Kinetik der Verzögerungs-DNA-Synthese<em&gt; In Vitro</em&gt; Von den Bakteriophagen T7 Replikationsproteine

Zusammenfassung

Wir beschreiben sensitive, gelbasierte diskontinuierliche Assays, um die Kinetik der Verzögerungsstranginitiierung mit den Replikationsproteinen des Bakteriophagen T7 zu untersuchen.

Zusammenfassung

Hier stellen wir Protokolle für die kinetische Untersuchung der Spätstrang-DNA-Synthese in vitro durch die Replikationsproteine des Bakteriophagen T7 zur Verfügung. Das T7-Replisom ist eines der einfachsten bekannten Replikationssysteme, das aus nur vier Proteinen besteht, was für biochemische Experimente attraktiv ist. Besonderer Wert wird auf die Synthese von Ribonukleotid-Primern durch die T7-Primase-Helikase gelegt, die von der DNA-Polymerase zur Initiierung der DNA-Synthese verwendet werden. Da die Mechanismen der DNA-Replikation über die Evolution hinweg konserviert sind, sollten diese Protokolle für Forscher, die andere Modellsysteme verwenden, anwendbar oder als konzeptionelles Sprungbrett nützlich sein. Die hier beschriebenen Protokolle sind hochempfindlich und ein erfahrener Untersucher kann diese Experimente durchführen und in etwa einem Tag Daten für die Analyse erhalten. Das einzige Spezialgerät, das erforderlich ist, ist ein Schnellabschreckgerät, aber dieses Gerät ist relativ verbreitet und aus verschiedenen kommerziellen Quellen erhältlich. Zu den Hauptnachteilen dieser Assays gehören jedoch die Verwendung von Radioaktivität und der relativ geringe Durchsatz.

Einleitung

Die Replikation der DNA ist ein konserviertes Merkmal aller zellulären Lebens. Während die Identität und Anzahl der Replikationskomponenten in weiten Grenzen variieren, werden die allgemeinen Mechanismen für die Evolution ¹ geteilt. Hier beschreiben wir Gelbasis, diskontinuierliche kinetischen Experimenten, radioaktiven Substraten, dem Ziel, das Verständnis der Kinetik der nacheilenden Strang - DNA - Synthese in vitro durch Komponenten des T7 replisome. Die Replikationsmaschinerie des Bakteriophagen T7 ist sehr einfach, die aus nur vier Proteine (die DNA - Polymerase, GP5 und dessen Prozessivitätsfaktor, E. coli - Thioredoxin....

Protokoll

HINWEIS: Befolgen Sie alle institutionellen Bestimmungen für die sichere Verwendung und Entsorgung von radioaktivem Material, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Verwendung persönlicher Schutzausrüstung wie Handschuhe, Schutzbrille, Kittel und entsprechende Acryl Schilde.

HINWEIS: Der Standardpuffer besteht aus 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM Kaliumglutamat, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA (dieser Puffer wird bei einer 5-fach Konzentration vorgefertigten) und 0,3 mM jedes dNTP. T7 - Replikationsproteine werden gereinigt , wie beschrieben ^{8, 9, 10.} Ei....

Ergebnisse

Die Ergebnisse in Figur 1A gezeigt sind, wurden wie in Schritt 1 des Protokolls beschrieben erhalten, dh durch eine manuell Primer - Synthesereaktion durch gp4 unter mehreren Bedingungen Umsatz katalysierten Abtasten. Hier kann eine Reihe von Produkten nach der Gelelektrophorese unter Verwendung von CTP mit ³² P an der α-Position in Primer - Synthesereaktionen (Abbildung 1A) markiert beobachtet werden. Die markierte V.......

Diskussion

Der wichtigste Faktor, diese Experimente in der Durchführung ist die Verfügbarkeit von hoch aktiven gereinigten Enzyms. Während unserer Arbeit mit gp4 zum Beispiel haben wir festgestellt, dass die Lagerung des gereinigten Enzyms in Puffer (20 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT), enthaltend 50% Glycerin bei -20 ° C führt zu einer Reduktion in die spezifische Aktivität des Präparats über einige Monate. Daher wir nun Flash-freeze kleinen Aliquots von gereinigtem gp4 in 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Tris voreingestellte Kristalle pH 7,5	SIGMA	T4128
Tris Base	SIGMA	93362
L-Glutaminsäure Kaliumsalz Monohydrat	SIGMA	G1501
Magnesiumchlorid-Hexahydrat	Mallinckrodt Chemicals	5958-04
1,4-Dithiothreitol	J.T. Baker	F780-02
Natriumdodecylsulfat	MP Biomedicals	811030
(Ethylenedinitrilo) Tetraessigsäure, Dinatriumsalz, Dihydrat	Mallinckrodt Chemicals	4931-04
[α-32P] CTP	PerkinElmer	BLU508H	radioaktiv, Schutzmaßnahmen ergreifen
[γ-32P] ATP	PerkinElmer	BLU502A	radioaktiv, Schutzmaßnahmen
ergreifen 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Affymetrix	77100	vier dNTPs Teil des Sets
100 mM ATP und CTP	Epizentrum	Teil des NTP-Sets
ssDNA-Konstrukte	Integrated DNA	Technologies N/A	benutzerdefinierte Sequenzen
Methanol	Macron Feinchemikalien	3017-08
Formamid	Thermo Scientific	17899
Bromphenolblau	SIGMA	B8026
Cylene Xyanol	SIGMA	X4126
Acrylamid	SIGMA	A9099	Giftig
N,N′ -Methylenbisacrylamid	SIGMA	M7279	giftig
Harnstoff	Boston Bioproducts	P-940
Borsäure	Mallinckrodt Chemicals	2549
Rapid Quench-Flow Instrument	Kintek Corp.	RQF-3
Kintek Entdecker	Kintek Corp.	N/A
Kaleidagraph	Synergy Software	N/A

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