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Isolierung und Anreicherung von Progenitor-Subsets Leber identifiziert durch eine neuartige Oberflächenmarkerkombination

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DOI:

10.3791/55284

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18. Februar 2017

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1Department of Medicine II, Saarland University Medical Center, 2Department of Physiology, Center for Integrative Physiology and Molecular Medicine (CIPMM), University of Saarland

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Leberschädigungen durch Vorläuferzellexpansion begleitet, die eine heterogene Zellpopulation darstellt. Neuartige Klassifizierung dieses Zellkompartiment ermöglicht die Unterscheidung von mehreren Untergruppen. Das hier beschriebene Verfahren zeigt die Durchflusszytometrie-Analyse und hoher Reinheit Isolierung verschiedener Untermengen, die für die weiteren Tests verwendet werden kann.

Zusammenfassung

Bei chronischen Leberschädigungen, erweitern Vorläuferzellen in einem Prozess ductularen Reaktion genannt, die auch das Auftreten von entzündlichen Zellinfiltrat und epithelialen Zellaktivierung zur Folge hat. Die Vorläuferzellpopulation während eines solchen Entzündungsreaktionen hat meist worden Markern einzigen Oberfläche untersucht, entweder durch die histologische Analyse oder mittels Durchflusszytometrie-basierte Techniken. Allerdings neuartige Oberflächenmarker verschiedene funktionell unterschiedliche Teilmengen innerhalb der Leber Vorläufer identifiziert / Stammzellfach. Die hier vorgestellten Verfahren beschreibt die Isolierung und detaillierte Durchflusscytometrieanalyse von Vorläuferuntergruppen neuartige Oberflächenmarker-Kombinationen. Darüber hinaus zeigt es, wie die verschiedene Vorläuferzelluntergruppen mit hoher Reinheit mit automatisierten magnetischen und FACS-Sortierung-basierten Methoden isoliert werden. Wichtig ermöglicht, neuartige und vereinfachte enzymatische Dissoziation der Leber für die Isolierung dieser seltenen Zellpopulationen mit hoher Rentabilitätdass überlegen ist im Vergleich zu anderen bestehenden Methoden. Dies ist besonders relevant für die weitere Vorläuferzellen in vitro zu studieren oder hochwertige RNA zur Isolierung des Genexpressionsprofil zu analysieren.

Einleitung

Leberregeneration wird meist mit der Selbsterneuerungskapazität von Hepatozyten verbunden. Dennoch treten chronische Leberverletzungen mit Progenitorzellen Aktivierung und Expansion, die mit ihrer Fähigkeit in Verbindung gebracht wurden in Hepatozyten und Cholangiozyten 1, 2, 3, 4 zu unterscheiden. Dies ist besonders relevant, da während der chronischen Verletzungen, Hepatozytenproliferation nicht wirksam ist. Trotz mehrerer Studien genetische Tracing Vorläuferzellen Targeting, ihre Rolle bei der Leberregeneration bleibt umstritten 5, 6, 7, 8. Darüber hinaus hat die Aktivierung von Vorläuferzellen wurden zu einer erhöhten fibrotische Reaktion in der Leber verbunden sind , die während Verletzungen Fragen über ihre genaue Rolle 9 wirft, 10.

Die heterogene Natur des Vorläuferzellkammer ist seit langem von Genexpressionsstudien vorgeschlagen worden , die Vorläuferzellen isoliert eine einzelne Oberflächenmarker exprimieren Mikrodissektion oder Zellsortierung-basierten Methoden 1, 11. Tatsächlich, die vor kurzem eine neuartige Oberflächenmarker Kombination mit gp38 (podoplanin) eindeutig vorherige einzelne Marker der Vorläuferzellen zu verschiedenen Untergruppen 12 verbunden. Wichtig ist , dass nur diese Teilmengen nicht in ihrer Oberflächenmarker Ausdruck unterschieden , sondern auch funktionelle Veränderungen bei Verletzungen 12 ausgestellt.

Mehrere Tiermodelle wurden verwendet, um Vorläuferzellaktivierung und die Leberregeneration untersuchen. Es scheint , dass die verschiedenen Arten von Verletzungen , die Aktivierung verschiedener Untergruppen von Vorläuferzellen 12 zu fördern. Dies könnte die ph erklärenenotypic Divergenz der ductularen Reaktion beim Menschen beobachteten 4. Somit sind die komplexen phänotypische und funktionelle Analysen von Vorläuferzellen Schwenk ihre Rolle bei Verletzungen und die wahre Bedeutung der ductularen Reaktion in Lebererkrankungen zu verstehen.

Neben Oberflächenmarker Kombinationen, erschweren die entscheidenden Unterschiede in der Zellisolierung Protokolle weiter die Basis Schlussfolgerungen zu früheren Studien 2. Eine wesentliche Menge von Studien angesprochen , die Rolle von Vorläuferzellen , die in ihrem Isolierungsprotokoll (zB Leber Dissoziation (Enzymkombination und der Dauer des Prozesses), Dichte Medium und Zentrifugation Geschwindigkeit) stark unterscheiden 2. Eine optimierte Isolationstechnik, eine bessere Rentabilität für seltene Zellpopulationen und reflektierende Teilmenge Zusammensetzung, wurde vor kurzem 12 entwickelt und veröffentlicht. Das Ziel dieses Artikels ist es, eine det zu schaffenailed Protokoll dieser Leberzellisolierungsverfahren und der Teilmenge Analyse für die korrekte Wiedergabe der Technik zu ermöglichen. Zusätzlich weist das Protokoll einen Vergleich mit dem vorherigen Isolierungsverfahren, die Unterschiede zu zeigen, im Vergleich zu dem neuen Protokoll.

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Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden mit der Zustimmung der Ethik und Tierpflegegremien von Homburg University Medical Center durchgeführt.

1. Herstellung von Materialien und Puffer

  1. Frisch herstellen alle Puffer für Leber Verdauung erforderlich unter Verwendung von sterilen Komponenten und eine laminare Haube bakterielle Kontamination zu vermeiden.
  2. Bereiten Sie die Sammelpuffer (CB) von 49,5 ml RPMI-Medium gemischt und 0,5 ml fötales Rinderserum (FBS; niedrig Endotoxin, hitzeinaktiviert) mit einer 1% (v / v) Lösung zu erreichen. Bewahren Sie die Lösung auf Eis bis zur weiteren Verwendung.
    HINWEIS: Etwa 25 ml CB ist notwendig, eine ganze Leber zu verdauen.
  3. Bereiten Sie den Verdauungspuffer (DB) unter Verwendung der folgenden Zutaten: RPMI-Medium, 1% (v / v) FBS (niedrige Endotoxin, Hitze inaktiviert), Kollagenase P (0,2 mg / ml), DNase-I (0,1 mg / ml) und Dispase (0,8 mg / ml).
    HINWEIS: Etwa 25 ml DB ist notwendig, eine ganze Leber zu verdauen. Pre-warm die DB in ter 37 ° C Wasserbad vor dem Gebrauch.
  4. Rekonstituieren die Enzyme bei der Ankunft in Hanks 'ausgeglichener Salzlösung (HBSS; collagense P und Dispase) oder in DNase-I - Puffer (50% (v / v) Glycerin, 1 mM MgCl 2 und 20 mM Tris-HCl; pH 7,5) Aliquotierung, es, und speichern sie sie bei -20 ° C. Bewahren Sie die DNase-I bei 4 ° C Puffer und verwenden Sie es innerhalb von zwei Monaten.

2. Herstellung von Liver Einzelzellsuspension

  1. Euthanize unbehandelten Wildtyp-Mäuse durch Genickbruch in Übereinstimmung mit den lokalen Ethik und Tierpflegegremien.
  2. Legen Sie die Mäuse auf einer Dissektion Bord und nass das Fell mit 70% Ethanol. Mit einer Schere, öffnen Sie den Bauch mit einem Mittelschnitt der Haut, gefolgt von einem Y-Schnitt in Richtung der Extremitäten. Öffnen Sie das Peritoneum mit dem Brustbein nach oben mit der Schere. Um die Leber zu entdecken, verdrängen den Darm sanft auf der rechten Seite mit einem Wattestäbchen.
  3. Mit Hilfe von Schere und Pinzette, entfernen Sie die Leberlappen,so dass die Gallenblase hinter und Kontamination mit Bindegewebe zu vermeiden. Wiegen Sie die Leber und legen Sie es auf Eis in einer Petrischale mit HBSS.
  4. Legen Sie die Leberlappen auf einer trockenen Petrischale und schneiden Sie das Lebergewebe in homogene Würfel etwa 2 mm eine Seite mit einem Skalpell. Übertragen Sie die Stücke in einen 15-ml konischen Zentrifugenröhrchen.
  5. In 2,5 ml DB an den 15-ml konischen Zentrifugenröhrchen die Leberstücke enthalten, und legen Sie sie in einem 37 ° C Wasserbad die Verdauung (eine gesunde Leber nimmt 60-70 min und einer Leberzirrhose dauert 80-90 min zu starten ).
    HINWEIS: Wenn eine gesamte Leber verdaut wird, sollte die Leber in zwei 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen getrennt werden gute Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten.
  6. Bereiten Sie einen neuen 15-ml konischen Zentrifugenröhrchen freigegeben Leberzellen zu sammeln. Legen Sie ein Polyamid 100 um Filtergewebe auf der Oberseite des Rohres und benetzt das Netz mit 800 & mgr; l von CB. Legen Sie die konische Zentrifugenröhrchen auf Eis.
  7. Mischen Sie die samsätze im 37 ° C warmen Wasserbad nach 5 und 10 Minuten, um durch Schütteln des 15-ml konischen Zentrifugenröhrchen, das die Leberstücke die Verdauung zu unterstützen.
  8. 15 min nach der Verdauung beginnt, vorsichtig mischen die Leberstücke unter Verwendung einer 1000-ul-Pipette mit einem Schnitt Spitze, die die Leberstücke ermöglicht durch leicht passieren. Die Röhrchen wieder in das Wasserbad und lassen Sie die Stücke für 2 min absetzen.
  9. Entfernen Sie den Überstand mit den disseminierten Zellen enthält (in der Regel 700 & mgr; l 2x) und fügen Sie ihn in die Röhre, hergestellt in Schritt 2.6. Ersetzen Sie den abgenommenen mit DB (2x 700 & mgr; l) und legen Sie es wieder in den 37 ° C warmen Wasserbad.
  10. Wiederholen Sie das Verfahren beschrieben in Schritt 2.8 (typischerweise bei 30, 40, 50, 55 und 60 min), bis etwa 60-70 min seit dem Start der Aufschluss bestanden haben. Ab 40 min ab, sollten die verbleibenden Leber Stücke klein genug sein, durch eine ungeschnittene 1000 ul Pipettenspitze zu übergeben.
    HINWEIS: Gesunde Leber ist DIGEvoll sted innerhalb von 60 bis 70 min, während in der Regel fibrotischen Leber 80-90 min benötigt. Von diesem Zeitpunkt sollte das Lebergewebe in dem konischen 15-ml-Zentrifugenröhrchen nicht sichtbar sein, um die Leberstücke enthalten, und alle freigesetzten Zellen sollten in das Rohr in Schritt 2.6 hergestellten übertragen werden.
  11. Am Ende der Verdauungsprozess, sammelt die Zellen und zentrifugieren für 8 min bei 180 xg und 4 ° C (unter Verwendung von reduzierten Beschleunigung / 4 und Verzögerung / 2).
  12. Resuspendieren des Zellpellets in 1 ml Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Lysepuffer und Inkubation für 1 min bei Raumtemperatur, um die roten Blutkörperchen zu lysieren. Die Reaktion durch Zugabe von 5 ml CB, und dann zentrifugiert werden die Zellen für 8 min bei 180 × g und 4 ° C (mit reduzierten Beschleunigung / 4 und Verzögerung / 2). Resuspendieren der Zellen in 4 ml CB und speichert sie auf dem Eis. Zählen Sie die Zellen, wie in Schritt 3 beschrieben.
    HINWEIS: Das Zellpellet wird lose und daher wird der Überstand entfernt pipettiert anstelle dekantiert zu werden.

3. Bestimmung der Zellzahl unter Verwendung Flow Cytometry

Hinweis: Für die Zellzahl zu bestimmen, eine automatische Zellzähler oder idealerweise die Durchflusszytometrie-basierte Zell Quantifizierung unten statt der klassischen Neubauer-Kammer-Methode auf Basis vorgeschlagen beschrieben. Die Leber Einzelzellsuspension in Schritt 2 beschrieben, enthält parenchymalen und nicht-parenchymalen Zellen (NPC) mit sehr unterschiedlichen Größen und Körnungen. Die richtige Ausschluss von Zelltrümmern zusammen mit dem Gating-On - Vorwärtsstreuung, Seitenstreuung (FSC-SSC) charakteristisch für NPCs , wenn Durchflusszytometrie unter Verwendung sichert den Erfolg des beschriebenen Protokoll 12.

  1. Bereiten eines Aliquots der Leberzellsuspension (20 & mgr; l) und füge 174 & mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und 6 & mgr; l von Propidiumiodid (PI; Endkonzentration 0,375 & mgr; g / ml). Hinzufügen Zählen Perlen, die für die Quantifizierung der Zellen ermöglichen.
  2. Tor auf SSC-A-FSC-A Schutt zu vermeiden und weitere Dubletten auszuschließen mit FSC-H und FCS-A.
    Hinweis: Es ist wichtig , dass die Gating - Strategie dargestellt in Abbildung 2 zu folgen.
  3. Tor aus PI-positive toten Zellen, messen 30 & mgr; l aus Ihren Proben, und die Ereignisse aufzeichnen. Folgen Sie den Richtlinien des Herstellers, die Zellzahl zu berechnen.
    HINWEIS: Führen Sie die Schritte 4 für die Durchflusszytometrie Messung, Schritte 5 und 6 für die magnetische Basis Vorläuferzellisolierung und die Schritte 7 für die Durchflusszytometrie Art von Vorläufer Subpopulationen.

4. Anfärbung der Leber Einzelzellsuspension für die Fow Cytometry Analysis of Progenitor Subsets

Antikörper Klon Host / Isotype Stock Konzentration [mg / ml] Verdünnung
CD64 X54-5 / 7.1 Mouse IgG1, κ 0,5 1: 100
CD16 / 32 93 Ratten-IgG2a, λ 0,5 1: 100
CD45 30-F11 Ratte IgG2b, κ 0,2 1: 200
CD31 MEC13.3 Ratten-IgG2a, κ 0,5 1: 200
ASGPR1 Polyklonalen Ziege IgG 0,2 1: 100
Podoplanin 2001.01.08 Syrian Hamster IgG 0,2 1: 1.400
Podoplanin 2001.01.08 Syrian Hamster IgG 0,5 1: 1.400
CD133 Mb9-3G8 Ratten-IgG1 0,03 3 ul
CD133 315-2C11 Ratten-IgG2a, λ 0,5 1: 100
CD34 RAM34 Ratten-IgG2a, κ 0,5 1: 100
CD90.2 53-2,1 Ratte IgG2, κ 0,5 1: 800
CD157 BP-3 Maus-IgG2b, κ 0,2 1: 600
EpCAM G8.8 Ratten-IgG2a, κ 0,2 1: 100
Sca-1 D7 Ratten-IgG2a, κ 0,03 10 & mgr; l
Maus-IgG2b, κ MPC-11 0,2
Ratten-IgG1 RTK2071 0,2
Ratte IgG2b, κ RTK4530 0,2
Ratten-IgG2a, κ RTK2758 0,5
Ratten-IgG2a, κ RTK2758 0,2
Syrian Hamster IgG SHG-1 0,2
Syrian Hamster IgG SHG-1 0,5
Normale Ziege IgG Kontrolle Polyklonalen Ziege IgG 1
Esel anti-Ziege IgG Donkey IgG 2 1: 800
Streptavidin 1 1: 400

Tabelle 1.

Antikörper 1 2 3 4 5
CD45 APC / Cy7 Ratte IgG2b, κ
0,5 ul 		+ + + +
CD31 Biotin + Ratten-IgG2a, κ
0,5 ul 		+ + +
ASGPR1 gereinigt + + Normale Ziege IgG Kontrolle
0,2 ul 		+ +
Podoplanin APC + + + Syrian Hamster IgG
1 ul einer 1.14 Dilution 		+
CD133 PE + + + + Ratten-IgG1
0,45 & mgr; l
Esel anti-Ziege
Alexa Fluor 488 		+ + + + +
Streptavidin
Alexa Fluor 405 		+ + + + +

Tabelle 2.

  1. Platzieren eines Aliquots der Zellsuspension aus Schritt 2.11 in ein Reaktionsrohr (1,5 ml) , die 2,5 x 10 5 Zellen, bestimmt , wie in Schritt 3 beschrieben.
  2. Zentrifugation der Zellen für 3 min bei 300 xg und 4 ° C unter Verwendung einer Mikrozentrifuge.
    HINWEIS: An diesem Punkt kann eine Vakuumpumpe verwendet werden, um den Überstand vorsichtig entfernen.
  3. Zellpellet in Fc-Block-Mix und Inkubation für 5 min auf Eis. Bereiten Fc-Block-Mix mit einem Gesamtvolumen von 50 & mgr; l pro Fleck. 10 & mgr; l FcR-Blockierungsreagenz, 1 & mgr; l gereinigtem anti-CD64 (1: 100; 0,5 ug / Fleck) und 40 & mgr; l Färbepuffer (ST Puffer: HBSS, 1% (v / v) FBS und 0,01% Natriumazid) pro Fleck.
    HINWEIS: Natriumazid ist hochgiftig. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, wie Nitril Handschuhe, Labormantel, und eine Gesichtsmaske.
  4. Zugabe von 50 & mgr; l zu den Zellen (das Gesamtvolumen der Zellen ist nun zu 100 & mgr; l) und Inkubieren der Zellen mit der Antikörpermischung, vor Licht geschützt und 20 min auf Eis Anfärben Mischung.
  5. Bereiten Sie die Antikörper-Mix mit einem Gesamtvolumen von 50 & mgr; l pro Fleck. Für 50 ul ST-Puffer, fügen Sie die folgenden konjugierte Antikörper für die Grundfärbung: CD45 (0,5 & mgr; l, 1: 200; 0,1 ug / Fleck), CD31 (0,5 & mgr; l, 1: 200; 0,25 ug / Fleck), ASGPR1 (1 & mgr; l ; 1: 100; 0,2 ug / Fleck), podoplanin (1 ul einer 1.14 Verdünnung; 1: 1400 Ende Verdünnung; 0,014 g / Fleck) und CD133 (3 & mgr; l; 0,09 ug / Fleck).
    HINWEIS: Tabelle1 fasst die Antikörperklone und Verdünnungen für Grund Flecken genutzt und zusätzliche Oberflächenmarker der verschiedenen Untergruppen. Bereiten zusätzliche Zellsuspensionen für die Antikörpermischung , die entsprechenden Isotypkontrollen und / oder Fluoreszenz minus einer Kontrollen (RGV), wie in Tabelle 2 dargestellt.
  6. In 400 ul ST Puffer zu jeder Probe und zentrifugiert werden die Zellen für 4 min bei 300 g und 4 ° C.Discard den Überstand und resuspendieren Zellen in 100 ul sekundären Antikörper Mischung, die 0,125 ul Esel-Anti-Ziegen-IgG (1: 800; 0,25 ug / Fleck) und 0,25 ul fluoreszenz konjugiertem Streptavidin (1: 400; 0,25 ug / Fleck) in 100 & mgr; l Puffer ST.
  7. Inkubieren Sie die Zellen während vor Licht geschützt und mit dem Antikörper-Mix für 20 Minuten auf Eis. In 400 ul ST Puffer zu jeder Probe und zentrifugiert werden die Zellen für 4 min bei 300 g und 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 300 & mgr; l ST Buffer enthält 0,25 & mgr; g / ml PI.
    HINWEIS: Die Lebensfähigkeit der Zellen von Vorläuferzellen verringert sich mit der Zeit; Daher wird vorgeschlagen, so schnell wie möglich frische Proben zu messen.

5. Magnetische Microbead-basierte Anreicherung von Progenitorzellen

  1. Transfer eines Aliquots der Einzelzellsuspension Leber enthaltend 1,5-2 x 10 6 Zellen, bezogen auf die Zellzahl bestimmt , wie in Schritt 3 in ein neues 15 ml konisches Zentrifugenröhrchen beschrieben.
  2. Zentrifugation der Zellen für 8 min bei 180 xg und 4 ° C (unter Verwendung von reduzierten Beschleunigung / 4 und Verzögerung / 2).
    HINWEIS: In der Regel eine gesunde C57BL / 6-Mausleber (oder 1 g Lebergewebe) müssen in drei 15-ml konischen Zentrifugenröhrchen getrennt werden.
  3. Resuspendieren der Zellen in 400 & mgr; l HBSS 0,5% (v / v) Rinderserumalbumin (BSA) und füge 40 ul anti-CD31-Microbeads und 30 & mgr; l anti-CD45-Microbeads. Inkubieren der Zellen für 15 min bei 4 ° C.
    HINWEIS: Überschreiten Sie nicht ter Inkubationszeit, da die Reinheit der Trennung wird deutlich reduziert werden.
  4. 5 ml HBSS 0,5% (v / v) BSA zu den Zellen und zentrifugieren für 8 min bei 180 xg und 4 ° C (unter Verwendung von reduzierten Beschleunigung / 4 und Verzögerung / 2).
  5. Zellpellet in 100 ul von toten Zellentfernung Perlen und brüten sie für 15 Minuten bei Raumtemperatur. In der Zwischenzeit eine LS Trennsäule herzustellen und mit 3 ml HBSS 0,5% (v / v) BSA kalibrieren.
    Hinweis: Die Inkubationszeit nicht überschreiten, da die Reinheit der Trennung wird deutlich reduziert werden.
  6. Hinzufügen 900 & mgr; l HBSS 0,5% (v / v) BSA zu den Zellen, filtern sie 100 um Polyamid Filtergewebe verwenden und laden sie auf dem LS-Trennsäule.
    HINWEIS: Legen Sie eine ganze Leber auf einer LS Trennsäule.
  7. Die Säule wird dreimal mit 3 ml HBSS 0,5% (v / v) BSA und sammeln den Durchfluss.
  8. Zentrifugieren Sie die Durchfluss für 8 min bei 180 × g und 4 ° C (mit reduziertem Zubeschleunigung / 4 und Verzögerung / 2).
  9. Resuspendieren des Pellets Zelle entweder in Spülpuffer (RB) (PBS und 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)), enthaltend 0,5% (v / v) BSA oder ST-Puffer, je nach der weiteren experimentellen Verfahren.

6. Magnetische Microbead-basierte automatisierte Zellreinigung von Progenitor-Zell-Populationen aus mehreren Livers Kombinierte

HINWEIS: Da Zellvorläuferuntergruppen seltenen Zellpopulationen darstellen, ist Zellen aus mehreren Leber kombiniert häufig benötigt ausreichende Zellzahlen für weitere Experimente zu erreichen. Als ein Beispiel, CD133 + und gp38 + Zelltrennung wird unten beschrieben.

  1. Isolierung von CD133 + Vorläufern
    1. Nach dem Schritt 5.9, die Zellen zählen, wie in Schritt 3 beschrieben, und resuspendieren bis 10 6 Zellen in 100 & mgr; l von RB (typischerweise 4-6 gesunde Leberproben Pooling).
    2. Hinzufügen anti-CD64 1: 100 und anti-CD16 / 32 1: 100 zu den Zellen und incubaß sie für 5 Minuten auf Eis. 1: 100 Anti-CD133 biotinylierte Antikörper an die Zellen und Inkubation sie auf Eis für weitere 10 min.
    3. 5 ml RB und zentrifugieren für 8 min bei 180 xg und 4 ° C (unter Verwendung von reduzierten Beschleunigung / 4 und Verzögerung / 2).
    4. Resuspendieren der Zellen in 400 & mgr; l von RB und dann werden 10 & mgr; l anti-Biotin-Mikrokugeln. Inkubieren der Probe für 15 min bei 4 ° C. Nicht die Inkubationszeiten überschreiten, da dies die Reinheit der Proben reduziert.
    5. 5 ml RB und zentrifugieren für 8 min bei 180 xg und 4 ° C (unter Verwendung von reduzierten Beschleunigung / 4 und Verzögerung / 2). Resuspendieren des Pellets in 1 ml RB.
  2. Isolierung von gp38 + Vorläufern
    1. Nach dem Schritt 5.9, die Zellen zählen, wie in Schritt 3 beschrieben, und resuspendieren bis 10 6 Zellen in 100 & mgr; l von RB (typischerweise 4-6 gesunde Leberproben Pooling).
    2. Hinzufügen anti-CD64 1: 100 und anti-CD16 / 32 1: 100 zu den Zellen und inkubiere sie auf Eis für 5 min. Als Nächstes fügen Sie 1:100 anti-gp38-Antikörpers an die Zellen biotinyliert und für weitere 10 min auf Eis inkubieren.
    3. 5 ml RB und zentrifugieren für 8 min bei 180 xg und 4 ° C (unter Verwendung von reduzierten Beschleunigung / 4 und Verzögerung / 2).
    4. Resuspendieren der Zellen in 400 & mgr; l von RB und mit 5 & mgr; l anti-Biotin-Mikrokugeln. Inkubieren der Probe für 15 min bei 4 ° C. Nicht die Inkubationszeiten überschreiten, da dies die Reinheit der Proben reduziert.
    5. 5 ml RB und zentrifugieren für 8 min bei 180 xg und 4 ° C (unter Verwendung von reduzierten Beschleunigung / 4 und Verzögerung / 2).
    6. Resuspendieren des Zellpellets in 1 ml RB.
  3. Gemeinsame Schritte nach dem Schritt 6.1 oder 6.2
    1. Legen Sie die 15-ml konischen Zentrifugenröhrchen, die magnetisch markierte Zellsuspensionen auf einer Kühl 5-Rack mit zwei zusätzlichen Leerrohre zum Sammeln der positiven und negativen Fraktionen enthalten. Legen Sie die Chill-Rack auf die Trennplattform des Separators.
    2. Verwenden Sie die positive Auswahlprogramm(Possel_d2) mit einem umfangreichen Waschschritt zwischen jeder Probe (rinse-Option).
      HINWEIS: column basierte manuelle Trennung von Zellen anstelle des automatischen Separators wird die Reinheit der Probe zu verringern.
    3. Sammeln Sie die positive Fraktion und Zentrifuge für 8 min bei 180 xg und 4 ° C (unter Verwendung von reduzierten Beschleunigung / 4 und Verzögerung / 2).
    4. Resuspendieren des Zellpellets entweder in RB oder ST-Puffer, je nach der weiteren experimentellen Verfahren.
    5. Für eine Reinheitskontrolle, ein Teil der Zellen nehmen und sie färben, wie in Schritt 4 beschrieben.

7. Durchflusszytometrie Zellsortierung

ANMERKUNG: Eine hochreine Sortierung jeder Vorläuferzelle Teilmenge konnte mit dem Protokoll im folgenden beschrieben erreicht. Die Gesamtausbeute an Zellen ist viel geringer als die in Schritt 6 beschrieben ist, und ist am besten für die Genexpressionsanalyse.

Parameter Rahmen
Düsengröße 85 & mgr; m
Frequenz 46,00-46,20
Amplitude 38,30-55,20
Phase 0
Tröpfchenverzögerungs 28,68-28,84
Dämpfung Aus
First Drop 284-297
Ziel Gap 9.-14
Druck 45 psi

Tisch 3.

  1. Erwerben Zellen, die aus dem Magnetbasis Anreicherung (beschrieben in Schritt 5); zählen sie, wie in Schritt 3 beschrieben; und färben sie für Vorläufermarker (CD133, gp38), CD31, CD45 und ASGPR1, wie in Schritt 4 erläutert.
  2. Bereiten Sie Sortiermedium (SM): Phenol-Rot frei Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), enthaltend 0,5% (v / v) BSA und 0,01% (v / v) Natriumazid. Resuspendieren der gefärbten Zellen in SM, übertragen sie in eine Polypropylen-Rundbodenrohr und legen Sie sie auf Eis.
    HINWEIS: Natriumazid ist hochgiftig. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, wie Nitril Handschuhe, Labormantel, und eine Gesichtsmaske. Nicht Natriumazid verwenden, wenn die sortierten Zellen für funktionelle Assays verwendet werden.
  3. Verwenden Sie die entsprechende Software für die Art von Sortierer für die Zellisolierung verwendet. Öffnen Sie die Software und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, die Sortierparameter und Maschinenspezifikationen einzurichten.
    HINWEIS: Die Maschinenspezifikationen zusammengefasst sind in Tabelle 3. Während Maschinenspezifikationen an verschiedenen Institutionen anders sein könnte, ist es wichtig, dass die Reduzierung der Sortier Druck zu beachten und eine größere Düsengröße erforderlich ist (45 psi und 85 & mgr; m Düse), um die Lebensfähigkeit der Vorläuferzelle zu erhöhen populatIonen und die Qualität der RNA aus den sortierten Zellen hergestellt. Es ist wichtig, angereichert Lebervorläuferzellen zu verwenden, um den Ausgleich zu setzen. Andere Leber oder Leukozyten-Populationen haben unterschiedliche Autofluoreszenz und führen zu einer suboptimalen Lösung der Stroma-Bevölkerung und in einer falschen Gating-Strategie.
  4. Kalibrieren Sie die Maschine und legen Sie eine 5-ml-Polypropylen-Rundboden-Röhrchen 350 ul SM in der Sortiersammelvorrichtung enthält. Starten Probenerfassung und Sortierung. Sammeln Sie 1.000 Veranstaltungen der Subpopulation und stoppen Sie den Probenstrom.
  5. Nehmen Sie den Schlauch aus der Sortiereinrichtung und messen die sortierten Zellen auf dem Durchflusszytometer. Identifizieren Sie den Prozentsatz der sortierten Zellpopulation unter den lebenden Zellen. Dieser Prozentsatz gibt die Reinheit der sortierten Zellen.
  6. Wenn Art Reinheit 95% übersteigt, legen Sie ein 5-ml-Polypropylen-Rundboden-Röhrchen 350 & mgr; l RLT Lysepuffer in der Sortiersammelvorrichtung enthält.
  7. Starten Sie die Art und sammeln 7,000-10.000 Ereignisse pro Stromatumoren Subpopulation.
  8. Übertragung der RLT Lysepuffer die sortierten Zellen in einer DNase- und RNase-freie Reaktionsrohr und lagern die Proben bei -80 ° C bis zur weiteren Analyse enthält.

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Ergebnisse

Das Verfahren hier für die Verdauung der Leber präsentiert ein neuartiges Gemisch aus Enzymen führt zu einer Einzelzellsuspension mit parenchymalen und nicht-parenchymalen Leberzellen (1 und 2a) verwendet wird . Nach dem ACK-Lyse von roten Blutzellen ist die direkte Durchflusszytometrie - Analyse der Einzelzellsuspension möglich (1 und 2). Die Gating - Strategie beinhaltet den Ausschluss von Dubletten und toten Zellen

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Diskussion

Leberentzündung und Verletzung verschiedener Herkunft auslösen regenerative Prozesse in der Leber , die durch zwei Vorläuferzellexpansion und Aktivierung begleitet werden, 3. Diese Lebervorläuferzellen besitzen Zelleigenschaften stammen und wahrscheinlich eine bedeutende Rolle in der Pathomechanismus verschiedener Lebererkrankungen spielen.

Die Heterogenität der Leber Vorläuferzellen ist seit langem vorgeschlagen worden. Die Neubewer...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Alexander von Humboldt-Stiftung Sofja Kovalevskaja-Preis an VLK unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
RPMILife Technologies21875-034
phenolrotfrei DMEMLife Technologies31053-028
FBSLife Technologies10270-106
KollagenaseP Sigma-Aldrich11249002001
DNAse-ISigma-Aldrich10104159001
DispaseLife Technologies
ACK Lysing BufferLife TechnologiesA10492-01
HBSSLife Technologies14025-050
PBSSigma-AldrichD8537
NatriumazidSigma-AldrichS20021%ige Stammlösung
herstellen 10% BSAMiltenyi Biotec130-091-376
autoMACS SpüllösungMiltenyi Biotec130-091-2220,5 % (v/v) BSA zugeben und auf Eis lagern
Phenolrotfreies DMEMSigma-AldrichD1145
Zählung der Kügelchen Count BrightLife TechnologiesC36950
PIMiltenyi Biotec130-093-233
FcR BlockierungsreagenzMiltenyi Biotec130-092-575
Anti-CD31 MikrobeadsMiltenyi Biotec130-097-418
Anti-CD45 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-052-301
Kit zur Entfernung toter ZellenMiltenyi Biotec130-090-101
Anti-Biotin MicroBeadsMiltenyi Biotec130-090-485
CD64 GereinigtesBioLegend139302Verdünnung: 1:100
CD16/32 AufgereinigtesBioLegend101302Verdünnung: 1:100
CD45 APC/Cy7BioLegend103116 Verdünnung: 1:200, markiert hämatopoetische Zellen
CD31 BiotinBioLegend 102504Verdünnung: 1:200, markiert Endothelzellen
ASGPR1 AufgereinigtesBio-TechneAF2755-SPVerdünnung: 1:100, markiert Hepatozyten
Podoplanin APCBioLegend127410Verdünnung: 1:1.400, markiert Vorläuferzellen
Podoplanin BiotinBioLegend127404Verdünnung: 1:1.400
CD133 PEMiltenyi Biotec130-102-210verwenden 3 & Mikro; L, markiert Vorläuferzellen
CD133 BiotinBioLegend 141206Verdünnung: 1:100
CD34 BiotineBioScience13-0341-81Verdünnung: 1:100
CD90.2 Pacific BlueBioLegend 140306Verdünnung: 1:800
CD157PE BioLegend 140203Verdünnung: 1:600
EpCAM Brilliant Violet 421BioLegend118225Verdünnung: 1:100
Sca-1 BiotinMiltenyi Biotec130-101-885verwenden 10 & Mikro; L
Maus IgG2b, κ PEBioLegend400311
Ratte IgG1 PEBioLegend400407
Ratte IgG2b, κ APC/Cy7BioLegend400624
Ratte IgG2a, κ BiotinBioLegend400504
Ratte IgG2a, κ Brilliant Violet 421BioLegend400535
Syrischer Hamster IgG APCBioLegend402012
Syrischer Hamster IgG BiotinBioLegend402004
Normal Ziege IgG Kontrolle GereinigtBio-TechneAB-108-C
Esel Anti-Ziegen IgG Alexa Fluor 488Life TechnologiesA11055Verdünnung: 1:800
Streptavidin Alexa Fluor 405Life TechnologiesS32351Verdünnung: 1:400
100 &Mikro; m FiltergewebeA. HartensteinPAS3
LS SäuleMiltenyi Biotec130-042-401
QuadroMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-090-976
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi Biotec130-096-343
AutoMACS Pro SeparatorMiltenyi Biotec130-092-545
FACS AriaTMIIIBD Biosciences
FACSDiva sofwareBD Biosciences
Polypropylen RundbodenröhrchenFalcon352063
Rneasy plus Mini-KitQiagen74134RLT Lysepuffer ist im Lieferumfang enthalten
17105041

Referenzen

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LeberprogenitorzellenDurchflusszytometrische AnalyseMagnetische Mikroperlen TrennungFACS SortiermethodenEnzymatische LeberdissoziationZelloberfl chenf rbungCD45 CD31 ASGPR1GP38 CD133 ExpressionIsolation von Progenitor Subsets

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