Method Article

Methoden Epithelial Transportprotein Funktion und Expression in Mutterdarm und Caco-2-Zellen gezüchtet in 3D zu studieren

DOI:

10.3791/55304

⸱

March 16th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Department of Research, Jesse Brown VA Medical Center

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to the Authors section in: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D.

One of the authors' names was corrected from:

Arivarasu N. Anabazhagan

to:

Arivarasu N. Anbazhagan

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir beschreiben einfache Methoden der Regulierung der intestinalen Serotonintransporter zu studieren (SERT) Funktion und Expression einer in vitro Zellkulturmodell von Caco-2 - Zellen gezüchtet in 3D und eine ex - vivo - Modell der Maus - Darm verwendet wird . Diese Verfahren sind anwendbar auf die Untersuchung von anderen epithelialen Transportern.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Darmepithel hat wichtige Transport- und Barrierefunktionen, die Schlüsselrollen in normalen physiologischen Funktionen des Körpers spielen, während eine Barriere gegen Fremdpartikeln. Impaired epithelialen Transport (ion, Nährstoff oder Arzneimittel) wurden mit vielen Krankheiten verbunden und können Folgen haben, die über die normalen physiologischen Funktionen der Transportunternehmen, wie beispielsweise durch Beeinflussung epithelialen Integrität und den Darm microbiome verlängern. die Funktion und die Regulierung der Transportproteine ​​zu verstehen, ist für die Entwicklung von verbesserten therapeutischen Interventionen kritisch. Die größte Herausforderung bei der Untersuchung von epithelialen Transport entwickelt ein geeignetes Modellsystem, das wichtige Funktionen der nativen intestinalen Epithelzellen rekapituliert. Mehrere in vitro - Zellkulturmodellen, wie Caco-2, T-84 und HT-29-Zellen werden typischerweise Cl.19A in epithelialen Transport Forschung eingesetzt. Diese Zelllinien stellen einen reduktionistischen Ansatz zur Modellierung der epithelium und wurden in vielen mechanistische Studien verwendet worden, einschließlich der Prüfung der epithelial-mikrobiellen Wechselwirkungen. Allerdings Zellmonolayern genau nicht Zell-Zell - Interaktionen reflektieren und die in - vivo - Mikroumgebung. Die Zellen in 3D gewachsen sind, werden vielversprechende Modelle für Studien Arzneimittelpermeabilität gezeigt. Wir zeigen, dass Caco-2-Zellen in 3D verwendet werden können epithelialen Transporter zu studieren. Es ist auch wichtig, dass Studien in Caco-2-Zellen mit anderen Modellen ergänzt werden zellspezifische Effekte auszuschließen und die Komplexität des nativen Darm zu berücksichtigen. Mehrere Verfahren zuvor verwendet wurden, um die Funktionalität von Transportern, wie umgestülpte Sack und die Aufnahme in isolierten Epithelzellen oder in isolierten Plasmamembranvesikel zu beurteilen. Unter Berücksichtigung der Herausforderungen auf dem Gebiet in Bezug auf Modelle und die Messung der Transportfunktion, zeigen wir hier ein Protokoll Caco-2-Zellen in 3D zu wachsen und die Verwendung eines Ussingkammer als beschreibenwirksamer Ansatz Serotonin-Transport, wie in intakten polarisierten Darmepithelien zu messen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Darmepithel ist mit verschiedenen Transportproteine ​​(Kanäle, ATPasen, Co-Transporter und Austauscher) ausgestattet, die aus der Absorption von Nährstoffen reichen, Elektrolyten und Medikamente zur Sekretion von Flüssigkeit und Ionen in dem Lumen zahlreiche Funktionen ausführen. Transportproteine ​​erzeugen elektrochemischen Gradienten, der die Bewegung von Ionen oder Molekülen in vektorieller Weise ermöglichen. Dies wird durch die asymmetrische Verteilung der Verkehrssysteme in den apikalen und basolateralen Membranen polarisierter Epithelzellen erreicht. Zusätzlich tight junctions, die benachbarten Epithelzellen anbinden, eine wichtige Rolle in diesem Prozess ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Untersuchung der intestinalen Transporters in einer 3D-Kultursystem von Caco-2: Wachsende 3D Caco-2-Zellkultur auf einem Gelatinous Proteinmischung

  1. Auftau-Wachstumsfaktor gelatinösen Proteingemisch für 8 h auf Eis reduziert (oder O / N) bei 4 ° C. Nach dem Auftauen machen 1 ml oder 500 & mgr; l-Aliquots für die Anwendung oder bei -20 ° C für die spätere Verwendung.
  2. Am Tag der Kultur, vorzukühlen Die Kulturplatten (für RNA und Proteinextraktion) oder gekammert Folien (Immunfärbung) auf Eis. In 30 ul gallertartig Proteinmischung in jede Vertiefung einer acht gut chambered-Objektträger aus Glas (oder 120 & mgr; l pro Vertiefung einer 6-Well-Platt....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunfärbung in 3D Caco-2 Zysten ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein repräsentatives Bild eines XY-Ebene zeigt gut abgegrenzte Lumen in der 3D - Zyste gefärbt mit Phalloidin Aktin ist in 1A dargestellt. Die Seite, die dem Lumen zugewandt bezeichnet die apikalen Seite. Epithelialen Zellen in einer 3D Umgebung Ergebnis in einem robusten epithelialen Phänotyp. Verschiedene Caco-2 Zysten am Tag 12, wenn Aktin und SERT waren co-gefärbt, sind in 1B

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ausdifferenzierten Monolayern Caco-2 - Zell haben ausgiebig Darm Transport zu studieren 10, 11, 12, 13, 14, 15 als polarisierte epitheliale Monolayern verwendet worden. Um jedoch die physiologischen Organisation der intestinalen Epithelzellen zu imitieren, hat es ein beträchtliches Interesse an der Entwicklung eines Caco-2-K.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Herrn Christopher Manzella, MD/Doktorand im RKG-Labor, für seine Hilfe bei der Bearbeitung und dem Korrekturlesen unseres Manuskripts.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x PBSATCCATCC® HTB&schüchtern; 37&Handel;Zellen
10x PBSCarl ZeissMikroskop für konfokale Bildgebung
3[H]-5-HT LabtekII152453Kultivierung von Zellen für die Mikroskopie
5-HT Gibco70013-032Kein Gefahrstoff
95% O2- 5% CO2 ZylinderKPL71-00-27Kein Gefahrstoff
Agar (für Agarplatten)FischerBP151-100Akute Toxizität,
Ora-Agar (für Elektrode)SigmaG7126-1KGKein Gefahrstoff
Alexa Fluor PhalloidinSigmaC3867-1VLKein gefährlicher Stoff
Rinderserumalbumin (BSA)SigmaP6148-500GGesundheitsschädlich bei Verschlucken oder Einatmen
CaCl2LifeTechnologiesA12380Kein gefährlicher Stoff
Caco-2-ZellenSigmaA8806-5GKein gefährlicher Stoff
ZelllysepufferFischerBP337-100Kein gefährlicher Stoff Gefahrstoff
Chabered ObjektträgerSigmaS5886-1KGKein gefährlicher Stoff
Kollagen Typ-1 LösungSigmaS8045-500G
ElektrodenSigmaS-0876
EMEMGibco by Life Technologies25200-056
Fötales Rinderserum (FBS)Corning356234Verwendung als extrazelluläre Matrix
FluoxetinQiagen74104
GentamicinATCC30-2003Zellkulturmedien
GlycinCell Signaling, Danvers, MA
Hepes Roche11836145001
IndomethacinGibco von Life Technologies15070-063
K2HPO4Gibco von Life Technologies15710-064
KOHGibco von Life Technologies15630-080
L-AscorbinsäureGibco by Life Technologies10082147
FlüssigszintillationszählerGibco by Life Technologies70013--032
LSM710 MetaPhysiologic Instruments, San Diego, Kalifornien;EM-CSYS-8
MannitolPhysiologische Instrumente, San Diego, Kalifornien;P2304
MatrigelPhysiologische Instrumente, San Diego, Kalifornien;VCC MC8
MgCl2Physiologische Instrumente, San Diego, CA DM MC6
Mehrkanal-Spannungs-/Stromzangefür physiologische Instrumente, San Diego, Kalifornien;P2300
NaClPhysiologische Instrumente, San Diego, Kalifornien;P2023-100
NaClFisher Scientific, Hampton, NHBP1423
NaHCO3Sigma-Aldrich, St. Louis, MOS5886
Normales Ziegenserum (NGS, 10%)Fisher Scientific, Hampton, NHS233
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOP288
Pen-StrpSigma-Aldrich, St. Louis, MOC3881
Reagenz für ProteinassaysSigma-Aldrich, St. Louis, MO10420
Proteinase-Inhibitor-CocktailMEDOX, Chicago, IL Typ G-12300
RNA easy Mini-BausatzSigma-Aldrich, St. Louis, MOM4125
Einkanal-Elektrodeneingangsmodul Sigma-Aldrich, St. Louis, MOA92902
Schieber für Snapwell-KammernSigma-Aldrich, St. Louis, MOH9523
Natriumphosphat (Na2HPO4)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOF132
Natriumhydroxid (NaOH)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOT7039
TGF-β 1Perkin-Elmer, Waltham, MANFT1167250UC
Triton X-100Packard Instruments, Downers Grove, ILB1600
Trypsin EDTASigma-Aldrich, St. Louis, MO221473
Tween-20Bio Rad Laboratories, Hercules, CA5000006
Ussing Chamber (nur Kammer)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOI7378
Ussing Chamber SystemsSigma-Aldrich, St. Louis, MOA1296

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
  2. Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. B....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Caco 2 Cells3D CultureUssing ChamberSerotonin TransportEpithelial TransportIntestinal EpitheliumSERT ProteinWestern BlotImmunofluorescenceCell Culture

Related Articles