Method Article

Isolierung und Anreicherung von Progenitor-Subsets Leber identifiziert durch eine neuartige Oberflächenmarkerkombination

DOI:

10.3791/55284

⸱

February 18th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine II, Saarland University Medical Center, 2Department of Physiology, Center for Integrative Physiology and Molecular Medicine (CIPMM), University of Saarland

In This Article

Summary

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Leberschädigungen durch Vorläuferzellexpansion begleitet, die eine heterogene Zellpopulation darstellt. Neuartige Klassifizierung dieses Zellkompartiment ermöglicht die Unterscheidung von mehreren Untergruppen. Das hier beschriebene Verfahren zeigt die Durchflusszytometrie-Analyse und hoher Reinheit Isolierung verschiedener Untermengen, die für die weiteren Tests verwendet werden kann.

Abstract

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Bei chronischen Leberschädigungen, erweitern Vorläuferzellen in einem Prozess ductularen Reaktion genannt, die auch das Auftreten von entzündlichen Zellinfiltrat und epithelialen Zellaktivierung zur Folge hat. Die Vorläuferzellpopulation während eines solchen Entzündungsreaktionen hat meist worden Markern einzigen Oberfläche untersucht, entweder durch die histologische Analyse oder mittels Durchflusszytometrie-basierte Techniken. Allerdings neuartige Oberflächenmarker verschiedene funktionell unterschiedliche Teilmengen innerhalb der Leber Vorläufer identifiziert / Stammzellfach. Die hier vorgestellten Verfahren beschreibt die Isolierung und detaillierte Durchflusscytometrieanalyse von Vorläuferuntergruppen neuartige Oberflächenmarker-Kombinationen. Darüber hinaus zeigt es, wie die verschiedene Vorläuferzelluntergruppen mit hoher Reinheit mit automatisierten magnetischen und FACS-Sortierung-basierten Methoden isoliert werden. Wichtig ermöglicht, neuartige und vereinfachte enzymatische Dissoziation der Leber für die Isolierung dieser seltenen Zellpopulationen mit hoher Rentabilitätdass überlegen ist im Vergleich zu anderen bestehenden Methoden. Dies ist besonders relevant für die weitere Vorläuferzellen in vitro zu studieren oder hochwertige RNA zur Isolierung des Genexpressionsprofil zu analysieren.

Introduction

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Leberregeneration wird meist mit der Selbsterneuerungskapazität von Hepatozyten verbunden. Dennoch treten chronische Leberverletzungen mit Progenitorzellen Aktivierung und Expansion, die mit ihrer Fähigkeit in Verbindung gebracht wurden in Hepatozyten und Cholangiozyten 1, 2, 3, 4 zu unterscheiden. Dies ist besonders relevant, da während der chronischen Verletzungen, Hepatozytenproliferation nicht wirksam ist. Trotz mehrerer Studien genetische Tracing Vorläuferzellen Targeting, ihre Rolle bei der Leberregeneration bleibt umstritten

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Protocol

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Alle experimentellen Verfahren wurden mit der Zustimmung der Ethik und Tierpflegegremien von Homburg University Medical Center durchgeführt.

1. Herstellung von Materialien und Puffer

  1. Frisch herstellen alle Puffer für Leber Verdauung erforderlich unter Verwendung von sterilen Komponenten und eine laminare Haube bakterielle Kontamination zu vermeiden.
  2. Bereiten Sie die Sammelpuffer (CB) von 49,5 ml RPMI-Medium gemischt und 0,5 ml fötales Rinderserum (FBS; niedrig Endotoxin, hitzeinaktiviert) mit einer 1% (v / v) Lösung zu erreichen. Bewahren Sie die Lösung auf Eis bis zur weiteren Verwendung.
    HINWEIS: Etwa 25 ml C....

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Results

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Das Verfahren hier für die Verdauung der Leber präsentiert ein neuartiges Gemisch aus Enzymen führt zu einer Einzelzellsuspension mit parenchymalen und nicht-parenchymalen Leberzellen (1 und 2a) verwendet wird . Nach dem ACK-Lyse von roten Blutzellen ist die direkte Durchflusszytometrie - Analyse der Einzelzellsuspension möglich (1 und 2). Die Gating - Strategie beinhaltet den Ausschluss von Dubletten und toten Zellen

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Discussion

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Leberentzündung und Verletzung verschiedener Herkunft auslösen regenerative Prozesse in der Leber , die durch zwei Vorläuferzellexpansion und Aktivierung begleitet werden, 3. Diese Lebervorläuferzellen besitzen Zelleigenschaften stammen und wahrscheinlich eine bedeutende Rolle in der Pathomechanismus verschiedener Lebererkrankungen spielen.

Die Heterogenität der Leber Vorläuferzellen ist seit langem vorgeschlagen worden. Die Neubewer.......

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Disclosures

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Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde von der Alexander von Humboldt-Stiftung Sofja Kovalevskaja-Preis an VLK unterstützt.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RPMILife Technologies21875-034
phenolrotfrei DMEMLife Technologies31053-028
FBSLife Technologies10270-106
KollagenaseP Sigma-Aldrich11249002001
DNAse-ISigma-Aldrich10104159001
DispaseLife Technologies
ACK Lysing BufferLife TechnologiesA10492-01
HBSSLife Technologies14025-050
PBSSigma-AldrichD8537
NatriumazidSigma-AldrichS20021%ige Stammlösung
herstellen 10% BSAMiltenyi Biotec130-091-376
autoMACS SpüllösungMiltenyi Biotec130-091-2220,5 % (v/v) BSA zugeben und auf Eis lagern
Phenolrotfreies DMEMSigma-AldrichD1145
Zählung der Kügelchen Count BrightLife TechnologiesC36950
PIMiltenyi Biotec130-093-233
FcR BlockierungsreagenzMiltenyi Biotec130-092-575
Anti-CD31 MikrobeadsMiltenyi Biotec130-097-418
Anti-CD45 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-052-301
Kit zur Entfernung toter ZellenMiltenyi Biotec130-090-101
Anti-Biotin MicroBeadsMiltenyi Biotec130-090-485
CD64 GereinigtesBioLegend139302Verdünnung: 1:100
CD16/32 AufgereinigtesBioLegend101302Verdünnung: 1:100
CD45 APC/Cy7BioLegend103116 Verdünnung: 1:200, markiert hämatopoetische Zellen
CD31 BiotinBioLegend 102504Verdünnung: 1:200, markiert Endothelzellen
ASGPR1 AufgereinigtesBio-TechneAF2755-SPVerdünnung: 1:100, markiert Hepatozyten
Podoplanin APCBioLegend127410Verdünnung: 1:1.400, markiert Vorläuferzellen
Podoplanin BiotinBioLegend127404Verdünnung: 1:1.400
CD133 PEMiltenyi Biotec130-102-210verwenden 3 & Mikro; L, markiert Vorläuferzellen
CD133 BiotinBioLegend 141206Verdünnung: 1:100
CD34 BiotineBioScience13-0341-81Verdünnung: 1:100
CD90.2 Pacific BlueBioLegend 140306Verdünnung: 1:800
CD157PE BioLegend 140203Verdünnung: 1:600
EpCAM Brilliant Violet 421BioLegend118225Verdünnung: 1:100
Sca-1 BiotinMiltenyi Biotec130-101-885verwenden 10 & Mikro; L
Maus IgG2b, κ PEBioLegend400311
Ratte IgG1 PEBioLegend400407
Ratte IgG2b, κ APC/Cy7BioLegend400624
Ratte IgG2a, κ BiotinBioLegend400504
Ratte IgG2a, κ Brilliant Violet 421BioLegend400535
Syrischer Hamster IgG APCBioLegend402012
Syrischer Hamster IgG BiotinBioLegend402004
Normal Ziege IgG Kontrolle GereinigtBio-TechneAB-108-C
Esel Anti-Ziegen IgG Alexa Fluor 488Life TechnologiesA11055Verdünnung: 1:800
Streptavidin Alexa Fluor 405Life TechnologiesS32351Verdünnung: 1:400
100 &Mikro; m FiltergewebeA. HartensteinPAS3
LS SäuleMiltenyi Biotec130-042-401
QuadroMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-090-976
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi Biotec130-096-343
AutoMACS Pro SeparatorMiltenyi Biotec130-092-545
FACS AriaTMIIIBD Biosciences
FACSDiva sofwareBD Biosciences
Polypropylen RundbodenröhrchenFalcon352063
Rneasy plus Mini-KitQiagen74134RLT Lysepuffer ist im Lieferumfang enthalten
17105041

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
  2. Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J ....

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