Ein Rapid-Filtereinsatz-basierte 3D-Kultursystem für die primäre Prostata Zelldifferenzierung

Das übergeordnete Ziel dieses auf Filtereinsätzen basierenden 3D-Kultursystems für primäre, patientenabgeleitete Zellen besteht darin, ein biologisch relevanteres In-vitro-Modell für die Prostatakarzinomforschung zu etablieren. Durch die Verwendung primärer humaner Zellen kann diese Methode helfen, zentrale Fragen der Entwicklungsbiologie der Prostata sowie der Prostatakarzinomforschung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass es sich um eine vergleichsweise schnelle In-vitro-Methode handelt, mit der differenzierte primäre Prostatazellen etabliert werden können, und die zudem eine schnelle Isolierung von Biomolekülen wie RNA, DNA und Protein ermöglicht.

Die visuelle Demonstration dieser Methoden ist entscheidend, da die Verarbeitung von Zellen auf dem Filtereinsatz für die Histologie oder die Gewinnung von RNA und Protein empfindlich und zeitkritisch ist. Um die Diffusion zwischen den Kammern in einem biologischen Sicherheitswerkbank zu begrenzen, tragen Sie eine dünne Schicht 0,1 % Gelatine auf die Unterseite der Einsätze auf und lassen Sie sie trocknen. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch zweimal.

Tragen Sie anschließend die Zellen in die innere Kammer der mit Gelatine beschichteten Einsätze auf und kultivieren Sie sie bis zu zwei Wochen lang. Nach zwei Wochen bringen Sie die kultivierten Filtereinsätze direkt in eine der im Folgenden beschriebenen geeigneten nachgeschalteten Anwendungen ein. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie PBS aus der äußeren Kammer abpipettieren und vorsichtig PBS aus der inneren Kammer entfernen.

Die Kulturscheiben können kurzzeitig in PBS aufbewahrt werden, bis die Anwendung beginnen kann, aber vermeiden Sie, dass die Membran austrocknet. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter 0,25 % Trypsin-EDTA in jede innere Kammer. Inkubieren Sie dann fünf Minuten bei 37 Grad Celsius.

Anschließend die Zellen auf der Membranoberfläche kurz und vorsichtig mit einer 200-Mikroliter-Pipette abkratzen, während mehrmals auf- und abpipettiert wird. Danach eine Minute bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach einer Minute 250 Mikroliter konditioniertes Medium in die erste innere Kammer geben und vorsichtig auf- und abpipettieren, um den Filter zu spülen.

Nach diesem Vorgang die resuspendierten Zellen in die angrenzende Filterkammer überführen, die die gleichen Mediumbedingungen enthält, und das mehrmalige Auf- und Abpipettieren wiederholen. Dieses Verfahren für jeden Insert einer einzelnen Bedingung wiederholen. Anschließend die Zellen sammeln und in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen.

Spülen Sie jede Innenkammer mit zusätzlichen 100 bis 200 Mikrolitern konditioniertem Medium, um eventuell verbliebene Zellen zu gewinnen, und geben Sie diese in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen anschließend fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius in einer Mikrozentrifuge. Danach pipettieren Sie den Überstand ab und waschen das Zellpellet einmal mit 1.000 Mikrolitern PBS.

Zentrifugieren Sie die Zellen erneut in einer Mikrozentrifuge bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Nach fünf Minuten saugen Sie den PBS ab und frieren die Probe bei minus 80 Grad Celsius für die spätere Verwendung ein. Geben Sie in diesem Verfahren 200 Mikroliter Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform oder ein ähnliches Extraktionsreagenz in die innere Kammer und mischen Sie die Zellen auf der Membranoberfläche kurz durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren.

Anschließend inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur im Extraktionsreagenz und lassen die äußere Kammer trocken. Danach spülen Sie die Filtermembran, indem Sie die Extraktionslösung mehrmals auf- und abpipettieren. Sammeln Sie möglichst viel des Extraktionsreagenz, indem Sie die Sechs-Loch-Platte kippen und jegliche restliche Flüssigkeit abpipettieren.

Beachten Sie, dass sich der Filter vom Einsatz lösen kann. Spülen Sie die abgelöste Filtermembran, falls angebracht. Sammeln Sie anschließend so viel wie möglich an Extraktionsreagenz und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers zur Reinigung und Gewinnung von DNA, RNA oder Protein.

Bei der Wäsche der Zellen und des Filters mit Guanidiniumthiocyanat ist Vorsicht geboten, da eine übermäßige Agitation RNA von schlechter Qualität ergeben kann. Um Protein aus dem Filtereinsatz zu isolieren, stellen Sie den Filtereinsatz auf Eis in die 6-Loch-Platte. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter Protein-Lysepuffer in die innere Kammer.

Schwenken und kratzen Sie die Zellen auf der Membranoberfläche mit einer 20-Mikroliter-Pipette, während Sie auf- und abpipettieren, und vermeiden Sie die Bildung von Blasen im Lysepuffer. Anschließend inkubieren Sie die sechswellige Platte mit Filtereinsätzen zehn Minuten auf Eis. Wiederholen Sie das Abkratzen und spülen Sie anschließend die Membranoberfläche mit dem Lysepuffer ab.

Sammeln Sie die Lysate aus den sechs Inserts und überführen Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf Eis. Spülen Sie anschließend die erste Membran mit weiteren 10 Mikrolitern Lysepuffer und überführen Sie diesen auf den nächsten Filter. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Inserts einer gegebenen experimentellen Bedingung, sammeln Sie die restliche Lysepufferlösung und geben Sie sie dem 1,5-Milliliter-Röhrchen hinzu.

Die Probe weitere fünf Minuten auf Eis inkubieren. Anschließend bei maximaler Geschwindigkeit 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Danach das Lysat mit einer Pipette in ein frisches 1,5-Millimeter-Röhrchen überführen.

Anschließend die Analyse der Protein­konzentration durchführen oder die Lysate bei minus 80 Grad Celsius lagern. In diesem Verfahren 500 Mikroliter und 1 Milliliter 10 % NBF in die innere und äußere Kammer jeweils hinzufügen. Über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.

Am nächsten Tag das NBF aus der äußeren Kammer absaugen und ein Milliliter HEA-Verarbeitungsgel in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben. Das Agarose vorsichtig in einer Mikrowelle bei niedriger Leistung mit wiederholten Impulsen von jeweils 10 Sekunden schmelzen, bis das Agarose vollständig flüssig ist. Das HEA bis zur Verwendung in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad aufbewahren, um eine Verfestigung zu verhindern.

Entfernen Sie anschließend NBF aus der inneren Kammer. Geben Sie 25 Mikroliter geschmolzenes HEA in die innere Kammer und lassen Sie das Agarose zwei bis fünf Minuten lang erstarren. Befeuchten Sie dann zwei Schaumstoff-Histologiepads mit 10 % NBF und legen Sie ein Pad in ein Einbettkassette.

Der Schutz der Integrität der Zellschichten auf dem Filterinsert mithilfe von HistoGel ist ein entscheidender Schritt zur Erhaltung der intakten Zellschicht für die histologische Schnittführung. Danach mit einem Skalpell der Größe 11 den Filter von der Unterseite der Kunststoffinsertkammer aus ritzen, um ihn teilweise zu lösen. Geben Sie 100–200 Mikroliter NBF in eine Petrischale und tauchen Sie den teilweise gelösten Filter in das NBF ein.

Drücken Sie mit einem Skalpell der Größe 10 vorsichtig von der Innenseite der Insert-Kammer aus gegen die Mitte des Filters, um den Filter vollständig aus dem Insert-Zylinder zu lösen. Falls noch Teile des Filters am Zylinder befestigt sind, trennen Sie diese mit dem Skalpell ab. Schneiden Sie anschließend den mit HEA beschichteten Filter der Länge nach in zwei Hälften.

Legen Sie jede Hälfte des Filters auf das Schaumstoffpad in der vorbereiteten Histologiekassette. Fügen Sie dann den zweiten mit 10 % NBF getränkten Schwamm der Kassette hinzu, sodass der Filter eingeschlossen wird. Verschließen Sie anschließend die Kassette durch Einrasten.

Legen Sie es in NBF und inkubieren Sie es über Nacht. Dieses Hellfeldbild zeigt mehrschichtige Zelllagen auf der porösen Membran. Die einzelnen Fluoreszenzbilder für die Kerne, P63 und den Androgenrezeptor werden gezeigt, ebenso wie die Überlagerung aller drei Fluoreszenzmarker.

Schließlich wird eine zusammengesetzte Überlagerung aus Helligkeitsfeld und Immunfluoreszenz gezeigt, die die Lokalisation des fluoreszierenden Signals in Bezug auf die Zellen und den Filter verdeutlicht. Hier ist ein Querschnittsbild unseres Filtereinsatzes dargestellt, verglichen mit den drüsenförmigen Epithelschichten einer intakten Prostata. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von zwei Wochen durchgeführt werden, wobei die endgültige Isolierung der Zellen und des Filtereinsatzes oder des gewünschten Biomoleküls, bei korrekter Durchführung, weniger als 30 Minuten in Anspruch nimmt.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, stets vorsichtig mit den Filtereinsätzen umzugehen, um Schäden an der Zellschicht oder am darunterliegenden Filter zu vermeiden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Western Blots, RNA-Microarray- und Proteom-Analysen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Pfadanalyse und zu Krebszellen zu beantworten. Diese Technik wird es Forschern auf dem Gebiet des Prostatakarzinoms ermöglichen, die Prostatabiologie sowie die Grundlagen des Prostatakarzinoms mithilfe primärer Prostatazellen besser zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein hervorragendes Verständnis dafür haben, wie man kultivierte primäre Prostatazellen korrekt aus diesem 3D-Kultursystem aufbereitet und gewinnt.