Methodenartikel

Die Bewertung der Wirkung von Umweltchemikalien auf Honig-Bienen-Entwicklung von der Person zu Colony Ebene

DOI:

10.3791/55296

1. April 2017

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir ein Verfahren Pestizid kontaminierte Lebensmittel sowohl mit einer einzelnen Honigbiene und einer Bienenkolonie zu ernähren. Das Verfahren bewertet die Pestizid Auswirkungen auf die einzelnen Honigbienen durch in - vivo - Zufuhr von basischen Larven Ernährung und auch auf den natürlichen Zustand der Bienenkolonie.

Zusammenfassung

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Das Vorhandensein von Pestiziden in der Imkerei ist eines der schwerwiegendsten Probleme, das das Leben einer Honigbiene beeinflusst. Pestizide können wieder in den Bienenstock gebracht werden, nachdem die Bienen an Blumen gefressen haben, die mit Pestiziden besprüht wurden. Mit Pestiziden kontaminierte Lebensmittel können zwischen Arbeitern ausgetauscht werden, die dann Larven füttern, und können so möglicherweise die Entwicklung der Honigbienen beeinträchtigen. So können Pestizidrückstände in der Umwelt zu einem chronischen Schadfaktor für Honigbienenpopulationen werden und allmählich zum Kollaps der Bienenvölker führen. In dem vorgestellten Protokoll werden Fütterungsmethoden von Honigbienen beschrieben und entweder auf eine einzelne Honigbiene oder auf ein Volk angewendet. Hier wird als Pflanzenschutzmittel der Insektenwachstumsregulator (IGR) Pyriproxyfen (PPN) eingesetzt, der häufig zur Bekämpfung von Schadinsekten eingesetzt wird und für die Entwicklung von Honigbienenlarven und -puppen schädlich ist. Das vorliegende Verfahren kann für weitere Studien auf andere potenziell schädliche Chemikalien oder Krankheitserreger von Honigbienen angewendet werden.

Einleitung

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Das Vorhandensein von Pestiziden in der Umwelt ist eines der gravierendsten Probleme , die Auswirkungen auf das Leben einer Honigbiene 1, 2, 3. Mehrere Studien haben die gemeinsame Präsenz von Pestizidrückständen in Bienenvölkern und Bienenprodukten unter Beweis gestellt. In Taiwan war die durchschnittliche Anwendung von Pestiziden 11-12 kg / ha pro Jahr (2005-2013). Die Menge an Pestiziden in Taiwan verwendet wird , ist höher als die der EU - Länder und die lateinamerikanischen Länder 4, 5. Mit anderen Worten, leidet die Bienenzucht Umwelt ernst Pestizid Stress, vor allem in Taiwan und möglicherweise in anderen Ländern.

Die Honigbiene Apis mellifera ist eine der wichtigsten Bestäuber in landwirtschaftlichen Systemen 6 und produziert auch wertvolle Produkte wie Honig. Expos jedoch Honigbienen sinded auf verschiedene Pestizide und diese Pestizide können nach Nahrungssuche auf Blumen zu beehives zurückgebracht werden , die mit Pestiziden besprüht wurden , wenn 7 Nektar und Pollen zu sammeln, 8. Sie können auch durch die Imker Pestizide ausgesetzt werden , sich Schädlingsprobleme zu steuern das Ziel, innerhalb der Nesselsucht 9, 10, 11. Da Honigbienenlarven von Ammenbienen gefüttert werden für ihre Entwicklung, Larven, Drohnen und sogar die Königin kann 12 dieser Pestizid-kontaminierten Nektare und Pollen ausgesetzt werden. Die Toxizität von verschiedenen Pestiziden Honigbienen muss 13 angesprochen werden.

Viele Anstrengungen wurden unternommen, um die Probleme der Umweltpestizidrückstände zu bewerten. Yang et al. den Einfluss des neurotoxischen Insektizid Imidacloprid auf der Entwicklung von Honigbienenlarven getestet in derBienenstock und berichtet , dass eine subletale Dosis von Imidacloprid in olfaktorischen assoziativen Verhalten der erwachsenen Bienen ergab 14. Auch Urlacher et al. die subletale Wirkungen eines Organophosphat - Pestizid geprüft, Chlorpyrifos, auf einer Lernleistung der Honigbiene Arbeiter unter Laborbedingungen 15. In unserer früheren Studie haben wir die Auswirkungen eines Insektenwachstumsregulator (IGR), Pyriproxyfen (PPN), auf Larvenhonigbienen 16.

In diesem Beitrag stellen wir Methoden für die chemischen Auswirkungen auf die Entwicklung von Honigbienen zu bewerten. Honigbiene Fütterungsmethoden wurden beschrieben und angewandt, um entweder einzelne Honigbienen oder zu einer Kolonie. Zunächst testeten wir verschiedene Konzentrationen von Pestiziden kontaminierte Grundlarvenfutter (BLD) auf Larven in den Kolonien , die Auswirkungen des Pestizids auf einzelne Honigbienen in vivo zu bewerten. Wir gingen dann die natürliche condit zu simulierenIonen des Pestizids durch pestizid kontaminierten Sirup des beehives verwenden. Bei diesem Verfahren wird PPN, die weit gegen Schadinsekten verwendet wird , 17 und sind schädlich für die Entwicklung von Honigbienenlarven und Puppen 16, 18, 19, wird ein Indikator sein , um die negative Wirkung des Pestizids auf dem Gebiet darstellen.

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Protokoll

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1. Vorbereitungen

  1. Machen 1 L 50% Zuckersirup. Man löst 1 kg Saccharose in 1 l ddH 2 O.
  2. Bereiten Pyriproxyfen (PPN) -Lösung in BLD. Make 1,1 L von 10.000 ppm PPN - Stammlösung und verdünnte 100 ml PPN - Lösung in 1 l sterilisierten ddH 2 O. Lagerung bei 4 ° C.
  3. Verdünne die PPN-Stammlösung auf Endkonzentrationen von 0,1, 1, 10 und 100 mg / kg (ppm) in dem BLD für das folgende Experiment.
  4. Machen PPN-Sirup (für die Kolonie-Ebene). Verdünne die PPN Lager auf Endkonzentrationen von 10 und 100 ppm in 50% Zuckersirup für das folgende Experiment.
  5. Honigbienenhaltung.
    Hinweis: Hier ist die experimentelle Lage ist die National Ilan University (NIU) Imkerei, Yi-Lan City, Taiwan; (GPS - Koordinaten: N24.747278, E121.746200).
    1. Überprüfen Honigbiene (Apis mellifera L.) für die Lebensmittelmenge wöchentlich Kolonien und Futtermittel mit 1 Liter 50% Zuckersirup , falls erforderlich (der Honig - Speicherbereich ist leer). Definieren Sie eine gesundeKolonie als 9 Bilder von Bienenwaben in jeder Kolonie mit einem Queen-Eier normalerweise legen.
  6. Bereiten Sie 100 ml Grund Larvaldiät (BLD). Man löst 6% D-glucose, 6% Fructose und 1% Hefeextrakt in sterilisiertem destilliertem deionisiertem Wasser (ddH 2 O) und ergänzt mit 50% Gelee royale. Lagerung bei 4 ° C, jedoch nicht länger als 3 Tage.
    Hinweis: Pre-warm bis 35 ° C vor dem Experiment und innerhalb von 3 Tagen haben.

2. In - vivo - Fütterungsmethode

Hinweis: In - vivo - Fütterungsmethode wurde von Hanley et al modifiziert. 20

  1. Honigbienenlarven Auswahl und Kennzeichnung.
    1. Legen Sie eine Königin excluder 9 Rahmen einer gesunden Kolonie in 4 Rahmen und 5 Rahmen zu unterteilen, während die Königin zu dem Rahmenprofil 4 zu begrenzen. Verlassen mindestens einen leeren Rahmen in dem Rahmenteil 4 zur Eiablage.
    2. Nachdem die Königin Eier für 1 Tag VerlegungÜberprüfen, den Rahmen für das Auftreten von Eiern und halten Sie die Eier in den Bienenstöcken für 72 h (4. Tag) bis zum 1. Tag alten Larven schlüpfen. Nehmen Sie einen der Rahmen, die 1-Tage alten Arbeiterinnenlarven (innerhalb von 24 h schraffiert) aus dem Testbienenstock von Hand und entfernen Sie die Honigbiene Arbeiter aus dem Rahmen mit einer Biene Pinsel.
    3. Bedecken den Rahmen mit einer transparenten Rutsche (Size = Länge x Breite x Dicke = 29,7 mm x 21 mm x 0,1 mm) und Nagel die transparente Folie auf dem Rande des Rahmen mit thumbtacks (1A).
    4. Für jede Behandlung wählen zufällig 50 1 Tag alten Larven (4. Tag) und jede Brutzelle unter Verwendung von Permanentmarker Stifte auf dem transparenten Schieber (1A und 1B) markieren.
      Hinweis: Schreiben Sie die Informationen jeder Behandlung auf dem Rahmen und transparente Folie als auch durch Permanentmarker Stifte mit der Verwirrung zwischen den verschiedenen Behandlungen zu vermeiden. Entfernen Sie die markierten Folien und halten für die in vivo </ Em> Fütterung und Beobachtung.
  2. In - vivo - Zuführung.
    1. Fügen unterschiedliche Konzentrationen von PPN-BLD (0,1, 1, 10 und 100 ppm) zu jeder markierten Brutzelle durch Pipettieren am Tag 1, 2 und 3 mit 10 ul, 10 ul und 20 ul, das jeweils entsprechend den Ansaugmenge der Larven Alter. Fügen Sie die gleiche Menge an BLD (kein PPN) zu einer Kontrollgruppe. Dadurch reichert sich die Gesamtdosis von PPN-BLD in jeder markierten Brutzelle bis 4, 40, 400 und 4000 pg.
      HINWEIS: Erkennen Sie die markierten Brutzellen durch die markierten transparenten Folien und entfernen Sie die markierten transparenten Folien nach der Fütterung. Verwenden Sie frische BLD zum Zuführen der Reinigung der Brutzellen von den Arbeiterinnen zu verhindern.
    2. Bringen Sie die PPN-behandelten Rahmen auf die ursprünglichen Kolonien für weitere Beobachtungen.
      HINWEIS: Jede Behandlung hat vier biologische Wiederholungen in vier Kolonien.
  3. Die Beobachtung der behandelten Larven am Tag 7.
    1. Zu beobachten the PPN-behandelten Larven, kehren die markierten transparenten Folien an den Rahmen die Sterblichkeit und Verschließmaschinen Raten in den markierten Brutzellen zu erfassen.
  4. Die Beobachtung der behandelten Puppen und Schlüpfen Raten am Tag 13.
    1. Entfernen Sie das Bienenwachs gedeckelter Brutzellen.
    2. Setzen Sie die weiche kippte Pinzette in Brutzelle und klemmen die Puppen sehr leicht dann Puppen nehmen vorsichtig aus.
    3. Übertragen der Puppen in 24-Well-Gewebekulturplatten mit einer Doppelschicht von Laborgewebe unterhalb jeder Vertiefung. Notieren Sie sich den Schaden und Mortalität während pupal Übertragung.
    4. Halten Sie die 24-Well - Gewebekulturplatten in einem Inkubator bei 34 ° C und 70% relative Luftfeuchtigkeit , bis Auftauchen (ca. 8 Tage).
    5. Bitte beachten und die Puppen und tauchte Honigbienen aufzunehmen.
  5. Statistiken
    1. Berechnen Sie die aufgezeichneten Daten und Gegenwart als Mittelwert ± SD
    2. Analysieren der Daten unter Verwendung der Varianzanalyse (ANOVA) durch SAS und verwenden den niedrigstwertige Unterschied (LSD) -Test die Unterschiede zwischen zwei mittels verschiedener Behandlungen zu analysieren. Definieren statistisch signifikant als P - Wert <0,05. Verschiedene Buchstaben in der gleichen Spalte der Tabelle zeigten einen signifikanten Effekt, der durch die statistische Analyse.

3. Toxizität von PPN bei Colony Ebene in Beehive

  1. Stellen Sie die Honigbiene Gruppen auf.
    1. Senkrecht eine Königin excluder 9 Frames eines gesunden Kolonie in 4 Rahmen (Teil A) und 5-Rahmen (Teil B) zu unterteilen, während die Königin zu dem Rahmenprofil 4 zu begrenzen. Verläßt mindestens einen leeren Rahmen in dem 4-Rahmenprofil für die Eiablage.
      Hinweis: Legen Sie eine andere Königin EXCLUDER die auf der Oberseite der Königin Teil der Königin zu verhindern, zwischen den Teilen bewegt.
    2. Nachdem die Königin Eier für 1 Tag legt, überprüfen Sie den Rahmen für das Auftreten von Eiern. Nehmen Sie die entsprechenden Rahmen Eier aus Teil A von Hand enthält, und entfernen Sie die Honigbiene Arbeitervon dem Rahmen mit einer Biene Bürste.
    3. Bedecken den Rahmen mit transparenter Rutsche und Nagel die transparente Folie in der Kante des Rahmens mit Reißzwecken.
    4. wählen zufall 100 Brutzellen Eier und markieren jede Brutzelle unter Verwendung von Permanent-Marker auf der transparenten Folie enthalten. Ordnen diese 100 Brutzellen als Gruppe 1, die Information von jeder Behandlung auf dem Rahmen und transparente Objektträger unter Verwendung von Permanent-Marker schreiben die Verwirrung zwischen den verschiedenen Behandlungen zu vermeiden.
    5. Bringen Sie den markierten Rahmen zu Teil A für 3 Tage und dann übertragen die Königin zu Teil B, Eier zu legen.
    6. Nach 1 Tag, überprüfen die Rahmen von Teil B, einen geeigneten Rahmen wählen und 100 Brutzellen enthaltende Eier Etikett als in Schritt 3.1.4 beschrieben. Ordnet diese 100 Brutzellen als Gruppe 2.
    7. Bringen Sie den markierten Rahmen zu Teil B für 3 Tage und dann die Königin übertragen, um ein Teil Eier zu legen.
    8. Wiederholen Sie die Königin Austausch zwischen Teil A und Teil B 6 weitere Male, und weisen Gruppen numerisch,jeweils (Abbildung 2). Es sollte von 9 Gruppen insgesamt sein.
  2. T reat Honigbienenvolk mit PPN Zuckersirup am Tag 13 (Abbildung 2).
    1. 1 L 50% PPN Zuckersirup, der 10 oder 100 ppm in einem Kunststoffbienenbeschickungskasten (W x L x H = 20 cm x 30 cm x 3,5 cm) und setzen den Kasten oben auf den Rahmen in den experimentellen Kolonien.
      Hinweis: Gruppe 1 nicht die PPN erhält an 13 Tagen, da die Brutzellen versiegelt wurden.
    2. Futtermittel die Kontrollgruppe mit 1 L 50% Zuckersirup (kein PPN), wie in Schritt 2.2 beschrieben.
  3. Anzahl 1 Tage alte Larven und Aufzeichnung als die Bruteies Rate von 100 markierten Brutzellen für jede Gruppe am Tag 5 (Abbildung 2). Honigbiene Eier nehmen normalerweise 3 Tage in 0 Tagen Larven zu schlüpfen; Deshalb überprüfen und 5 für jede Gruppe am Tag 100 Eier haltigen Brutzellen am Tag 1 und zählen die Anzahl von 1 Tag alter Larven bezeichnen den Prozentsatz der Schlupfrate zu erhalten.
  4. Count die verkappten Brutzellen und Aufzeichnung als die Larven- Capping Rate von 100 markierten Brutzellen für jede Gruppe an Tag 11 (Abbildung 2). 6 bis 7 Tage alten Larvenbrutzellen werden mit Bienenwachs von Honigbienenlarven Arbeiter für Verpuppung begrenzt.
  5. Beobachten Puppen Reifung und notieren Sie die eclosion Rate von 100 markierten Brutzellen für jede Gruppe an Tag 17 (Abbildung 2).
    1. Entfernen Sie das Bienenwachs gedeckelter Brutzellen und nehmen Puppen aus mit weichen Spitzen versehenen Pinzette vorsichtig. Übertragen der Puppen in einer 24-Well-Gewebekulturplatten mit einer Doppelschicht von Laborgewebe unterhalb jeder Vertiefung.
    2. Halten Sie die 24-Well-Gewebekulturplatten in einem Inkubator bei 34 ° C und 70% RH bis zum Auftauchen.
    3. Bitte beachten und notieren Sie die Puppen und tauchte Honigbienen für jede Gruppe bis Gruppe 9 (49 Versuchstagen).
      Hinweis: Jede Behandlung hat vier biologische wiederholt.
  6. Statistiken
    1. Berechnen Sie die aufgezeichneten Daten und Gegenwart als Mittelwert± SD.
    2. Analysiert die signifikanten Unterschiede zwischen Paaren von Behandlungen (zB 0 ppm / 10 ppm, 10 ppm / 100 ppm und 0 ppm / 100 ppm) in jeder Gruppe durch den Zwei-tailed t - Test nach Student verwendet. Definieren Sie als statistisch signifikant , wenn P - Wert <0,05.

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Ergebnisse

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Für die Honigbiene Feldtest wurde eine Königin auf den für Eiablage 4-Rahmenabschnitt begrenzt. Dieser Schritt könnte die Brutdichte in einem Rahmen erhöhen und nachfolgende Beobachtungen erleichtern. Jede Behandlung wurde markiert, und die Entwicklung in den Honigbienen wurde eindeutig durch ein transparentes Dia beobachtet. In - vivo - Zufuhr von PPN-BLD auf Honigbienenlarven in dem Bienenstock wurde durchgeführt , um genau den Einfluss von PPN auf der Entwicklung von...

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Diskussion

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Die Königin begrenzte Eiablage Methode und Queen-Austauschverfahren sind wichtige Schritte zur Einstellung innerhalb dieses Protokolls Honigbiene Gruppen für den Feldtest auf. Die Königin begrenzte Eiablage Verfahren ermöglicht die Synchronisation des Lebenszyklus von Honigbienen. Folglich können die Forscher wählen Sie 1 Tage alte Larven der gleichen Altersgruppe für die Behandlung mit verschiedenen Dosen des Pestizids. Für die Königin-Austauschverfahren wurde die Königin zwischen Teil A (4 Rahmen) und B (5 Frames) zu ...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

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Diese Forschung wurde von Grant 105AS-13.2.3-BQ-B1 aus dem Bureau of Tier- und Pflanzengesundheit Inspektion und Quarantäne, der Rat für Landwirtschaft, Exekutiv-Yuan und Grant 103-2313-B-197-002-MY3 vom Ministerium unterstützt für Wissenschaft und Technologie (MOST).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Honigbienen-BoxSAN-YI Honey FactoryW1266Honigbienen-Aufzucht-Königinnenausschluss
(zwischen den Rahmen)SAN-YI Honey FactoryI1575Königinnen-Limit 
Königinnenausschluss (oben)SAN-YI Honey FactoryI1566Königinnenbegrenzung oben 
BienenbürsteSAN-YI Honey Factory, TaiwanW1414reinigen Sie die Bienen sanft auf dem Rahmen
BienenfutterautomatSAN-YI Honey Factory, TaiwanP0219füttern Sie das Volk mit Zuckersirup
Transparenter ObjektträgerWan-Shih-Chei, Taiwan (http://www.mbsc.com.tw/a01goods.asp?s_id=40)1139Markieren Sie den Larvenbereich auf den Rahmen (Material: Polyethylenterephthalat, PET) (Größe = Länge * Breite * dick = 29,7 mm * 21 mm * 0,1 mm)
24 Well Tissu KulturplatteGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., LtdTCP011024Aufzucht von Puppen aus der Extraktion
AutoklavTomin medical equipmenco., LTD.TM-321Herstellung von sterilisiertem destilliertem deionisiertem Wasser (ddH2O)
P20 PipettiererGilsonF123600Zugabe von PPN in den Inkubator des Bienenlarvenfutterpools
 Verifizierter Lieferant - Yihder Co., Ltd.LE-550RDAufzucht von Puppen aus Extraktion
KimwipesCOW LUNG INSTRUMENT CO., LTDAufzucht von Puppen aus Extraktion
Gelée RoyaleNational Ilan University (NIU)NIUHerstellung von basischer Larvennahrung (BLD)
D-(+)-GlukoseSigmaG8270Herstellung von basischer Larvennahrung (BLD)
D-(-)-FruktoseSigmaF0127Herstellung von basischer Larvennahrung ( BLD)
HefeextraktCONDA, pronadisa1702Make basic larval diet (BLD)
SaccharoseTaiwan sugar coporation E01071010Herstellung von Zuckersirup für Bienenfutter
Pyriproxyfen (11%)LIH-NUNG CHEMICAL CO.. LTD.Registrierungs-Nr. 1937Insektenwachstumsregulator (IGR), der im Experiment verwendet wurde
KCS34155

Referenzen

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PestizidexpositionPyriproxyfen BehandlungKolonie F tterungsmethodeAnalyse des LarvenstadiumsTechnik zur Handhabung von PuppenMessung der SchlupfrateBehandlung von BrutzellenPr fung von UmweltchemikalienBewertung von Honigbienenkolonien

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