Kinetik der Verzögerungs-DNA-Synthese

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Kinetik der Primer- und der nachfolgenden DNA-Synthese zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der DNA-Replikation zu beantworten, beispielsweise wie Primer durch DNA-Primase gebildet, anschließend auf die DNA-Polymerase übertragen und von dieser genutzt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Identifizierung wichtiger Schritte während der Synthese von Okazaki-Fragmenten ermöglicht.

Da in diesem Experiment radioaktive Materialien verwendet werden, müssen alle institutionellen Vorschriften bezüglich des sicheren Umgangs und der Entsorgung radioaktiver Stoffe eingehalten werden. Geben Sie zunächst zwei Mikroliter Formamid-Färbe-Puffer in acht 1,5-Milliliter-Polypropylenröhrchen, entsprechend der Anzahl der zu analysierenden Zeitpunkte. Bereiten Sie danach ein 20-Mikroliter-Gemisch bestehend aus Puffer, ATP, CTP, mit P32 am Alpha-Phosphat markiertem CTP, Einzelstrang-DNA-Vorlage und dem Gen-vier-Protein oder GP-vier-Primase-Helikase vor.

Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Entfernen Sie nach fünf Minuten mit einer Pipette zwei Mikroliter der Mischung und mischen Sie sie mit zwei Mikrolitern Formamid-Färbe-Puffer in einem der zuvor vorbereiteten 1,5-Milliliter-Röhrchen. Dies ist die Negative-Kontrolle ohne Reaktion.

Fügen Sie zwei Mikroliter einer 0,1-molaren Magnesiumchloridlösung der Reaktionsmischung hinzu und starten Sie unmittelbar einen Timer. Entnehmen Sie in Abständen von 10 Sekunden manuell zwei Mikroliter der Reaktionsmischung und mischen Sie diese mit dem Formamid-Farbstoff in den 1,5-Milliliter-Röhrchen. Nachdem alle Zeitpunkte gesammelt wurden, erhitzen Sie die Proben fünf Minuten lang in einem Heizblock bei 95 Grad Celsius.

Geben Sie Aliquote der Proben zur Elektrophorese auf ein denaturierendes Gel auf. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Reaktionsgemische vorbereiten. Bereiten Sie 400 Mikroliter Lösung A, die Puffer, GP vier Hexamer, Einzelstrang-DNA-Vorlage, dNTPs, ATP, CTP und CTP, das am Alpha-Phosphatrest mit P32 markiert ist, enthält.

Stellen Sie 400 Mikroliter Lösung B her, die einen X-Puffer und 20 Millimolar Magnesiumchlorid enthält. Richten Sie anschließend das Schnellmisch-Gerät ein. Schalten Sie das Gerät ein und geben Sie nach dem Erscheinen des Hauptmenüs die Zahl sieben auf der Instrumententastatur ein, um den Spritzenantrieb in die Ausgangsposition zu bewegen.

Öffnen Sie die Puffer-Spritzenposition zum Befüllen. Füllen Sie die Spritze C mit der Quench-Lösung und anschließend die Pufferreservoirs A und B des Geräts mit Puffer, wobei Sie eine 10-Milliliter-Spritze verwenden. Entfernen Sie Luftblasen, indem Sie die Kolben hinein- und herausdrücken.

Verändern Sie die Knopfpositionen, um zu aktivieren. Drehen Sie am Knopf zwei, um die Position der Spritzenantriebsstange einzustellen. Drücken Sie die Taste „Anpassen nach unten“, um die Spritze abzusenken, bis Puffer aus der Ablaufschleife austritt.

Drücken Sie Escape, um zum Hauptmenü zurückzukehren. Um die Tubing zu spülen, schließen Sie die Auslassleitung an ein Vakuum an. Stellen Sie die Probeneinstellknöpfe zum Spülen um.

Stellen Sie die Knöpfe in die horizontale Position, um die Puffer-Spritze zu schließen. Schalten Sie das Vakuum ein, tauchen Sie die beiden Spülschleifen 10 Sekunden lang in Wasser und danach 10 Sekunden lang in Methanol. Trocknen Sie die Schleifen, indem Sie etwa 15 Sekunden lang Luft ansaugen oder bis sie trocken sind.

Um Proben aufzuladen, stellen Sie den Probenschalter auf „Load“ (Laden). Füllen Sie Lösung A in eine Ein-Milliliter-Spritze, stecken Sie die Spritze in einen der Probenaufgabestutzen. Auf dieselbe Weise wird Lösung B in den gegenüberliegenden Probenaufgabestutzen gegeben. Beginnen Sie die Erfassung der Zeitpunkte, indem Sie im Hauptmenü eine Eins eingeben, um einen Quench-Flow-Lauf zu starten.

Geben Sie die Reaktionszeit ein und drücken Sie die Eingabetaste. Die zu verwendende Nummer der Reaktionsrunde wird angezeigt. Wechseln Sie zu der erforderlichen Reaktionsrunde.

Nachdem das Rohr wie zuvor gezeigt gewaschen wurde, drehen Sie die Probenschalter auf „Laden“. Füllen Sie die Reaktionsgemische in die Probenschleifen, bis sie sich gerade außerhalb des zentralen Mischraums befinden. Drehen Sie alle Schalter auf „Zünden“ und vergewissern Sie sich, dass sich alle Schalter in der korrekten Position befinden.

Platzieren Sie ein 1,5-Milliliter-Gefäß an das Ende der Ausgangsschleife. Drücken Sie „Go“, um die Reaktion durchzuführen. Nach Wiederholung des Schlauchreinigungsverfahrens füllen Sie die Puffer-Spritzen A und B erneut auf, bis sie den Puffer-Spritzenantrieb erreichen.

Wiederholen Sie die Schritte zum Durchführen der Reaktion für jeden gewünschten Zeitpunkt, mit einer Ausnahme: Laden Sie keine Lösung B, wenn der Nullzeitpunkt-Kontrollansatz abgeschreckt wird. Wenn die Probenentnahme abgeschlossen ist, drücken Sie Escape, um zum Hauptmenü zurückzukehren. Drücken Sie sieben, um den Puffer-Spritzenpumpenantrieb in seine Ausgangsposition zurückzufahren.

Beginnen Sie mit der Reinigung des Instruments, indem Sie die Spritzen mit der Reaktionsmischung entfernen, und drehen Sie den Probenaufgabeknopf in die Ladeposition. Spülen Sie unter Vakuum jede Probenloop mit jeweils 10 Milliliter Natriumhydroxid, Phosphorsäure und Methanol. Drücken Sie alle drei Spritzenkolben nach unten, um die Reaktions- und Quenchpuffer zurückzuholen.

Spülen Sie die Spritzen mindestens zweimal mit fünf Milliliter Wasser. Füllen Sie die Spritzen erneut mit fünf Milliliter Wasser, drehen Sie die Regler in die Feuerstellung, schalten Sie das Vakuum ein und senken Sie den Kolben über den Tastaturbefehl, um das Wasser zu entfernen. Spülen Sie die Schläuche, wie zuvor gezeigt.

Zum Schluss schalten Sie das Schnell-Misch-Quench-Flow-Instrument aus. Die Proben werden anschließend wie im Textprotokoll beschrieben analysiert. Diese Ergebnisse wurden durch manuelle Entnahme von Proben aus einer Primer-Synthesereaktion erzielt, die durch GP vier unter Bedingungen mit mehrfacher Umsatzkatalyse katalysiert wurde.

Der markierte Vorläufer CTP zeigt die höchste Mobilität und wandert zum unteren Rand des Gels, gefolgt von langsamer wandernden Spezies, die dem Farbstoff und den von GP vier synthetisierten Tetraribonukleotiden entsprechen. Abhängig von der Inkubationsdauer und der Sequenzkontext des Templates können zusätzliche markierte Produkte, die höheren Oligomeren entsprechen, beobachtet werden. Wenn ein Schnellmischgerät verwendet wird, um die von GP vier katalysierte Reaktion in Zeitskalen im Bereich von Sekunden bis hinunter zu wenigen ms zu untersuchen, zeigt sich, dass die Akkumulation des Primers nicht linear verläuft, sondern ein biphasisches Profil aufweist, wie durch die durchgezogene Linie angegeben.

Dies deutet darauf hin, dass die Produktbildung schnell erfolgt und die Freisetzung im stationären Zustand geschwindigkeitsbestimmend ist. Die gestrichelte Linie stellt eine hypothetische Fortschrittskurve dar, die sich ergeben würde, wenn die Primerbildung durch GP vier nicht mit einem Vorzustands-Ausbruch verlief. Ein Einzelumsatz-Primer-Syntheseexperiment liefert Informationen über die Bildung und den Zerfall von Zwischenprodukt-Spezies während der Umwandlung von Substrat zu Produkt.

Ein Zeitverlauf der Tetramerbildung wird durch das Gelelektrophoresebild gezeigt. Der Graph zeigt die Bildung von Zwischenprodukten über die Zeit. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in 90 Minuten durchgeführt werden.

Es darf nicht vergessen werden, dass das Arbeiten mit radioaktiven Reagenzien äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie eine geeignete Abschirmung stets getroffen werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.