Multimer-PAGE: Ein Verfahren zum Erfassen und Auflösen von Proteinkomplexen in biologischen Proben

Summary

Verfahren zur Stabilisierung und Trenn nativen Proteinkomplexe aus unmodifizierten Gewebelysat gekoppelt, um ein Amin-reaktives Protein Vernetzers unter Verwendung von auf eine neuartige zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) -System dargestellt.

Abstract

Es gibt viele gut entwickelte Methoden zur Reinigung und einzelne Proteine ​​und Peptide zu studieren. Allerdings sind die meisten zellulären Funktionen von Netzwerken interagierender Proteinkomplexen durchgeführt, die oft schwierig zu untersuchen, da ihre Bindung nicht-kovalent und leicht durch Reinigungstechniken gestört. Diese Arbeit beschreibt ein Verfahren zur Stabilisierung und Trenn native Protein-Komplexe aus nicht-veränderten Geweben zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung von. Tissue-Lysat wird auf eine nicht-denaturierenden blau-native Polyacrylamidgel geladen, dann wird ein elektrischer Strom angelegt wird, bis das Protein, das eine kurze Strecke in das Gel wandert. Die Gelstreifen die migrierten Protein enthält, wird dann mit den aminreaktiven Vernetzungsreagenz Dithiobis (succinimidylpropionat), das kovalent Protein ausgeschnitten und inkubiert Komplexe stabilisiert. Die Gelstreifen vernetzten Komplexe enthalten, werden dann ein Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel eingegossen, und tEr komplexe sind vollständig getrennt. Die Methode beruht auf Techniken und Materialien, die den meisten Molekularbiologen vertraut sind, was bedeutet, dass es kostengünstig und leicht zu erlernen ist. Während es in seiner Fähigkeit, äußerst große Komplexe adäquat zu trennen, begrenzt ist und nicht allgemein erfolgreich war, war die Methode in der Lage, eine Vielzahl von gut untersuchten Komplexen zu erfassen und ist wahrscheinlich auf viele interessierende Systeme anwendbar.

Introduction

Normale zelluläre Funktion ist abhängig von Protein-Protein - Wechselwirkungen ^{1, 2.} Als Ergebnis werden menschliche Krankheiten , die oft durch Störungen in der Montage und Verhalten verschiedenen Proteinkomplexe ³ markiert. Die Fähigkeit, solche Interaktionen zu charakterisieren, ist daher von entscheidender Bedeutung. Aktuelle Mittel, um diese Wechselwirkungen zur Detektion erfordern Reinigung von Zielproteinen, die oft durch Pull-Down ihrer Interaktionspartner gefolgt. Herkömmliche Reinigung wird durch differentielle Zentrifugation, Präzipitation durchgeführt, und / oder Chro....

Protocol

1. Gewebepräparation

1. Herstellung von 10 ml der 4-fach BN-PAGE-Probenpuffer (200 mM Bis (2-hydroxyethyl) amino-tris (hydroxymethyl) methan (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40% w / v Glycerin, 0,004% Ponceau S, pH 7,2 ).
   HINWEIS: Diese Stammlösung im Voraus und bei 4 ° C durchgeführt werden kann.
2. Verdünnte 250 ul 4x Probenpuffer in 750 & mgr; l dH ₂ O , enthaltend 1x kommerziellen Protease - Inhibitor - Cocktail. Vortex und Chill auf Eis.
3. Homogenisiert 20 mg des Zielgewebes in den 1 ml 1x eiskalten BN-PAGE-Probenpuffern mit 30 Schlägen eines Dounce-Homogenisators sauber.
   HINWEIS: Für dieses Demonstrationsexperiment, das Z....

Results

In dieser Demonstration Experiment wurde Multimer-PAGE auf ganzem Rattenhirn-Lysat durchgeführt. Die resultierenden getrennten Proteine ​​wurden auf Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membranen geblottet und dann mit Antikörpern gegen Proteine ​​untersucht, die Komplexe sind dafür bekannt, zu bilden. Abbildung 1 zeigt eine Validierung des Protokolls durch zwei Mittel. Erstens, zeigen wir , dass die vernetzten Proteine durch Zugabe eines Reduktionsmittels abspaltbar sind, ist .......

Discussion

Protein-Protein-Wechselwirkungen sind wichtig für jede Aufgabe Lebewesen auszuführen. Aus diesem Grunde sind sie Gegenstand intensiver Prüfung und Forschung. Multimer-PAGE ist ein neues Verfahren für die Erfassung, trennt, und eine Vielzahl von Proteinkomplexen zu analysieren. Wir haben bereits gezeigt , seine Anwendbarkeit oligimerization des krankheitsassoziierten Protein α-Synuclein ¹¹ bis zu studieren. Jedoch ist es dehnbar zu vielen Proteinkomplexen, wie in Abbildung 2 gezei.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
ε-Aminocapronsäure	Sigma	A2504
Acrylamid	Acros Organics	164855000	giftig.
Acrylamid/Bisacrilamid 37,5:1 (40%T Stammlösung)	BioRad	161-0148	Giftig.
Ammoniumpersulfat	Sigma	A3678
Anti Kaninchen IgG-HRP von Ziege	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004
Bicinchoninsäure Assay Kit	Thermofisher	23225
Bis-tris	Sigma	B9754
Rinderserumalbumin	Sigma	A9647
Butanol	Fisher Scientific	A399-1
Chemilumineszenz-Substrat-Kit	ThermoFisher	24078
Coomassie blau G-250	Sigma-Aldrich	B0770
Digitonin	Sigma	D141	Toxisch.
Dimethylsulfoxid	Fisher Scientific	D128-1
Dithiobis (Succinimidylpropionat)	Thermo Scientific	22585
Trockenmilch	LabScientific	M0841
Glycerol	Sigma	G9012
Glycin	Fisher Scientific	BP381-5
Halt Proteasehemmer Cocktail	Thermofisher	78430
Salzsäure	Fisher Scientific	A144SI-212	Zur Titration. Ätzend.
Methanol	Fisher Scientific	A412-4	Für die Aktivierung von PVDF-Membranen. Giftig.
Monoklonales Anti-&-Alpha-Synuclein-IgG aus Kaninchen	Santa Cruz Biotechnology	sc-7011-R
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin	Sigma	T9281
N,N'-Methylenbisacrylamid	Acros Organics	16479	Toxisch.
NP40	Boston Bioproducts	P-872
Polysorbat 20 (Tween-20)	Fisher Scientific	BP337-500
Polyvinylidenfluorid-Transfermembranen	Thermo Scientific	88518
Ponceau S	Sigma	P3504
Kaliumchlorid	Fisher Scientific	P217-3
Kaliumphosphat monobasisches	Sigma	P9791
Proteasehemmer-Cocktail	Thermo Scientific	88265
SDS-Lösung (10 % w/v)	BioRad	161-0416
Natriumchlorid	Fisher Scientific	BP358-212
Natriumdodecylsulfat	Sigma	L37771
Natriumphosphat monobasisch	Fisher Scientific	BP329-1
Tricine	Sigma	T0377
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152-500
Tris-HCl (0,5 M Puffer, pH 6,8)	BioRad	161-0799
Tris-HCl (1,5 M Puffer, pH 8,8)	BioRad	161-0798
Name	Company	Katalognummer	Comments
Instruments
GE Imagequant LAS 4000	GE Healthcare	28-9558-10
ImageJ software	NIH
Synergy H1 Mikroplatten-Reader	BioTek
Gel Former + Ständer	Biorad
Microfuge 22R Zentrifuge	Beckman Coulter
2 mL dounce Homogenisator
Vortex-Mischer	Fisher Scientific
Ultraschall-Gewebehomogenisator	Fisher	Scientific FB120220