Profilierung der Kulturen ermöglichen. Ansätze zur Isolierung von DNA, RNA und Protein aus Zellen von der Filteroberfläche gelöst wurden für eine genaue Wiederholungsprobenverarbeitung entwickelt und rationalisiert. Finally, Einbettung zu ermöglichen, die Methode zum Entfernen des Filters erforderlich ist, Schneiden und für H &amp; E, immunhistochemischen und Immunfluoreszenzfärbung wird vollständig beschrieben.

<table><tbody><tr><td>Corning Costar Snapwell-Kultureinsätze</td><td>Corning</td><td>3801</td><td></td></tr><tr><td>Millicell-Zellkultureinsätze</td><td>Millipore</td><td>PIHP01250</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 6 Well</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine 0,1 % in Wasser</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7903</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Saftey Scapel 10 Blade</td><td>Integra Miltex</td><td>4-510</td><td></td></tr><tr><td>Steriles Standardskalpell mit 11 Klingen</td><td>Integra Miltex</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lyse- und Extraktionspuffer</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfluorid</td><td>Fishcer</td><td>Scientific S299-100</td><td></td></tr><tr><td>Natriumvanadat</td><td>Fishcer Scientific</td><td>13721-39-6</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3483123</td><td></td></tr><tr><td>Protease-Inhibitor-Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin und Pepstatin A)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25030081& nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>F-12 Nährstoff-Mischmedien</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dihydrochlorid Gesteinsinhibitor</td><td>Enzo</td><td>ALX-270-333-M025</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>PHG0315</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Choleratoxin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3012</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264550</td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Histogel Gel zur Probenverarbeitung ( Thermo</td> <td>Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr> Nicht <tr><td>adhärenter Verband</td><td>Telfa</td><td>KDL2132Z</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschale</td><td>Sigma</td><td>SIAL0167</td><td></td></tr><tr><td>HISTOSETTE II Gewebeaufbereitungs-/Einbettkassetten</td><td>Kristallgen</td><td>CG-M492</td><td></td></tr></tbody></table>

ein rapid-filtereinsatz-basierte 3d-kultursystem für die primäre prostata zelldifferenzierung

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Bedingtes umprogrammiert Zellen (CRCs) eine nachhaltige Methode zur primären Zellkultur und die Fähigkeit, umfangreiche &quot;living Biobanken&quot; von Patienten abgeleiteten Zelllinien zu entwickeln. Für viele Typen von Epithelzellen, verschiedene dreidimensionale (3D) Kultur Ansätze beschrieben worden, die eine verbesserte differenzierten Zustand unterstützen. Während CRCs ihre Abstammung Engagement für das Gewebe zu halten, aus dem sie isoliert sind, versagen sie viele der Differenzierungsmarker mit dem Ursprungsgewebe assoziiert auszudrücken, wenn sie unter normalen zweidimensionalen (2D) Kulturbedingungen gezüchtet. Um die Anwendung von Patienten stamm CRCs für Prostatakrebs Forschung verbessern, ein 3D-Kultur-Format definiert wurde, die eine schnelle (2 Wochen insgesamt) luminalen Zelldifferenzierung in normalen und Tumor-abgeleitete Prostata-Epithelzellen ermöglicht. Hierbei wird ein Filtereinsatz basierten Format wird sowohl für die Kultivierung und Differenzierung von normalen und malignen Prostata CRCs beschrieben. A dedetaillierte Beschreibung der Zellenerfassung und -verarbeitung für immunhistochemischen und Immunfluoreszenzanfärbung erforderlichen Verfahren für vorgesehen sind. Zusammengefasst das 3D-Kultur-Format beschrieben, mit den primären CRC-Linien kombiniert wird, liefert einen wichtigen mittel- Durchsatz Modellsystem für High- Bioprobe-basierte Prostata Forschung.

Der Zellkultureinsatz basiertes System ist ein relativ einfaches und schnelles Verfahren für die 3D-Kulturen von Prostata-CRCs produzieren, die luminale Zelldifferenzierung unterstützt. Eine schematische Darstellung des Systems gezeigt (Abbildung 1A) , die Anwendung der Gelatinebeschichtung an der unteren Oberfläche des Filtereinsatzes hervorhebt. Die Einsätze sind nur für die Anwendung der Gelatine umgeworfen. In 1B sind die Filter in der geeigneten Ori...

Hier stellen wir eine Methode zur Etablierung eines schnellen in vitro Systems vor, das die dreidimensionale Kultivierung und anschließende luminale Differenzierung von primären Prostataepithelzellen unterstützt.

Ein Rapid-Filtereinsatz-basierte 3D-Kultursystem für die primäre Prostata Zelldifferenzierung

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

Das übergeordnete Ziel dieses auf Filtereinsätzen basierenden 3D-Kultursystems für primäre, patientenabgeleitete Zellen besteht darin, ein biologisch relevanteres In-vitro-Modell für die Prostatakarzinomforschung zu etablieren. Durch die Verwendung primärer humaner Zellen kann diese Methode helfen, zentrale Fragen der Entwicklungsbiologie der Prostata sowie der Prostatakarzinomforschung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass es sich um eine vergleichsweise schnelle In-vitro-Methode handelt, mit der differenzierte primäre Prostatazellen etabliert werden können, und die zudem eine schnelle Isolierung von Biomolekülen wie RNA, DNA und Protein ermöglicht.Die visuelle Demonstration dieser Methoden ist entscheidend, da die Verarbeitung von Zellen auf dem Filtereinsatz für die Histologie oder die Gewinnung von RNA und Protein empfindlich und zeitkritisch ist. Um die Diffusion zwischen den Kammern in einem biologischen Sicherheitswerkbank zu begrenzen, tragen Sie eine dünne Schicht 0,1 % Gelatine auf die Unterseite der Einsätze auf und lassen Sie sie trocknen. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch zweimal.Tragen Sie anschließend die Zellen in die innere Kammer der mit Gelatine beschichteten Einsätze auf und kultivieren Sie sie bis zu zwei Wochen lang. Nach zwei Wochen bringen Sie die kultivierten Filtereinsätze direkt in eine der im Folgenden beschriebenen geeigneten nachgeschalteten Anwendungen ein. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie PBS aus der äußeren Kammer abpipettieren und vorsichtig PBS aus der inneren Kammer entfernen.Die Kulturscheiben können kurzzeitig in PBS aufbewahrt werden, bis die Anwendung beginnen kann, aber vermeiden Sie, dass die Membran austrocknet. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter 0,25 % Trypsin-EDTA in jede innere Kammer. Inkubieren Sie dann fünf Minuten bei 37 Grad Celsius.Anschließend die Zellen auf der Membranoberfläche kurz und vorsichtig mit einer 200-Mikroliter-Pipette abkratzen, während mehrmals auf- und abpipettiert wird. Danach eine Minute bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach einer Minute 250 Mikroliter konditioniertes Medium in die erste innere Kammer geben und vorsichtig auf- und abpipettieren, um den Filter zu spülen.Nach diesem Vorgang die resuspendierten Zellen in die angrenzende Filterkammer überführen, die die gleichen Mediumbedingungen enthält, und das mehrmalige Auf- und Abpipettieren wiederholen. Dieses Verfahren für jeden Insert einer einzelnen Bedingung wiederholen. Anschließend die Zellen sammeln und in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen.Spülen Sie jede Innenkammer mit zusätzlichen 100 bis 200 Mikrolitern konditioniertem Medium, um eventuell verbliebene Zellen zu gewinnen, und geben Sie diese in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen anschließend fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius in einer Mikrozentrifuge. Danach pipettieren Sie den Überstand ab und waschen das Zellpellet einmal mit 1.000 Mikrolitern PBS.Zentrifugieren Sie die Zellen erneut in einer Mikrozentrifuge bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Nach fünf Minuten saugen Sie den PBS ab und frieren die Probe bei minus 80 Grad Celsius für die spätere Verwendung ein. Geben Sie in diesem Verfahren 200 Mikroliter Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform oder ein ähnliches Extraktionsreagenz in die innere Kammer und mischen Sie die Zellen auf der Membranoberfläche kurz durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren.Anschließend inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur im Extraktionsreagenz und lassen die äußere Kammer trocken. Danach spülen Sie die Filtermembran, indem Sie die Extraktionslösung mehrmals auf- und abpipettieren. Sammeln Sie möglichst viel des Extraktionsreagenz, indem Sie die Sechs-Loch-Platte kippen und jegliche restliche Flüssigkeit abpipettieren.Beachten Sie, dass sich der Filter vom Einsatz lösen kann. Spülen Sie die abgelöste Filtermembran, falls angebracht. Sammeln Sie anschließend so viel wie möglich an Extraktionsreagenz und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers zur Reinigung und Gewinnung von DNA, RNA oder Protein.Bei der Wäsche der Zellen und des Filters mit Guanidiniumthiocyanat ist Vorsicht geboten, da eine übermäßige Agitation RNA von schlechter Qualität ergeben kann. Um Protein aus dem Filtereinsatz zu isolieren, stellen Sie den Filtereinsatz auf Eis in die 6-Loch-Platte. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter Protein-Lysepuffer in die innere Kammer.Schwenken und kratzen Sie die Zellen auf der Membranoberfläche mit einer 20-Mikroliter-Pipette, während Sie auf- und abpipettieren, und vermeiden Sie die Bildung von Blasen im Lysepuffer. Anschließend inkubieren Sie die sechswellige Platte mit Filtereinsätzen zehn Minuten auf Eis. Wiederholen Sie das Abkratzen und spülen Sie anschließend die Membranoberfläche mit dem Lysepuffer ab.Sammeln Sie die Lysate aus den sechs Inserts und überführen Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf Eis. Spülen Sie anschließend die erste Membran mit weiteren 10 Mikrolitern Lysepuffer und überführen Sie diesen auf den nächsten Filter. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Inserts einer gegebenen experimentellen Bedingung, sammeln Sie die restliche Lysepufferlösung und geben Sie sie dem 1,5-Milliliter-Röhrchen hinzu.Die Probe weitere fünf Minuten auf Eis inkubieren. Anschließend bei maximaler Geschwindigkeit 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Danach das Lysat mit einer Pipette in ein frisches 1,5-Millimeter-Röhrchen überführen.Anschließend die Analyse der Protein­konzentration durchführen oder die Lysate bei minus 80 Grad Celsius lagern. In diesem Verfahren 500 Mikroliter und 1 Milliliter 10 % NBF in die innere und äußere Kammer jeweils hinzufügen. Über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.Am nächsten Tag das NBF aus der äußeren Kammer absaugen und ein Milliliter HEA-Verarbeitungsgel in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben. Das Agarose vorsichtig in einer Mikrowelle bei niedriger Leistung mit wiederholten Impulsen von jeweils 10 Sekunden schmelzen, bis das Agarose vollständig flüssig ist. Das HEA bis zur Verwendung in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad aufbewahren, um eine Verfestigung zu verhindern.Entfernen Sie anschließend NBF aus der inneren Kammer. Geben Sie 25 Mikroliter geschmolzenes HEA in die innere Kammer und lassen Sie das Agarose zwei bis fünf Minuten lang erstarren. Befeuchten Sie dann zwei Schaumstoff-Histologiepads mit 10 % NBF und legen Sie ein Pad in ein Einbettkassette.Der Schutz der Integrität der Zellschichten auf dem Filterinsert mithilfe von HistoGel ist ein entscheidender Schritt zur Erhaltung der intakten Zellschicht für die histologische Schnittführung. Danach mit einem Skalpell der Größe 11 den Filter von der Unterseite der Kunststoffinsertkammer aus ritzen, um ihn teilweise zu lösen. Geben Sie 100–200 Mikroliter NBF in eine Petrischale und tauchen Sie den teilweise gelösten Filter in das NBF ein.Drücken Sie mit einem Skalpell der Größe 10 vorsichtig von der Innenseite der Insert-Kammer aus gegen die Mitte des Filters, um den Filter vollständig aus dem Insert-Zylinder zu lösen. Falls noch Teile des Filters am Zylinder befestigt sind, trennen Sie diese mit dem Skalpell ab. Schneiden Sie anschließend den mit HEA beschichteten Filter der Länge nach in zwei Hälften.Legen Sie jede Hälfte des Filters auf das Schaumstoffpad in der vorbereiteten Histologiekassette. Fügen Sie dann den zweiten mit 10 % NBF getränkten Schwamm der Kassette hinzu, sodass der Filter eingeschlossen wird. Verschließen Sie anschließend die Kassette durch Einrasten.Legen Sie es in NBF und inkubieren Sie es über Nacht. Dieses Hellfeldbild zeigt mehrschichtige Zelllagen auf der porösen Membran. Die einzelnen Fluoreszenzbilder für die Kerne, P63 und den Androgenrezeptor werden gezeigt, ebenso wie die Überlagerung aller drei Fluoreszenzmarker.Schließlich wird eine zusammengesetzte Überlagerung aus Helligkeitsfeld und Immunfluoreszenz gezeigt, die die Lokalisation des fluoreszierenden Signals in Bezug auf die Zellen und den Filter verdeutlicht. Hier ist ein Querschnittsbild unseres Filtereinsatzes dargestellt, verglichen mit den drüsenförmigen Epithelschichten einer intakten Prostata. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von zwei Wochen durchgeführt werden, wobei die endgültige Isolierung der Zellen und des Filtereinsatzes oder des gewünschten Biomoleküls, bei korrekter Durchführung, weniger als 30 Minuten in Anspruch nimmt.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, stets vorsichtig mit den Filtereinsätzen umzugehen, um Schäden an der Zellschicht oder am darunterliegenden Filter zu vermeiden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Western Blots, RNA-Microarray- und Proteom-Analysen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Pfadanalyse und zu Krebszellen zu beantworten. Diese Technik wird es Forschern auf dem Gebiet des Prostatakarzinoms ermöglichen, die Prostatabiologie sowie die Grundlagen des Prostatakarzinoms mithilfe primärer Prostatazellen besser zu erforschen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein hervorragendes Verständnis dafür haben, wie man kultivierte primäre Prostatazellen korrekt aus diesem 3D-Kultursystem aufbereitet und gewinnt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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Krebsforschung

In diesem Video demonstrieren wir die Kultivierung von isolierten Prostata-Epithelzellen der Maus mit einer auf Matrix-Gel-Ringen basierenden Kulturtechnik. Dieser Ansatz kann ergänzende Informationen über die Differenzierungsfähigkeit von Prostataepithelzellen zur Bildung von 3D-Drüsenstrukturen als Reaktion auf genetische oder pharmakologische Manipulation liefern.

Prostata-Organoid-Assay: Eine auf Matrixgel-Ringen basierende Ex-vivo-Kulturtechnik zur Untersuchung der Differenzierungsfähigkeit von Prostata-Epithelzellen

Wir haben einen durchlässigen mikroporösen Membraneinsatz angepasst, um die Tumormikroumgebung (TME) nachzuahmen. Das Modell besteht aus einer gemischten Zellkultur, ermöglicht die vereinfachte Generierung hochangereicherter individueller Zellpopulationen ohne Verwendung von Fluoreszenzmarkierung oder Zellsortierung und ermöglicht die Untersuchung der interzellulären Kommunikation innerhalb der TME unter Normal- oder Stressbedingungen.

Ein Mimic des Tumor-Microenvironment: Eine einfache Methode für Enriched Zellpopulationen Generierung und Untersuchung der interzellulären Kommunikation

Dieses Protokoll beschreibt die retinalen Pigment Epithelzellen (RPE) aus pluripotenten Stammzellen zu produzieren. Die Methode verwendet eine Kombination von Wachstumsfaktoren und kleine Moleküle, um die Differenzierung von Stammzellen in unreifen RPE in vierzehn Tagen und Reifen, funktionale RPE nach drei Monaten zu lenken.

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

Gentechnisch veränderte Mäuse sind nützliche Modelle für die Untersuchung von Prostata-Krebs-Mechanismen. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Identifizierung und sezieren Prostate Lappen aus einer Maus Urogenitales System, basierend auf Histologie, zu unterscheiden und zu isolieren und als Sphäroide für nachgelagerte Analysen der primären Prostata-Zellen in Vitro Kultur.

Identifikation, histologische Charakterisierung und Dissektion der Maus Prostata Lappen für In-vitro-3D Sphäroid Kultur Modelle

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um menschliche primäre Prostata organoide Handhabung führen dann empfehle Endpunkte zur Beurteilung der Phänotyp. Aussaat, Kultur Wartung, Wiederherstellung von Matrix Gel sind morphologische Quantifizierung, einbetten und schneiden, FFPE-Schnitt, ganz-Mount Färbung und Anwendung von kommerziellen Assays bezeichnet.

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Maus-Prostata-Organoide stellen einen vielversprechenden Kontext zur Bewertung von Mechanismen dar, die die Differenzierung regulieren. Dieses Papier beschreibt einen verbesserten Ansatz zur Etablierung von Prostataorganoiden und führt Methoden ein, um (1) Proteinlysat aus Organoiden zu sammeln und (2) Organoide für die konfokale Volltonmikroskopie zu fixieren und zu färben.

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Hier wird ein Protokoll zur Untersuchung pharmakologischer Reaktionen bei prostataepitheliale Organoide vorgestellt. Organoide ähneln der in vivo-Biologie und rekapitulieren die Genetik der Patienten, was sie zu attraktiven Modellsystemen macht. Prostata-Organoide können aus Wildtyp-Prostata, gentechnisch veränderten Mausmodellen, gutartigem menschlichem Gewebe und fortgeschrittenem Prostatakrebs hergestellt werden.

Prostataorganoidkulturen als Werkzeuge zur Übersetzung von Genotypen und Mutationsprofilen in pharmakologische Reaktionen

Unter Verwendung menschlicher primärer Prostataepithelzellen berichten wir über eine neuartige biomarkerfreie Methode der funktionellen Charakterisierung von stammähnlichen Zellen durch einen sphäroidbasierten Labelretentionstest. Für die Beschriftung von BrdU-, CFSE- oder Far Red 2D-Zellen wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll beschrieben. dreidimensionale Sphäroidbildung; kennzeichnungserhaltende stammähnliche Zellidentifikation durch Immunzytochemie; isolierung durch FACS.

Isolierung von Stammzellen aus 3-dimensionalen Sphäroidkulturen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Etablierung eines menschlichen Blut-Hirn-Schranken-Modells (BBB). Die Endothelzellen und Perizyten werden auf jeder Seite eines Einsatzfilters (Blutkompartiment) ausgesät, und Astrozyten werden in der unteren Vertiefung (Gehirnkompartiment) ausgesät. Das charakterisierte Modell wurde für Nanopartikeltransportexperimente verwendet.

Ein Dreifachkulturzellsystem, das die menschliche Blut-Hirn-Schranke modelliert

In dieser Arbeit wird ein neu entworfener 3D-gedruckter Einsatz als Modell der Co-Kultur vorgestellt und durch die Untersuchung der parakrinen interzellulären Kommunikation zwischen Endothelzellen und Keratinozyten validiert.

Ein innovativer 3D-gedruckter Einsatz, der für einfache 2D- und 3D-Zellkulturen entwickelt wurde

Dieses Protokoll bietet ein umfassendes Verfahren zur Isolierung, Expansion und Immortalisierung von Fibroblasten aus radikalen Prostatektomien. Darüber hinaus werden Assays beschrieben, die entwickelt wurden, um die funktionellen Effekte des Fibroblasten-Tumorzell-Crosstalks zu bewerten, wobei sowohl die Behandlung mit konditioniertem Medium als auch die Co-Kultivierung genutzt werden.

Isolierung, Kultur und Charakterisierung von Prostatakrebs-assoziierten Fibroblasten

Erfahren Sie ein schnelles 3D-Kultursystem mit Filtereinsätzen für die Differenzierung primärer Prostatazellen. Diese Methode ermöglicht die effiziente Isolierung von Biomolekülen wie RNA, DNA und Protein für die Krebsforschung.

Ein Rapid-Filtereinsatz-basierte 3D-Kultursystem für die primäre Prostata Zelldifferenzierung

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