Qualitative und Quantitative Analyse der immun Synapse im menschlichen System mit Hilfe von Imaging Durchflusszytometrie

T-Zellen sind wichtige Regulatoren des adaptiven Immunsystems und Aktivierung durch Antigene Peptide, die im Zusammenhang mit der großen Histocompatibility komplexe (MHC) dargestellt werden. Vollständige T-Zell-Aktivierung erfordert zwei Signale, die Kompetenz-Signal über die Antigen-spezifische T-Zell-Rezeptor (TCR) / CD3-komplex und das costimulatory Signal über Zubehör-Rezeptoren. Beide Signale entstehen durch die direkte Interaktion der T-Zellen mit Antigen-präsentierenden Zellen (APCs). Reife APCs bieten das Kompetenz-Signal für die T-Zell-Aktivierung durch MHC-Peptid-komplexe, und sie drücken costimulatory Liganden (z. B., CD80 und CD86) um das Fortschreiten der T-Zell-Aktivierung-¹zu gewährleisten. Eine wichtige Aufgabe der Costimulation ist die Umstellung von Aktin Cytoskelett^2,3,4. Die kortikalen F-Aktin ist relativ statisch im ruhenden T-Zellen. T-Zell-Stimulation durch Antigen-Lager APCs führt zu eine tiefgreifende Neuordnung des Aktin-Zytoskeletts. Aktin Dynamik (d. h., schnell Aktin Polymerisation/Depolymerisation Kreise) ermöglichen die T-Zellen, Kräfte zu schaffen, die verwendet werden, um Proteine oder Organellen, zum Beispiel zu transportieren. Darüber hinaus ist das Aktin-Zytoskelett wichtig für die Entwicklung einer spezielle Kontaktzone zwischen T-Zellen und APCs, immun Synapse genannt. Aufgrund der Bedeutung des Aktin-Zytoskeletts zur immun Synapse ist es entscheidend für die Entwicklung von Methoden zur Quantifizierung von Veränderungen in der Aktin-Zytoskelett T Zellen^5,6,7,8 geworden. ^{, 9}.

Durch Aktin-Zytoskeletts Hilfe werden Oberflächen Rezeptoren und Signalproteine in supramolekularen Aktivierung Clustern (SMACs) innerhalb der immun Synapse getrennt. Die Stabilität der immun Synapse ist durch die Bindung von Rezeptoren zu F-Actin-Bündel gewährleistet, die die Elastizität des Aktin-Zytoskeletts zu erhöhen. Immun Synapse Bildung hat sich gezeigt, für die Generation der adaptiven Immunantwort kritisch zu sein. Die nachteiligen Auswirkungen einer fehlerhaften immun Synapse-Formation in-vivo wurden zuerst bei Patienten aus Wiskott Aldrich Syndrom (WAS), eine Krankheit, bei welcher Aktin-Polymerisation realisiert und begleitend sind immun Synapse Bildung gestört¹⁰ . WAR, dass Patienten leiden können Ekzeme, schweren rezidivierenden Infekten, Autoimmunerkrankungen und Melanome. Trotz dieser Feststellung ist derzeit nicht bekannt, ob immun Synapse Bildung unterscheidet sich in den T-Zellen von gesunden Probanden und Patienten immun Mängel oder Autoimmunerkrankungen leiden.

Höchstauflösung Mikroskopie, Fluoreszenz-Mikroskopie, konfokale einschließlich und TIRF wurden verwendet, um die Architektur der immun Synapse^11,12,13,14aufzudecken. Die hohe Auflösung dieser Systeme und die Möglichkeit der Durchführung live Cell Imaging ermöglicht die Sammlung von exakten, räumlich-zeitliche Informationen über dem Aktin-Zytoskelett und Oberfläche oder intrazelluläre Proteine in der immun Synapse. Viele Ergebnisse basieren jedoch auf der Analyse von nur ein paar Dutzend T-Zellen. Darüber hinaus müssen die T-Zellen für diese Art von Fluoreszenzmikroskopie gereinigt werden. Für viele Fragestellungen ist jedoch die Verwendung von ungereinigten Zellen anstatt die höchstmögliche Auflösung von größter Bedeutung. Dies ist relevant, wenn T-Zellen von Patienten analysiert werden, da die Menge des gespendeten Blutes begrenzt ist und möglicherweise die Notwendigkeit, viele Proben parallel zu verarbeiten.

Wir haben mikroskopische Methoden, mit denen die Analyse des Aktin-Zytoskeletts in der immun Synapse im menschlichen System^15,16,17. Diese Methoden basieren auf imaging Durchflusszytometrie, auch genannt In Flow-Mikroskopie-¹⁸. Als Hybrid zwischen multispektralen Flow-Zytometrie und Fluoreszenz-Mikroskopie, Durchflusszytometrie imaging hat seine Stärken in der Analyse morphologischen Parametern und Protein-Lokalisierung in heterogenen Zellpopulationen wie Pan-Leukozyten aus der peripheren Blut. Wir haben eine Methode, die ermöglicht, F-Aktin in T-Zelle/APC Konjugate von menschlichen T-Zellen aus Vollblut Proben, ohne Zeit- und kostenintensive Reinigung Schritte¹⁷quantifizieren eingeführt. Die hier vorgestellten Technik umfasst den gesamten Workflow, davor die Blutprobe auf die Quantifizierung der F-Aktin in der immun Synapse.

1. Vorbereitung des Pan-Leukozyten

1. Ziehen Sie 1 mL peripherem Blut von einem gesunden Spender (oder Patienten) in einer heparinisierten Spritze. Achten Sie darauf, die Zustimmung der zuständigen Ethikkommission für die Blutspende haben.
2. Mix 1 mL der menschlichen peripheren Blut mit 30 mL ACK Lyse Puffer (150 mM NH₄Cl, 1 mM KHCO₃und 0, 1 mM EDTA, pH 7,0) in einem 50 mL-Tube und 8 min bei Raumtemperatur inkubieren.
3. Füllen Sie die Rohre mit PBS und Zentrifuge bei 300 X g für 6 min. Aspirat überstand und Aufschwemmen Sie das Pellet in 30 mL ACK Lyse Puffer.
4. Wiederholen Sie die Schritte 1.2 und 1.3, bis der Überstand klar ist. Schließlich waschen Sie die Zellen mit PBS-Puffer, Zentrifuge bei 300 X g für 6 min. bei Raumtemperatur und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 2 mL Kulturmedium (RPMI1640 + 10 % FCS). Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C für 60 min.

2. Laden der Raji Zellen mit SEB

1. Bereiten Sie zwei 15 mL Falcon Röhren mit 1,5 x 10⁶ Raji Zellen pro Röhre. Spin-down der Zellen (300 X g für 6 min bei Raumtemperatur) und den Überstand verwerfen.
2. Aufschwemmen der Zellen in passives Medium (ca. 50 – 100 µL), fügen Sie 1,9 µL (1,9 µG) SEB, Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min. Add 5 mL Kulturmedium, spin-down der Zellen (300 X g für 6 min bei Raumtemperatur) und das Pellet in Kulturmedium (RPMI Aufschwemmen 1640 + 10 % FCS) bei einer Dichte von 1 x 10⁶ Zellen/mL.

(3) Induktion von immun Synapsen und Färbeprotokoll

1. Die Vorbereitung der SEB geladen Raji Zellen in ein FACS-Rohr und 500 µL der Vorbereitung des unbelasteten Raji Zellen in einer anderen FACS Rohr 500 µL Pipette. Jedes Rohr und Spin-down der Zellen (300 X g für 10 min bei Raumtemperatur) 650 µL der Pan-Leukozyten hinzufügen. Den Überstand verwerfen und erneut das Pellet in 150 µL Kulturmedium (RPMI1640 + 10 % FCS). Inkubation bei 37 ° C (in der Regel für 45 min).
2. Sanft Wirbel der Zellen (10 s bei 1.000 u/min) und 1,5 mL Paraformaldehyd (1,5 %) während der Wirbel um die Zellen zu beheben. Stoppen Sie die Fixierung durch Zugabe von 1 mL PBS + 1 % BSA. Pellet-Zellen (300 X g für 10 min bei Raumtemperatur und Wiederfreisetzung Zelle Pellet in 1 mL PBS + 1 % BSA nach Inkubation bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
3. Pellet (300 X g für 10 min bei Raumtemperatur) und Aufschwemmen der Zellen in 100 µL PBS + 1 % BSA + 0,1 % Saponin für 15 min bei Raumtemperatur die Zellen permeabilize (96-Well-Platte, U-Form).
4. Waschen Sie die Zellen in PBS + 1 % BSA + 0,1 % Saponin mit Zentrifugation (300 X g für 10 min bei Raumtemperatur) und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 50 µL PBS + 1 % BSA + 0,1 % Saponin enthalten Fluorophor radioaktiv markierten Antikörper oder Verbindungen (CD3-PE-TxRed (01:30), Phalloidin-AF647 (1: 150) und DAPI (1:3 000)).
5. Inkubieren Sie den Zellen bei Raumtemperatur im Dunkeln für 30 min. Waschen die Zellen 3 Mal durch Zugabe von 1 mL PBS + 1 % BSA + 0,1 % Saponin. Zentrifugieren Sie bei 300 X g für 10 min bei Raumtemperatur. Re-Zellen in 60 µL PBS für bildgebende Durchflusszytometrie aufzuwirbeln.

4. mit einem Durchflusszytometer Bildaufnahme

Hinweis: Das folgende Bild Erwerb Verfahren und Datenanalyse basieren auf imaging Durchflusszytometrie mit einer Software wie Imagestream (IS100), INSPIRE und Ideen. Jedoch kann auch andere fließen Cytometers und Analyse-Software verwendet werden.

1. Öffnen Sie die Analyse-Software auf dem Computer angeschlossen, der bildgebenden Durchflusszytometer und initialisieren Fluidics des Menüs "Instrument" anklicken. Tragen Sie die Perlen auf den richtigen Anschluss, wenn Sie dazu aufgefordert werden.
2. Laden Sie die Standardvorlage aus dem Menü "Datei" und klicken Sie auf Run/Setup. Wählen Sie Perlen aus dem Dropdown-Menü "Ansicht".
3. Anpassen der Hellfeld Beleuchtung durch Anklicken Intensität eingestellt, wenn der angezeigte Wert unter 200 liegt.
4. Führen Sie die Kalibrierung und testen Sie Routine in der Registerkarte "Assist" zu, indem Sie auf alle starten.
5. Klicken Sie auf Flush/Lock/Load und wenden Sie die Proben in den linken Anschluss wenn dazu aufgefordert werden. Nach dem Laden der Zellen in das Durchflusszytometer, öffnen der Zelle Sichter und passen Sie die Werte wie folgt: Peak Intensität Obergrenze bei 1.022 für jeden Kanal, Peak Intensität Untergrenze bei 50 für Kanal 2 (DAPI) und Kanal 5 (CD3-Pe-TxR) Bereich Untergrenze bei 50 für Kanal 1 (Side Scatter) und die Obergrenze bei 1500.
6. Ändern Sie die Erregung Laserleistung auf 405 nm (15 mW), 488 nm (200 mW), und 647 nm (90 mW) in der Registerkarte "Setup".
7. Wechseln Sie die Ansicht Dropdown-Menü zwischen Zellen und Perlen, die Zelle Sichter und Laser macht Anpassungen zu bewerten.
   Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle Zellen und Zellen Paare der Zelle-Ansicht befinden und Zelle Klumpen, Schutt und Bilder mit gesättigten Pixel in der Trümmer gefunden werden, durch eine Änderung der Zelle Klassifikatoren und/oder die Erregung Laserleistungen.
8. Definieren der Probenname und der Menge an Bildern zu erwerben (15.000 – 25.000 für Proben) und 500 für Entschädigung Steuerelemente in die Registerkarte "Setup" klicken Sie auf Run/Setup um die Übernahme zu starten.

(5) Datenanalyse

1. Übertragen Sie die raw-Bilddateien (.rif) auf der Daten-Analyse-Computer, und öffnen Sie die Analysesoftware.
2. Eine Vergütungsmatrix nach den Anweisungen der Entschädigung Dropdownliste zu produzieren. Speichern Sie die Vergütungsmatrix als comp_Date.ctm.
3. Öffnen einer Beispieldatei raw-Bild (.rif) und der comp_Date.ctm im Fenster, das angezeigt wird, die kompensierte Bilddateien (.cif) und die Standard-Daten-Analyse-Datei (haben.DAF) zu produzieren.
4. Kompensierten Image-Datei zu öffnen. Konvertieren Sie die Bilder in Farbmodus und passen Sie die Lookup-Tabellen um optimale sichtbaren Farben in der Symbolleiste Bild Galerie Eigenschaften zu erhalten. Erhalten Sie ein RGB-fusionierte Bild Composite auf der Registerkarte der Galerie Bildeigenschaften Symbolleiste.
5. Öffnen Sie die Maske-Manager aus der Dropdown-Liste Analyse. Erstellen Sie Masken, die T-Zellen und immun Synapse, wie folgt zu bestimmen:
   1. Wählen Sie die T-Zell-Maske: "(Fill (Threshold_Ch05, 60)." Wählen Sie die Tal-Maske: "Valley(Ch02,3)." Wählen Sie die T-Zell-Synapse-Maske: "T-Zell-Maske und Tal (M02, Ch02, 3)."
6. Öffnen Sie den Feature-Manager aus der Dropdown-Liste Analyse. Berechnen Sie die folgenden Funktionen:
   1. Wählen Sie für den gesamten CD3 Ausdruck in T-Zellen "Intensity_T-cells_Ch5." Wählen Sie für den Gesamtbetrag der F-Aktin in den T-Zellen "Intensity_T-cells_Ch6." Wählen Sie für CD3 Ausdruck in der immun Synapse "Intensity_T-Cell synapse_Ch5." Für den Betrag von F-Aktin in der immun Synapse wählen Sie "Intensity_T-Cell synapse_Ch6."
   2. Um die T-Zell-Fläche zu berechnen, wählen Sie "Area_T-Zellen." Um die T-Zell-immun Synapse-Fläche zu berechnen, wählen Sie "Area_T-Zelle Synapse."
7. Bestimmen Sie die F-Aktin und CD3 Bereicherung in der immun Synapse mithilfe der Gleichung in der Feature-Manager:
   
8. Gelten die folgende gating Strategie mithilfe Histogramme und Dot Grundstücke aus dem Analyse-Bereich (für weitere Details, siehe Referenzen 17 und 19):
   1. Entsorgen Sie Out-of-Focus Zellen durch Plotten "Gradient RMS_M2_Ch2" in einem Histogramm; setzen Sie den Schwellenwert um 15 Uhr.
   2. Der SSC versus CD3 Intensität in einem Dot Plot Plot. Legen Sie ein Tor auf CD3-positiven Ereignisse.
   3. Plot der "Seitenverhältnis" M02 (DAPI Fleck) im Vergleich zu dem Gebiet der M02 (Dapi Fleck). Tor auf T-Zell-Unterhemden und Zelle Paare entsprechend. Korrigieren Sie für echte Zelle Paare mit dem Bereich der Synapse Maske, wie zuvor beschrieben^17,19.
   4. Bestimmen Sie die Höhe der F-Aktin in Unterhemden T-Zellen und T-Zellen der T-Zelle/APC Paare und die Prozent der F-Aktin in der immun Synapse.

Ein wesentliches Ziel des hier beschriebenen Verfahrens ist die Quantifizierung der Proteinanreicherung (z. B., F-Aktin) in der immun Synapse zwischen surrogate APCs (Raji Zellen) und T-Zellen im ungereinigten Pan-Leukozyten niedrig-Volumen (1 mL) menschlichen Blutproben entnommen. Der Screenshot in Abbildung 1 gibt einen Überblick über die kritischen gating Strategie dieser Methode. Es zeigt die Bildergalerie auf der linken Seite und die Analyse-Bereich auf der rechten Seite (Abbildung 1). Die Bildergalerie zeigt das Tor "In Focus". Die dargestellten Bilder sind vor allem Granulozyten und zwei T-Zelle/APC-Paare. F-Aktin und CD3 sind in paar Handynummer 30272 bereichert. Die gating-Strategie, die Höhe der Zelle Paare mit derartigen Bereicherung zu quantifizieren ist im Analysebereich dargestellt und wird im Protokoll beschrieben (siehe Schritt 5,8) oder anderswo17,19. Die letzte Dot-Plot im Analysebereich zeigt den Betrag (Prozent Eiweiß) des CD3 (x-Achse) und F-Aktin (y-Achse) in der immun Synapse. Wenn mehr als 30 % des Proteins innerhalb der Maske immun Synapse befand, galt es als Proteinanreicherung immun Synapse-20. Dot Grundstücke mit Anreicherung von Daten verwendet wurden, um eine typische Endergebnis (Abbildung 2A). Die Bilder auf der linken Seite zeigt Beispielbilder der T-Zelle/APC-Konjugate mit geringen Mengen an CD3 und F-Aktin in der immun Synapse, während auf der rechten Seite, T-Zelle/APC-Konjugate mit einer starken Anreicherung von CD3 und F-Aktin dargestellt werden. Die Höhe der CD3 an immun Synapse (Prozent Eiweiß) wird auf der x-Achse gezeichnet, und die Menge der F-Aktin an der immun Synapse ist auf der y-Achse aufgetragen. Der Prozentsatz in das Tor entspricht dem Betrag der T-Zellen, die eine Bereicherung der CD3 und F-Aktin an der immun Synapse in Anwesenheit einer Superantigen haben. In Ermangelung von Superantigen zeigte 15 % Prozent der T-Zellen eine Bereicherung an der immun Synapse CD3 und F-Aktin. Die Anzahl der Zellen erhöht auf 29 % im Beisein von Superantigen. Eine einzelne Quantifizierung der CD3 Bereicherung (Abb. 2 b) oder F-Aktin Bereicherung (Abbildung 2) zeigt die Anwesenheit und Abwesenheit von Superantigen. Diese Ergebnisse zeigen, dass in der Abwesenheit von Superantigen, 18,3 ± 3,5 % und im Beisein von Superantigen, 34,3 ± 4,0 % des Gesamtbetrags F-Aktin in den Zellen an der immun Synapse angesammelt wurden. Interessanterweise gab es bereits CD3 Ansammlung in der Abwesenheit von Superantigen (16,6 ± 2,1 % des Gesamtbetrags CD3), die durch die Zugabe von Superantigen (24,6 ± 3,0 % des Gesamtbetrags CD3) deutlich erhöht wurde. Diese Methode erlaubt die Quantifizierung von wie viel Protein an der immun Synapse zwischen T-Zellen und APCs akkumuliert wird.

Abbildung 1: Strategie zur Identifikation des immun Synapsen im Pan-Leukozyten Vorbereitungen Gating. Die Abbildung zeigt einen Screenshot der Software und enthält einen vollständige Analyse-Workflow für die Bewertung der CD3 und F-Aktin Anreicherung in der immun Synapse von T-Zellen zu APCs im Beisein von SEB konjugiert. Werden die Bilder in der Bildergalerie auf der linken Seite (Ch2 = DAPI; Ch5 = CD3-PETxR; CH6 = Phalloidin AF647; und verschmelzen = kombinierte Bild mit Ch2, Ch5 und Ch6). Die Software bietet eine Anzeige Bildsymbolleiste für Lookup-Tabellen, Maske Display und Farbe/Graustufen-Modus anpassen. Der Rechte Teil der Abbildung zeigt die Analyse-Bereich und Analyse-Symbolleiste. Die Analyse-Bereich enthält Histogramme und Dot Grundstücke wie folgt: 1) Histogramm, Zellen im Fokus nach der gradient RMS Merkmal der DAPI-Färbung zu finden. (2) gating auf T-Zellen nach dem Ausdruck von CD3 (Intensity_MC_Ch05, x-Achse) und die Streuung Seitenprofil (Intensity_MC_Ch01, y-Achse). (3) Herbeirufung auf potenzielle T-Zelle/APC Paare nach dem Seitenverhältnis des DAPI-Fleck (Aspekt ratio_M02, y-Achse) und die Streuung Seitenprofil (Intensity_MC_Ch01, x-Achse). (4) gating auf wahre T-Zelle/APC-Paare nach der Gegend Synapse Maske (x-Achse) und den Bereich der CD3 Fleck (y-Achse). (5) gating auf Reife immun Synapsen definiert durch Anreicherung (> 30 % Proteingehalt in der Schnittstelle) von CD3 (x-Achse) und F-Aktin (y-Achse) in der immun Synapse. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.<!--

Abbildung 2: Flow Cytometry Bilddaten auf CD3 und F-Aktin Bereicherung in der immun Synapse. (A) den Punkt Grundstücke in der Mitte zeigt den Prozentsatz der CD3 (x-Achse) und F-Aktin (y-Achse) in der immun Synapse. T-Zelle/APC konjugiert mit einer ausgereiften immun Synapse in Abwesenheit (oberer Teil) oder Präsenz (unterer Teil) der SEB sind dargestellt. Die Bilder auf der linken zeigen Paare T-Zelle/APC mit einem niedrigen Grad an CD3 und F-Aktin Bereicherung, wohingegen die Bilder auf der rechten Seite T-Zelle/APC-paar mit einem hohen Maß an CD3 und F-Aktin Bereicherung (Reife immun Synapse) anzeigen. Maßstabsleiste = 10 µm (unten links). Das Ergebnis ist Vertreter von drei unabhängigen Experimenten. (B-C) Meine CD3 (B) oder F-Aktin (C) Bereicherung in der immun Synapse in das Vorhandensein oder Fehlen von SEB erscheint als Prozent Eiweiß (n = 3; (SE). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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