Die Verwendung von Trace Eyeblink klassische Konditionierung hippocampale Funktionsstörung in einem Rattenmodell der Fetal Alcohol Spectrum Disorders bewerten

Zusammenfassung

Spur Eyeblink klassische Konditionierung (ECC) wurde verwendet, um zu beurteilen hippocampal-abhängige assoziativen Lernens bei erwachsenen Ratten, die eine hohe Konzentration (11,9 % V/V) von Alkohol während der frühen Entwicklung des Neugeborenen Gehirns verabreicht. ECC-Verfahren sind in der Regel fundierte Diagnose-Tools zur Erkennung von Funktionsstörungen des Gehirns über viele psychologische und biomedizinische Einstellungen.

Zusammenfassung

Neugeborene Ratten verabreicht wurden eine relativ hohe Konzentration von Ethylalkohol (11,9 % V/V) während der postnatalen Tagen 4-9, eine Zeit des fetalen Gehirns organisatorischen Wandel unterzogen und ist ähnlich wie beschleunigte Veränderungen im Gehirn, die während des dritten Trimesters beim Menschen auftreten. Dieses Modell der fetale Alkohol-Spektrum-Störungen (FASDs) produziert schwere Hirnschäden, imitiert den Betrag und das Muster der Alkoholexzesse, die in einige alkoholische schwangeren auftritt. Wir beschreiben die Verwendung von Trace Eyeblink klassische Konditionierung (ECC), ein höherer Ordnung-Variante des assoziativen Lernens, langfristige hippocampal Dysfunktion beurteilen, die in der Regel bei Erwachsenen Nachkommen Alkohol ausgesetzt gesehen wird. In 90 Tage alt Nagetiere bereiteten sich chirurgisch mit Aufnahme und stimulierende Elektroden, die elektromyographische (EMG) gemessen blinken Aktivität aus dem linken Augenlid Muskel und leichten Schock posterior auf dem linken Auge, bzw. geliefert. Nach einer 5-Tage Erholungszeit unterzog sie 6 Sitzungen der Ablaufverfolgung ECC zu bestimmen, assoziativen Lernens Unterschiede zwischen Alkohol ausgesetzt und Ratten zu kontrollieren. Trace ECC ist eines der vielen möglich ECC-Verfahren, die leicht geändert werden können mit der gleichen Ausrüstung und Software, so dass verschiedene neuronale Systeme beurteilt werden können. ECC-Verfahren können im Allgemeinen als Diagnose-Tools verwendet werden, für die Erkennung von neuronalen Pathologie in verschiedenen Gehirn-Systeme und andere Bedingungen, die das Gehirn zu beleidigen.

Einleitung

Es ist kaum vorstellbar, dass der Alkoholmissbrauch in der heutigen Zeit bei besserer Gesundheitsversorgung und verbesserter Zugänglichkeit zu Gesundheitsdiensten weiterhin ein globales Gesundheitsproblem von großer Bedeutung darstellt. Leider hat sich gezeigt, dass eine schwangere Frau, die eine hohe Menge Alkohol konsumiert, ein Kind mit schweren Hirnschäden und lebenslang andauernden neuroentwicklungsstörungen zur Welt bringen kann, wie sie bei Betroffenen mit fetalem Alkoholsyndrom (FAS) offensichtlich sind^1,2,3. Bei Frauen mit nachgewiesener Vorgeschichte mütterlichen Alkoholkonsums ist der sich entwickelnde Fötus ebenfalls geringen Alkoholmengen oder unterschiedlichen Trinkmustern ausgesetzt, die variierende Blutalkoholkonzentrationen hervorrufen. In diesem letzteren Fall zeigen die Kinder möglicherweise nicht die schweren morphologischen oder neurobehavioralen Störungen, die bei FAS auftreten, dennoch können sie lebenslange kognitive Beeinträchtigungen und emotionale Störungen aufweisen, die von leicht bis schwer reichen^3,4. Insgesamt bilden FAS und weniger schwere Formen pränataler, alkoholbedingter Störungen eine Gruppe sogenannter fetaler Alkoholspektrumstörungen (FASD). Es überrascht nicht, dass FASD vollständig vermeidbar sind, doch verblüffenderweise zeigen Schätzungen, dass sie in Populationen, in denen Alkoholmissbrauch weit verbreitet ist, weiterhin die wichtigste nicht-genetische Ursache für neuronale und kognitive Behinderungen darstellen und etwa 2 % bis 5 % der jungen Kinder in den USA sowie in europäischen Ländern wie Frankreich und Schweden betreffen. Bezüglich der Inzidenz allein von FAS in den USA liegt die Prävalenz bei 2 bis 7 Fällen pro 1.000 Lebendgeburten⁵, was darauf hindeutet, dass die Gesamtinzidenz von FASD deutlich höher ist als die von FAS.

Neuroimaging-Studien an Kindern mit FASD haben gezeigt, dass sie Gehirnveränderungen aufweisen, wie beispielsweise einen dünneren Balken (Corpus callosum)⁶, einen kleineren vorderen Kleinhirnwurm (anterior cerebellar vermis)⁷ und eine kleinere Hippocampusregion⁸. Diese strukturellen Gehirnveränderungen liegen einigen der langfristigen neurokognitiven Störungen zugrunde, die bei Kindern mit FASD beobachtet werden. Die genauen Zusammenhänge zwischen mütterlichem Alkoholkonsum verursachten Gehirnveränderungen und den Unterschieden im Profil (d. h. Art, Ausmaß) bestimmter neurokognitiver Beeinträchtigungen sind bisher noch nicht eindeutig geklärt. Als Ausgangspunkt eignet sich jedoch der Hippocampus hervorragend, um seine Anfälligkeit gegenüber pränatalen Alkoholeffekten zu untersuchen. Tatsächlich weisen Kinder mit FASD Defizite in Verhaltensweisen auf, die vom Hippocampus vermittelt werden, wie beispielsweise das Erlernen räumlicher Positionen^9,10 und verzögertes Wiedererkennen von Objekten¹¹.

Nagermodelle von FASDs haben sich als äußerst wertvoll erwiesen, um die Mechanismen aufzuklären, die zu den neurokognitiven Störungen bei Kindern mit FASDs führen. Ein etabliertes Modell der Binge-Exposition, das wir übernommen haben, beinhaltet die Verabreichung von Alkohol an Ratten während der postnatalen Tage 4–9.^12,13, eine Phase, in der das Gehirn eine rasche Bildung von Synapsen und dendritischen Kontakten durchläuft, vergleichbar mit der 24. Schwangerschaftswoche des Menschen und sich bis in die 3^rd Trimester^14,15,16,17Dieses spezielle Modell induziert einen signifikanten Verlust von Hippocampus-Neuronen^18,19 und Neuronen in vielen anderen Gehirnregionen wie dem Kleinhirn^{12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23}, begleitet von schweren Beeinträchtigungen kognitiver Funktionen in verschiedenen Bereichen^21,24,25. Kognitive Störungen durch frühe Alkoholexposition bei Ratten können auf verschiedene Weisen untersucht werden, insbesondere mit klassische konditionierte Augenlidreflexbedingung (ECC). ECC ist ein Paradigma, das seit über einem Jahrhundert verwendet wird, um die grundlegenden Mechanismen des Lernens wissenschaftlich zu untersuchen.^26,27 und bietet somit eine nützliche Methode, um die nachteiligen neurokognitiven Folgen, die durch alkoholische Exposition im Fötus entstehen, besser zu verstehen. Es handelt sich um ein sehr flexibles Paradigma, das es Forschern ermöglicht, eine Vielzahl unterschiedlicher ECC-Verfahren anzuwenden, wobei jedes dieser Verfahren an zahlreichen Säugetierarten entlang der phylogenetischen Skala (von Mäusen bis zum Menschen) und zu verschiedenen Phasen der Gehirnentwicklung untersucht werden kann.^28,29,30,31Darüber hinaus werden die grundlegenden neuronalen Schaltkreise, die assoziatives Lernen in diesem Paradigma vermitteln, durch experimentelle und neuropsychologische Befunde bei denselben Arten gestützt.^{26,32,33,34,35,36,37}.

Eine Form der klassischen konditionierten Konditionierung (ECC), die sogenannte Spuren-ECC, wird in dieser Arbeit dargestellt (Abbildung 1). Zum besseren Verständnis wird sie mit der traditionelleren Form – der Verzögerungs-ECC – verglichen. Das ECC-Paradigma orientiert sich an der klassischen Konditionierung mit Hunden, wie sie erstmals vom Nobelpreis-trächtigen Physiologen Ivan Pavlov durchgeführt wurde. Pavlov entdeckte, dass bestimmte Reize wie Töne normalerweise keine Speichelflussreaktion hervorrufen, dass jedoch, wenn der Ton vor und zeitlich überlappend mit der Futtergabe präsentiert wird, die Speichelsekretion durch wiederholte Darbietung beider Reize verstärkt werden kann, sofern diese Ton-Futter-Kontingenz aufrechterhalten wird. Dies ist ein Beispiel der Verzögerungs-ECC, bei der die assoziative Stärke durch die unmittelbare zeitliche Kontiguität zwischen beiden Reizen vermittelt wird, wodurch die Lernbedingungen für das Tier optimal sind. Er testete auch andere Variationen der Ton-Futter-Kontingenz, beispielsweise indem er den Ton ausschaltete und eine „Spur“-Phase verstreichen ließ, bevor das Futter gegeben wurde. Wenn diese beiden Reize hinreichend diskontinuierlich waren, fiel es den Hunden deutlich schwerer, Speichelflussreaktionen vor der Futtergabe zu zeigen. Die zeitliche Diskontinuität zwischen dem Ausschalten des Tons und der Futtergabe stellt somit ein Beispiel der Spuren-ECC dar. Da Nagetiere nicht spontan auf die Anwesenheit von Futter mit Speichelfluss reagieren, werden arttypischere Reize wie ein leichter Schock verwendet; außerdem zeigen sie nicht natürlicherweise eine defensiv-blinzelnde Augenreaktion auf Töne. Vor diesem Hintergrund beinhalten Nagetier-ECC-Verfahren die Präsentation eines Tons auf einem bestimmten Dezibelpegel, der in bestimmter Weise mit einem leichten Schock an den Augenlidmuskel (orbicularis oculi) oder den temporalis-Muskel gekoppelt wird, um eine Augenblicksreaktion hervorzurufen. Der Ton gilt als konditionierter Reiz (CS), während der Schock als unkonditionierter Reiz (US) gilt. Bei der Verzögerungs-ECC wird der CS zuerst präsentiert; dieser Reiz bleibt für eine bestimmte Dauer aktiv. Danach wird der US appliziert. Beide Reize überlappen für eine gewisse Zeit und enden gleichzeitig; die resultierende Augenblinzelform, die durch den US hervorgerufen wird, wird als unkonditionierte Reaktion (UR) bezeichnet. In diesem Verfahren lernen die Nagetiere, Augenblinzelformen nach der Präsentation des CS, aber kurz vor dem US, auszulösen, um diesen aversiven Reiz vorherzusehen. Die erlernte Augenblinzelform wird als konditionierte Reaktion (CR) bezeichnet. Bei der Spuren-ECC sind der CS und der US durch eine reizfreie Zeitspanne getrennt, die als Spur-Intervall bekannt ist; sie überlappen zeitlich nicht wie bei der Verzögerungs-ECC. Während dieses Intervalls muss das Tier die assoziativen Anforderungen zwischen den Reizen verarbeiten. Ähnlich wie bei der Verzögerungs-ECC tritt Lernen auf, wenn das Tier konsistent eine Blinzelform nach dem Ausschalten des CS, aber unmittelbar vor der Applikation des US, zeigt. Über eine gewisse Anzahl von Akquisitionsdurchgängen (CS gepaart mit US) entwickeln sich Lernkurven (z. B. basierend auf verschiedenen CR-Messungen). Läsions- und Neurobildgebungsstudien zeigen, dass erfolgreiches Lernen in der Verzögerungs-ECC von einer intakten zerebellar-stammnahen neuroanatomischen Verschaltung abhängt^38,39,40, während die Spuren-ECC ein Verfahren höherer Ordnung ist, das zusätzliche neuronale Aktivierung des Hippocampus^41,42,43,44 und anderer kortikaler Strukturen^45,46 erfordert. Aufgrund der zeitlichen Anforderungen, die notwendig sind, um Spuren-CRs erfolgreich zu erwerben, ist diese Aufgabe auch schwieriger zu erlernen (sogar für gesunde Probanden).

Abbildung 1: Spur-Augenblinzeln-Klassische Konditionierung. Es wird eine tatsächliche Wellenform gezeigt, die für eine erwachsene Ratte der nicht-intubierten Kontrollgruppe (UC) repräsentativ ist. Der Ton-CS (85 dB, 2,8 kHz) wird zunächst 380 ms lang präsentiert. Anschließend folgt ein Spur-Intervall von 500 ms, in dem keine Reize vorhanden sind. Danach wird ein Schock-US (1,6 mA) für 100 ms appliziert. Ein erfolgreiches Lernen in dieser Aufgabe zeigt sich dadurch, dass die Frequenz (%) oder Amplitude (in Volt) der Augenblinzler während des konditionierten Reaktionszeitfensters (CR-Zeitfenster, gesamter CR-Zeitraum) über mehrere Trainingssitzungen hinweg zunimmt. Insbesondere Nagetiere mit intaktem Hippocampus zeigen gewöhnlich mehr gut zeitlich abgestimmte CRs (adaptive CRs) unmittelbar vor dem Beginn des Schock-US (innerhalb eines 200-ms-Zeitfensters). Startreaktionen (SRs) während der ersten 80 ms nach Ton-CS-Onset sowie unkonditionierte Reaktionen (URs) werden ebenfalls gemessen. Nicht-assoziative SRs sind bei gut trainierten Nagetieren typischerweise gering oder nicht vorhanden, während die URs in Frequenz und Amplitude hoch sein sollten. Diese Aufgabe erfordert, dass das Nagetier die Assoziation zwischen dem Ende des CS und dem Beginn des US (während des Spur-Intervalls) herstellt, wodurch sie von Natur aus schwieriger zu erlernen ist als die Delay-ECC. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Hier zeigen wir die nachteiligen funktionellen Folgen einer alkoholbedingten Exposition in der Neugeborenenphase, die in Form von Binge-Episoden erfolgt, wie sie mittels einer Spuren-Konditionierung (trace ECC) bewertet wird, bei der ein 85 dB-Ton (CS, 2,8 kHz) für 380 ms präsentiert wird, gefolgt von einem 1,6 mA starken Schock (US), der 100 ms andauert, wobei diese Reize durch eine Spurenphase von 500 ms getrennt sind. Wir haben in früheren Studien über die Nützlichkeit dieses Verhaltensassays berichtet, insbesondere bei der Untersuchung von Cholininterventionen und Eisen-Supplementierung zur Minderung der Auswirkungen einer alkoholbedingten Exposition in der Neugeborenenphase^18,47. Tatsächlich kann die Spuren-Konditionierung als diagnostisches Werkzeug zur Beurteilung alkoholbedingter hippocampaler Pathologien im Neugeborenenalter eingesetzt werden. Der Vorteil gegenüber der Delay-ECC liegt darin, dass sie empfindlicher gegenüber Störungen der Hippocampusfunktion ist, die bei Menschen mit FASD beeinträchtigt ist.

Die Demonstration der klassischen Konditionierung (ECC) reicht weit über den Bereich des fetalen Alkoholsyndroms hinaus. Viele Varianten der ECC (z. B. verzögert, Spur-, Verbund- und Umkehrkonditionierung) können verwendet werden, um ontogenetische Unterschiede im Lernen während der Entwicklung, die neurobiologischen Grundlagen assoziativen Lernens bei normalen Säugetieren sowie die Anfälligkeit verschiedener Gehirnsysteme gegenüber zahlreichen Einflüssen aufzuklären, einschließlich (aber nicht beschränkt auf) Teratogene, Umweltgifte, traumatische Hirnverletzungen, neurodegenerative Erkrankungen und psychiatrische Störungen.

Protokoll

HINWEIS: Alle Verfahren wurden genehmigt und gemäß den Richtlinien der East Carolina University IACUC durchgeführt. Long-Evans-Ratten wurden aus Weibchen gezüchtet, die mit männlichen Zuchtratten verpaart wurden. Die Welpen aus allen drei Behandlungsgruppen (siehe 1.1) stammten aus derselben Wurfserie einer Mutter. Es wurden fünf Würfe erzeugt, und jeder Wurf wurde am postnatalen Tag (PD) 3 auf 8 Welpen reduziert. Die verbleibenden zwei Welpen jedes Wurfes wurden separaten Experimenten zugeordnet. Sowohl männliche als auch weibliche Nachkommen (jeweils einer pro Expositionsgruppe) wurden in die Studie eingeschlossen. Insgesamt wurden N = 27 erwachsene Nachkommen untersucht; 3 Ratten mussten aufgrund defekter 3T-Drahtleitungen (siehe 3.1.1) ausgeschlossen werden, die am 1. Tag des ECC-Trainings nicht mehr reparabel waren.

1. Vorbereitung der Gruppen, Materialien und Lösungen

1. Am PD 3 die Welpen von der Mutter entfernen und auf eine thermostatisch geregelte Heizplatte legen, um sie warm zu halten. Die Rattenwelpen nach einem Zufallsverfahren einer der drei Gruppen zuordnen: (1) alkoholintubierte (AI); (2) sham-intubierte Kontrolle (SI); oder (3) nicht-intubierte Kontrolle (UC). Durchführen der genehmigten Kennzeichnungsverfahren, wie beispielsweise das [nicht-toxische] Tätowieren der Pfoten mit einem 30G × 1/2 Zoll-Needle gemäß einem Nummerierungsschema. Die Welpen nach Abschluss des Tätowierens zur Mutter zurückbringen.
2. Bereiten Sie eine oder mehrere orogastrale Intubationssonden aus Polyethylen (PE) der Größe 50 und 10 vor. Die Gesamtlänge dieser Sonde richtet sich nach dem Benutzer und kann entsprechend angepasst werden.
   1. Schneiden Sie mit einer mikrochirurgischen Schere ein 3 Zoll langes Stück PE-50-Schlauch und ein 6 Zoll langes Stück PE-10-Schlauch zu.
   2. Befestigen Sie das PE-50-Stück vorsichtig an einer sterilen 22G × 1 Zoll-Hypodermikanadel.
   3. Führen Sie ein Ende des PE-10-Schlauchs in das offene Ende des PE-50-Schlauchs ein. Am Ende des PE-10-Schlauchs kann ein diagonaler Schnitt erforderlich sein, um die Einführung in den PE-50-Schlauch zu erleichtern.
   4. Schneiden Sie ein kleines Stück PE-50-Schlauch (ca. 2–3 mm) ab und stecken Sie es auf das offene Ende des PE-10-Schlauchs. Dies dient als visueller Anschlag.
   5. Bewahren Sie die vollständige orogastrale Intubationssonde zur Sterilität in frischem 70 %igen Isopropanol auf.
3. Führen Sie aseptische Verfahren durch, um eine Milchgrundlösung in 50-mL-Flaschen herzustellen. Die Milchgrundlösung basiert auf einer Ernährungsformel, die erstmals von West et al. (1984)⁴⁸ beschrieben wurde. Lagern Sie die Flaschen bei -18 °C bis zur Verwendung. Zum Gebrauch zwei Milchflaschen im warmen Wasser auftauen.
   1. Entnehmen Sie mit einer sterilen Spritze 7,16 mL 95 %igen Ethylalkohol (USP) und geben Sie diese zu einer 50-mL-Milchflasche hinzu. Dadurch entsteht eine 11,9 %ige (V/V) Alkohollösung, die den Rattenwelpen während der ersten beiden Fütterungen des Tages verabreicht wird (siehe 2.1.1); die tägliche Gesamtdosis Alkohol beträgt 5,25 g/kg/Tag. Die Dosis ist so bemessen, dass der Alkohol in einem Volumen (0,0278 mL/g pro Fütterung) in der angereicherten Milchlösung verabreicht wird.
      HINWEIS: Diese Menge kann je nach Wurfgröße und erwartetem Verbrauch über 3–4 Tage angepasst werden. Die Menge des zugegebenen Alkohols muss ebenfalls angepasst werden, um eine 11,9 %ige (V/V)-Lösung herzustellen.
   2. Schütteln Sie die Flasche gründlich und beschriften Sie sie entsprechend (d.h., 11,9 % v/v Ethylalkohol in Milch).
   3. Beschriften Sie die zweite Milchflasche (ohne zugesetzten Alkohol) entsprechend (z.B., Nur-Milch) und verwenden Sie sie für zusätzliche Fütterungen gemäß 2.1.1.
   4. Bewahren Sie beide Milchflaschen im Kühlschrank auf.

2. Alkoholexposition in der Neugeborenenphase (postnatale Tage 4–9)

1. Verabreichen Sie AI- und SI-Würfen insgesamt 4 Intubationen pro Tag, beginnend am PD 4. Trennen Sie jede Intubation um jeweils 2 h. Da die AI-Würfe mit einer tatsächlichen Lösung intubiert werden, gelten alle ihre Intubationen als Fütterungen.
   1. Intubieren Sie die AI-Würfe während der ersten beiden Fütterungen des Tages mit der 11,9 % v/v Ethylalkohol in Milch-Lösung und anschließend während der letzten beiden Fütterungen des Tages mit der Nur-Milch-Lösung, um ihr Wachstum zu unterstützen.
   2. Intubieren Sie die SI-Würfe viermal alle zwei Stunden ohne jegliche Lösung, um eine gleich lange Exposition der PE-10-Sonde zu gewährleisten wie bei den AI-Würfen. Die UC-Gruppe erhält keine Intubationen.
2. Nehmen Sie die Würfe von der Muttertier ab und legen Sie sie auf eine temperaturregulierte Heizplatte, um sie warm zu halten. Wiegen Sie jeden Wurf einzeln und notieren Sie das Körpergewicht (in g). Konsultieren Sie einen vorbereiteten Fütterungsplan, um das Intubationsvolumen für jeden AI-Wurf zu bestimmen, und vermerken Sie dies auf einem Erfassungsbogen.
   1. Stellen Sie die 11,9 % v/v Ethylalkohol in Milch-Lösung in ein warmes Wasserbad und schütteln Sie sie gut durch.
   2. Intragastrale Intubationsprozedur:
      1. Spülen Sie die intragastrale Intubationssonde, die in 70 % Isopropanol gelagert wurde, gründlich mit warmem Wasser aus.
      2. Entnehmen Sie die korrekte Menge der Lösung mit einer sterilen 1-mL-Spritze.
      3. Tauchen Sie die Spitze der Intubationssonde (PE-10-Ende) in frisches Maisöl ein (dies erleichtert die Einführung).
      4. Messen Sie die Länge der PE-10-Sonde vom Maul des Wurfes bis zum Magen. Stellen Sie den PE-50-Stopp an, um den Stoppunkt zu markieren.
      5. Führen Sie die PE-10-Sonde vorsichtig in das Maul des Wurfes ein, führen Sie sie entlang der Speiseröhre weiter, leicht durch den gastroösophagealen Schließmuskel hindurch, bis in den Magen. Untersuchen Sie den Wurf, stabilisieren Sie ihn und drücken Sie den Spritzenkolben langsam herunter, um die Lösung zu verabreichen. Tun Sie dies langsam.
         HINWEIS: Um versehentliches Einführen der Sonde in die Luftröhre zu vermeiden, richten Sie die Sonde zunächst so aus, dass sie sich krümmt und mit dem Gaumen in Kontakt kommt, bevor sie weiter vorgerückt wird. Nutzen Sie den Gaumen als Führungsstruktur, da die Sonde sich von dieser Region natürlicherweise ablenkt und in die Speiseröhre gelenkt wird. Jede deutliche ventrale Abweichung der Spitze könnte dazu führen, dass sie in die Luftröhre gelangt. Es ist am besten, die Sonde zu entfernen und die Intubation nicht fortzusetzen, wenn der Eintrittspunkt unsicher ist – versuchen Sie es beim nächsten Mal erneut, mit korrekter Neupositionierung.
      6. Entfernen Sie die PE-10-Sonde vorsichtig und untersuchen Sie den Wurf auf Rückfluss der Lösung, Blutungen oder physische Verletzungen. Stellen Sie den Wurf zu seinen Wurfgeschwistern zurück, falls er unversehrt ist. Die gesamte Intubationsprozedur dauert pro Wurf etwa weniger als 1 min und insgesamt etwa 4 min für die vier intubierten Würfe pro Wurf (2 AI, 2 SI).
      7. Intragastrale Intubationsprozedur für SI-Würfe: Führen Sie die gleiche PE-10-Einführungsprozedur wie bei den AI-Würfen durch, jedoch ohne Lösung und für die gleiche Dauer (1 min).
      8. Bringen Sie alle Würfe unmittelbar nach Abschluss der Prozedur beim letzten Wurf des Wurfes zur Mutter zurück. Bringen Sie die Mutter zurück in das Vivarium, bis zur nächsten Fütterung (in 2 h).
      9. Spülen Sie die intragastrale Intubationssonde mit warmem, sterilem Wasser aus und lagern Sie sie wieder in 70 % Isopropanol. Spülen Sie die Sonde vor jeder Fütterungssitzung gründlich mit Wasser aus.
      10. Wiederholen Sie die Schritte 2.2 (außer dem Wiegen der Würfe) bis 2.2.2.9 für die zweite Fütterungssitzung. Bei den letzten beiden Fütterungen intubieren Sie die AI-Würfe mit der Nur-Milch-Lösung unter Verwendung der gleichen Intubationsvolumina, die in 2.2 bestimmt wurden.
3. Wiegen Sie die Ratten in regelmäßigen Abständen, beispielsweise am PD 15 (wenn sich die Augen öffnen), PD 21 (Entwöhnung), PD 30, PD 60 und PD 90 (Operation), um repräsentative Wachstumskurven zu erhalten.

3. Herstellung und Modifizierung von Elektroden

1. Stellen Sie einen elektromyographischen (EMG-)„Kopfverstärker“ für jede Ratte her (Abbildung 2). Der Kopfverstärker ermöglicht die Aufzeichnung von Augenblinzreaktionen über das Augenblinzelsystem (Abbildung 4).
   1. Konstruieren Sie einen Kopfverstärker, bestehend aus zwei polytetrafluorethylenbeschichteten (PTFE) Edelstahldrähten der Größe 3T (jeweils 5 cm), einem PTFE-beschichteten Edelstahldraht der Größe 10T (5 cm), drei männlichen Kontaktpins und einem Mikrostreifensockelisolator, der auf drei Löcher verkürzt wurde (siehe 3.1.4).
   2. Entfernen Sie die PTFE-Beschichtung vom 10T-Draht, indem Sie die Mitte mit einer gezahnten hochpräzisen Pinzette festhalten und die Beschichtung in beide Richtungen mit der glatten hochpräzisen Pinzette abziehen. Stellen Sie sicher, dass sämtliche Reste der Beschichtung von diesem Draht entfernt wurden.
      1. Verpressen Sie ein Ende des 10T-Drahts mit einer gezahnten zahnärztlichen Zange mit einem Kontaktpin; dieser dient als Erdungsdraht. Halten Sie einen 3T-Draht vorsichtig mit der glatten hochpräzisen Pinzette 1 bis 1,5 mm von einem Ende entfernt. Entfernen Sie die 1 bis 1,5 mm lange PTFE-Beschichtung, wobei der Rest der Beschichtung erhalten bleibt. Verpressen Sie einen Kontaktpin mit dem freigelegten Ende des 3T-Drahts.
      2. Führen Sie die gleichen Schritte für den zweiten 3T-Draht durch. Beide Drähte dienen als positive und negative Leitungen der EMG-Aufnahmeelektroden.
   3. Führen Sie Zugtests an allen Drähten durch, um sicherzustellen, dass sie sicher an den Pins befestigt sind. Achten Sie darauf, die Drähte nicht zu verbiegen oder zu beschädigen.
   4. Schneiden Sie ein Segment eines Sockelisolatorstreifens auf 3,5 Löcher zu (schneiden Sie die Mitte des vierten Lochs ab) mit der Schneidklinge eines Abisolierers. Verkleinern Sie dieses Segment auf genau drei vollständige Löcher und schleifen Sie gegebenenfalls beide Seiten ab. Dies gewährleistet, dass drei vollständige Löcher verfügbar sind. Führen Sie die Pin-Draht-Einheiten in die drei Löcher des Mikrostreifens ein, bis die verpressten Enden bündig mit der Unterkante des Isolatorsegments abschließen. Die 10T-Baugruppe muss sich in einem äußeren Loch des Mikrostreifens befinden, nicht in der Mitte.
2. Modifizieren Sie bipolare Stimulations­elektroden (Abbildung 2).
   1. Verwenden Sie für jede Ratte eine bipolare Stimulations­elektrode. Diese Elektrode leitet über einen Stimulusisolator (siehe Augenblinzelsystem) einen geringen elektrischen Strom als Schock-US während der ECC. Die Elektroden werden vom Hersteller in verdrillter Form geliefert und sind abgeschirmt.
   2. Lösen Sie die beiden Metalladern 2–3 Mal, um eine V-Form (5 mm auseinander) zu erzeugen, und richten Sie anschließend mit der glatten hochpräzisen Pinzette jede „Zinke“ so gut wie möglich gerade. Schaben Sie mit einer Rasierklinge 1 mm der Abschirmung von der Spitze jeder Zinke ringsum ab. Prüfen Sie jede Zinke auf Unregelmäßigkeiten und Biegungen und korrigieren Sie gegebenenfalls, ohne zusätzliche Abschirmung abzuschaben.
3. Entfernen Sie Herstellungsöl und Fremdpartikel von den EMG-Kopfverstärkern und bipolaren Elektroden, indem Sie diese in 95 %igem Ethylalkohol waschen. Lassen Sie sie trocknen und sterilisieren Sie sie anschließend im Autoklaven.

Abbildung 2: Elektromyographische (EMG) Ableitelektroden und bipolare Elektrode. Der fertige EMG-Vorstufenverstärker (rechts, orange) wird aus drei männlichen Kontaktpins, zwei PTFE-beschichteten Drähten der Größe 3T und einem PTFE-beschichteten Draht der Größe 10T sowie einem modifizierten Mikrostreifen hergestellt. Die drei Drähte sind jeweils etwa 5 cm lang und werden auf die Kontaktpins aufgecrimpt. Die fertige bipolare Elektrode (rechts, weiß) wird entdrillt, wieder gerade gebogen und V-förmig (5-mm-Aufspaltung) geformt. Die Abschirmung wird an den Spitzen der beiden Zinken entfernt. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Darstellung dieser Abbildung anzusehen.

4. Augenlidchirurgie-Verfahren (postnatales Tag 90)

1. Zubereitung der Materialien (siehe Materialien für detaillierte Angaben zu den benötigten Artikeln), Tiere, Operations- und nicht-chirurgische Bereiche:
   1. Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente und Hilfsmittel im Autoklaven – die Zahl in Klammern ( ) gibt die ungefähr benötigte Menge pro erwachsenen Ratte oder Messung an: chirurgische Instrumente (1 Satz pro 4 Ratten, gemäß Genehmigung durch die ECU IACUC), Mullkompressen (3–4), Wattestäbchen (5–6), 20 x 20 Verpackung (4 pro Operationssitzung), porzellanene Tiegel (1), Edelstahl-Mikrospatel (1), 0,9 %ige Kochsalzlösung (1 Spüllasche), Petrischale (1) und 0-80 Edelstahlschrauben (3/Ratte).
   2. Weitere sterile Hilfsmittel, die benötigt werden: chirurgisches Skalpellblatt Größe 10 (1 pro 4 Ratten), chirurgisches Tuch (1 pro Ratte), tierärztliche Augensalbe, Povidon-Iod (1 Spüllasche), 26G x 3/8" Hohlnadel (2), vernickelte Bohrhalter mit Bohrer Nr. 55, vernickelter Schlitz-Feinmechanik-Schraubendreher (1,8–2 mm Klinge).
   3. Bereiten Sie einen sterilen Ablagebereich für alle chirurgischen Werkzeuge und Hilfsmittel unter Verwendung eines zugelassenen Desinfektionsmittels für Forschung/Medizin vor. Legen Sie die Materialien auf diesen Bereich, sobald er bereit ist.
   4. Bereiten Sie einen sterilen Operationsbereich unter Verwendung eines zugelassenen Desinfektionsmittels für Forschung/Medizin vor. Dieser Bereich enthält eine temperaturregulierte Heizplatte mit Wasserdurchfluss, ein stereotaktisches Gerät mit Ratten-Narkosemaske, einen Glasperlen-Sterilisator und einen Isofluran-Gasverdampfer (für die Narkose). Der Verdampfer ist mit Schläuchen an die Narkosemaske und an eine Induktionskammer angeschlossen, die sich in einem separaten Bereich für nicht-sterile Vorbereitungsarbeiten am Tier befindet; jeder Schlauch wird durch ein eigenes Ventil gesteuert.
   5. Waschen Sie Hände und Arme gründlich mit antimikrobieller Seife. Öffnen Sie ohne Berührung des Inneren alle in Sterilisationsbeuteln oder -verpackungen verpackten Artikel vorab. Ziehen Sie sterile Handschuhe unter aseptischen Bedingungen an und bringen Sie alle relevanten Artikel in den Operationsbereich. Stellen Sie den Bohrer im Bohrhalter auf die korrekte Tiefe ein (~ 2 mm) und bereiten Sie den Schraubendreher vor. Bedecken Sie die sterilen Materialien mit einer sterilen Abdeckung, bis die Operation beginnen kann.
   6. Bereiten Sie einen nicht-sterilen Bereich mit einer Waage, einem elektrischen Felltrimmer, sterilen 1-mL-Spritzen mit 26G x 3/8 Zoll Nadeln (1 pro Ratte), einem Operationsprotokoll und Buprenorphin (0,03 mg/mL Konzentration, verabreicht mit 0,1 mL/100 g Körpergewicht) vor.
      ACHTUNG: Buprenorphin ist ein halbsynthetisches Opioid der DEA-Kategorie III und muss entsprechend verschlossen und dokumentiert werden.
   7. Prüfen Sie den Isofluran-Verdampfer auf ausreichenden Gasfüllstand; füllen Sie gegebenenfalls nach. Lassen Sie die Gasfluss- und Mischungsregler zunächst ausgeschaltet. Schalten Sie den O₂-Tank ein und prüfen Sie, ob genügend Sauerstoff für alle Operationen vorhanden ist.
   8. Wiegen Sie jede Ratte und notieren Sie ihr Körpergewicht im Operationsprotokoll. Verwenden Sie eine Buprenorphin-Injektionstabelle, um das korrekte Injektionsvolumen zu bestimmen.
   9. Öffnen Sie das Ventil des Verdampfers zur Induktionskammer und lassen Sie das Ventil zur Operationsmaske geschlossen. Stellen Sie die Mischung auf 3 und den Fluss auf 3 (3 % Isofluran mit 100 % O₂ als Trägergas bei einem Volumen von 3 L/min).
   10. Stellen Sie eine Ratte in die Induktionskammer und warten Sie, bis die geeignete Narkosetiefe erreicht ist (langsames Atmen, fehlender Pedalreflex, fehlender Lidschlussreflex). Entfernen Sie die Ratte aus der Kammer, sobald die Narkosetiefe erreicht ist.
   11. Rasieren Sie den Kopf mit dem Felltrimmer, sodass ausreichend Haut für die Schnittstelle und das linke Augenlid freigelegt wird. Falls nötig, stellen Sie die Ratte erneut in die Induktionskammer, um die Narkosetiefe wiederherzustellen, bevor Sie mit dem Rasieren fortfahren.
   12. Desinfizieren Sie die freigelegte Haut durch dreimaliges Abwischen mit abwechselnd Isopropanol und Povidon-Iod. Falls erforderlich, stellen Sie die Ratte erneut in die Induktionskammer, um die Narkosetiefe zu stabilisieren, bevor Sie sie auf den Operationsplatz übertragen.
2. Operation
   1. Öffnen Sie das Ventil des Verdampfers zur Narkosemaske und schließen Sie das Ventil zur Induktionskammer. Stellen Sie die Mischung auf 2,5 und den Fluss auf 2 (2,5 % Isofluran mit 100 % O₂ als Trägergas bei einem Volumen von 2 L/min). Übertragen Sie die Ratte auf das stereotaktische Gerät und befestigen Sie den Kopf gemäß den Standardverfahren am Incisivus-Halter und den Ohrstangen (siehe Geiger et al., 2008⁴⁹ für ein Beispiel).
   2. Führen Sie eine präoperative Buprenorphin-Injektion (subkutan) durch und entsorgen Sie die Nadel (ungekapt) sorgfältig in einem Stichschutzbehälter. Legen Sie ein steriles chirurgisches Tuch auf die Ratte, wobei nur der Operationsbereich freigelegt bleibt und vom restlichen Körper abgetrennt wird.
   3. Ziehen Sie eine chirurgische Maske, chirurgische Haube, chirurgischen Kittel, Schutzbrille und sonstige vom IACUC vorgeschriebene persönliche Schutzausrüstung an. Waschen und desinfizieren Sie Hände und Arme gründlich mit antimikrobieller Seife. Ziehen Sie sterile Handschuhe unter aseptischen Bedingungen an.
   4. Tragen Sie mit einem Wattestäbchen eine kleine Menge Augensalbe auf beide Augen auf, um Austrocknung zu verhindern.
   5. Fahren Sie mit der Operation fort, sobald die Ratte die geeignete Narkosetiefe erreicht hat. Überwachen Sie die Ratte während der gesamten Operation kontinuierlich und prüfen Sie regelmäßig den Isofluran-Spiegel. Passen Sie Fluss- und Mischungsregler während der Operation entsprechend der Reaktion der Ratte auf die Narkose an.
   6. Führen Sie mit dem Skalpell einen anteroposterioren Schnitt entlang der Schädellinie durch. Der Schnitt sollte ausreichend Fläche vor den Augen (d. h. das Stirnbein) und leicht hinter der Lambdasnaht freilegen.
   7. Entfernen Sie vorsichtig das Periost von der Schädeloberseite, um übermäßige Blutung zu vermeiden. Wischen Sie überschüssiges Bindegewebe und Blut mit einem Wattestäbchen ab.
   8. Bohren Sie mit Hilfe des Bohrhalters ein Loch direkt hinter der Koronalsnaht in einem Parietalbein. Entfernen Sie Blut und Knochensplitter mit einem Wattestäbchen. Greifen Sie eine 0-80-Schraube am Gewinde mit Splitterpinzette und befestigen Sie sie mit dem Feinmechanik-Schraubendreher im Loch; ziehen Sie die Schraube soweit fest, dass das kortikale Hirngewebe nicht beschädigt wird (üblicherweise 3–4 volle Umdrehungen).
   9. Wiederholen Sie die in 4.2.8 beschriebenen Schritte, um zwei weitere 0-80-Schrauben am Schädel zu befestigen: eine direkt hinter der Koronalsnaht des gegenüberliegenden Parietalbeins und eine direkt vor der rechten Lambdasnaht. Es hat sich gezeigt, dass drei Schrauben ausreichen, um den Zahnzement (siehe 4.2.18) am Schädel zu verankern, da eine vierte Schraube (vor der linken Lambdasnaht) die Platzierung der Bipolarelektrode behindern würde.
   10. Entnehmen Sie eine EMG-Kopfplatine aus der Petrischale. Richten Sie die Kopfplatine so aus, dass der 10T-Draht auf der rechten Seite der Ratte liegt. Biegen Sie den 10T-Draht nach oben, sodass er parallel zur Unterkante des Mikrostreifens verläuft. Biegen Sie ihn leicht nach rechts, damit der Draht um die vordere und hintere 0-80-Schraube geführt werden kann. Legen Sie sie beiseite, aber in Reichweite.
   11. [Unter der Annahme, rechtshändig zu sein] Legen Sie eine 3-Zoll-Verbandpinzette in die linke Hand und eine 4-Zoll-Verbandpinzette in die rechte Hand. Greifen Sie mit der 4-Zoll-Verbandpinzette die obere Haut an der Schnittstelle des linken Auges und führen Sie die 3-Zoll-Verbandpinzette zur Augenecke; greifen Sie dort die Haut. Halten Sie den Griff mit der 3-Zoll-Verbandpinzette aufrecht und lösen Sie die 4-Zoll-Verbandpinzette.
   12. Nehmen Sie eine 26G x 3/8 Zoll Nadel und führen Sie sie durch die Augenwinkel; drehen Sie die Nadel so, dass die abgeschrägte Seite nach oben zeigt. Verwenden Sie die Mikro-Dissektionspinzette mit Plattform, um den mittleren 3T-Draht in das Loch der Nadel einzuführen. Führen Sie den Draht einige Zentimeter durch, ohne ihn ganz durchzuschieben; dieser Draht ist die negative Elektrode.
   13. Führen Sie die in 4.2.11 und 4.2.12 beschriebenen Schritte durch, um den äußeren 3T-Draht in den mittleren Teil des Augenlids einzuführen; dieser Draht ist die positive Elektrode.
   14. Greifen Sie beide Nadeln mit einer Hand, während Sie die Kopfplatine mit der anderen Hand (oder Pinzette) halten. Ziehen Sie die Nadeln kontinuierlich vom Augenlid weg, während Sie die Kopfplatine in dieselbe Richtung führen. Drehen Sie gegebenenfalls die Kopfplatine so, dass der 10T-Draht zur rechten Augenseite der Ratte zeigt; vermeiden Sie, dass sich die 3T-Drähte überkreuzen. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um zu überprüfen, ob die positive Elektrode in der Mitte des Augenlids sitzt.
   15. Positionieren Sie die Kopfplatine so, dass sie mittig zwischen den Augen liegt und optimal auf dem Stirnbein vor den bilateralen Schrauben platziert ist. Halten Sie die Kopfplatine mit einer Hand und die 3-Zoll-Verbandpinzette mit der anderen. Wickeln Sie den 10T-Draht um eine oder beide Schrauben auf der 10T-Seite.
   16. Legen Sie die 3-Zoll-Verbandpinzette in eine Hand und die 4-Zoll-Verbandpinzette in die andere. Verwenden Sie die 3-Zoll-Verbandpinzette, um die Haut an der Schnittstelle zum linken Schläfenbereich zu greifen. Verwenden Sie die 4-Zoll-Verbandpinzette, um durch Auseinanderziehen der Haut (d. h. der oberflächlichen Faszie) eine kleine „Tasche“ zu bilden. Verwenden Sie die Iris-Schere, um zusätzliches Bindegewebe zu entfernen und arbeiten Sie in Richtung Augenwinkel, um die Tasche zu vergrößern. Achten Sie darauf, nicht zu tief einzudringen oder Blutgefäße zu verletzen.
   17. Nehmen Sie eine Bipolarelektrode und formen Sie die Drahtkontakte so, dass sie entlang der Krümmung des Musculus temporalis verlaufen können, wobei die beiden Zinken (dorsal und ventral) hinter dem linken Auge liegen (siehe Video), und das untere Ende der Bipolarelektrode senkrecht auf dem Schädel sitzt. Lassen Sie ausreichend Abstand zwischen Kopfplatine und Elektrode, damit die Kabelstecker des Kommutators (Abbildung 3) problemlos angebracht werden können.
   18. Geben Sie Zahnzementpulver in den Tiegel – beginnen Sie mit etwa einem Drittel des Tiegels und passen Sie die Menge bei Bedarf an. Geben Sie die flüssige Komponente hinzu, bis die Mischung wässrig ist, und rühren Sie die Komponenten mit dem Spatel um. Sobald der Zement zähflüssiger wird, tragen Sie ihn auf die Schnittstelle auf – bedecken Sie alle Hautränder mit einem Rand von mindestens 1/8 Zoll.
       1. Tragen Sie ausreichend Zement auf, um Kopfplatine und Bipolarelektrode zu stabilisieren, ohne der Ratte das Schließen beider Augen zu erschweren. Wischen Sie schnell überschüssigen Zement ab, der auf das Fell tropft.
   19. Stellen Sie sicher, dass mindestens 4–5 Gewindegänge der Bipolarelektrode nicht mit Zement verschlossen sind, damit der Bipolarstecker aufgedreht werden kann (Abbildung 3). Entfernen Sie überschüssigen Zement von der Kopfplatine – die Oberseite des Mikrostreifens und die drei Kontaktstifte müssen sauber sein. Der Zement härtet schnell und könnte sonst das vollständige Einrasten der Elektroden in die Kommutatorstecker verhindern. Verwenden Sie Splitterpinzetten, um überschüssigen, teilweise getrockneten Zement zu entfernen.
   20. Warten Sie, bis der Zement ausgehärtet ist; er wird durchsichtig. Schneiden Sie mit der Mikro-Dissektionsschere überschüssige Länge von beiden 3T-Drähten ab, sodass einige Zentimeter Spielraum verbleiben.
   21. Halten Sie die Mikro-Dissektionspinzette mit Plattform in der linken Hand und die Mikro-Dissektionspinzette mit feinen Spitzen in der rechten Hand. Greifen Sie einen 3T-Draht mit der linken Pinzette leicht vor dem Augenlid. Mit der rechten Pinzette schieben Sie das Augenlid nach oben, um mehr vom 3T-Draht freizulegen, und halten Sie es dort. Lösen Sie die linke Pinzette und greifen Sie mit der linken Hand die Kopfplatine (stellen Sie sicher, dass sie fest sitzt). Verwenden Sie die rechte Pinzette, um etwas PTFE-Isolierung abzustreifen, sodass der Draht Kontakt mit dem Orbicularis oculi-Muskel herstellen kann.
       HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht zu stark an einem 3T-Draht zu ziehen, da er sich sonst vom Kontaktstift lösen könnte. Sollte ein Draht sich lösen, ist es nicht möglich, den Kontaktstift zu ersetzen, da der ausgehärtete Zement sich nicht ohne Knochenbruch vom Schädel lösen lässt.
   22. Führen Sie die Schritte in 4.2.21 durch, um überschüssige PTFE-Isolierung vom zweiten 3T-Draht zu entfernen.
   23. Halten Sie die beiden Mikro-Dissektionspinzetten wie in 4.2.21 beschrieben (Plattform links, feine Spitzen rechts). Positionieren Sie die linke Pinzette leicht vor einem 3T-Draht, während Platz für die rechte Pinzette direkt vor dem Augenlid bleibt. Greifen Sie den Draht mit beiden Pinzetten.
       1. Bilden Sie einen „Haken“, indem Sie die rechte Pinzette ruhig halten und die linke Pinzette nach oben und um das Augenlid herum drehen – dies in einer einzigen Bewegung. Lösen Sie vorsichtig zuerst die rechte, dann die linke Pinzette.
          HINWEIS: Das Haken der Elektroden am Augenlid hilft, Reibung an der Hornhaut zu minimieren. Es verringert auch die Wahrscheinlichkeit eines Drahtbruchs während der Verhaltensversuche. Obwohl das Haken nicht bei allen Tieren vollständig verhindert, dass der Draht die Hornhaut berührt, zeigen sie in der Regel keine Anzeichen von Augenschäden, wie durch hohe Blinkamplituden (gemessen mit dem digitalen Oszilloskop in 5.1.7) und tägliche postoperative Gesundheitskontrollen (übermäßiges Tränen, teilweises Schließen der Augenlider, eingeschränkte Augenbeweglichkeit) belegt wird. Zeigt eine Ratte erste Anzeichen von Unbehagen, wird sie mit Isofluran narkotisiert (siehe 4.1.10), und die Elektroden werden erneut überprüft und/oder neu positioniert. Augensalbe wird aufgetragen, um Austrocknung der Hornhaut zu verhindern. Die Ratte wird täglich auf postoperative Augenkomplikationen überwacht; bei anhaltenden Problemen ist tierärztliche Betreuung erforderlich. Ratten mit schweren, nicht korrigierbaren Augenkomplikationen werden gemäß den Standardverfahren der ECU IACUC human getötet.
   24. Führen Sie die Schritte in 4.2.23 für den zweiten 3T-Draht durch. Schneiden Sie überschüssigen Draht mit der Mikro-Dissektionsschere ab.
   25. Lösen Sie mit einer Hand die Ratte von den Ohrstangen, während Sie den Körper mit der anderen Hand stützen. Untersuchen Sie den Kopf auf Blut oder Ablagerungen, reinigen Sie gegebenenfalls und verabreichen Sie eine postoperative Buprenorphin-Injektion.
   26. Stellen Sie die Ratte in eine Wärmekiste (z. B. mit temperaturregulierter Heizplatte), um die Erholung zu unterstützen. Tragen Sie die Operationsendzeit im Operationsprotokoll ein und notieren Sie relevante Beobachtungen während der Operation. Überwachen Sie die Ratte auf normale Atmung; sobald sie Sternumlage erreicht oder sich bewegt, kann sie in ihren Heimkäfig zurückgebracht werden.
   27. Resteilisieren Sie die Instrumente (außer Mikro-Dissektionspinzetten – da diese beschädigt werden könnten) mit dem Glasperlen-Sterilisator, halten Sie den Operationsbereich aseptisch und wiederholen Sie die aseptischen Verfahren, falls mehrere Augenlidoperationen durchgeführt werden.

5. Spur-Augenlid-Klassische-Konditionierung-Verfahren

Abbildung 3: Modifizierte Box für die operante Konditionierung zur Augenblickreflex-Konditionierung. Ratten sind frei bewegliche Säugetiere, weshalb ein rotierender Kommutator verwendet wird, um den elektrischen Kontakt für die von der Kopfplatte ausgehenden Signale der EMG- und bipolarer Stecker aufrechtzuerhalten. Der Kommutator ist an der Halterungsschiene befestigt, die durch ein Gegengewicht den Druck auf die Ratte verringert. Ein Piezo-Lautsprecher gibt einen 2,8-kHz-Ton mit 85 dB aus, wobei diese Werte regelmäßig kalibriert werden. Akustikschaum trägt zur Dämpfung von Umgebungsgeräuschen bei. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Darstellung dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: System zur Augenlidreflex-Konditionierung. Dieses speziell angefertigte System besteht aus einer EMG-Integratoreinheit, die eingehende Signale von den Ratten filtert und verstärkt, einer Stimulus-Steuerungseinheit, die verschiedene Reize zusätzlich zu Tönen und Schocks liefert, einem Vorverstärker für jede Operant-Box zur Erhöhung des EMG-Signalverstärkungsgrades sowie einem Stimulus-Isolator für jede Operant-Box; es ermöglicht die Einstellung unterschiedlicher Schockstärken (in mA). Ein digitaler Oszilloskop (nicht Bestandteil des Standard-Augenlidreflex-Systems) wird zu Diagnosezwecken während der Gewöhnung und Erwerbsphase verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Darstellung dieser Abbildung anzusehen.

1. Beginnen Sie die Gewöhnung und das Erwerbstraining 5 Tage nach der Operation. Geben Sie jeder Ratte einen Tag zur Gewöhnung und zum Umgang mit der Trainingsapparatur – bestehend aus einer modifizierten operanten Konditionierungskammer, die in einer größeren schallgedämpften Kammer untergebracht ist (Abbildung 3) – anschließend folgen 6 Tage Erwerbstraining. Führen Sie die Gewöhnungs- und Erwerbssitzungen mit einem selbstgebauten Augenblinzel-System durch (Abbildung 4).
   1. Erstellen Sie eine Trainings-Protokolldatei und drucken Sie diese aus, um tägliche Aufzeichnungen zu führen. In diesem Protokoll sollten die Rattenrudel pseudorandomisiert (oder nach einer anderen Randomisierungsmethode) den Trainingsboxen vorab zugewiesen sein.
   2. Schalten Sie das Augenblinks-System und den Computer ein und starten Sie die Augenblinks-Software. Diese Softwareversion verfügt über verschiedene unabhängig voneinander laufende Module (bzw. Anwendungen). Starten Sie das Modul „Animal“, um eine *.RAT-Datei anzulegen, die die Versuchstierinformationen enthält (Sitzungsnummer, Tierkennung, Geschlecht, Gewicht und Kastennummer). Eine einzelne RAT-Datei verwaltet bis zu vier Ratten, die eine Versuchsgruppe („Squad“) bilden. Geben Sie die entsprechenden Werte ein und speichern Sie die Datei. Erstellen Sie für jede zu trainierende Ratte-Gruppe eine separate RAT-Datei.
   3. Bringen Sie die Ratten vom Vivarium in den Versuchsraum und schließen Sie die Tür. Handhaben Sie jede Ratte 5 Minuten lang.
   4. Überführen Sie eine Ratte in ihre vorgesehene Box und verbinden Sie die EMG- und Bipolarstecker des Kommutatorkabels mit dem entsprechenden EMG-Vorstufenverstärker und der Bipolarelektrode am Kopf der Ratte.
      HINWEIS: Beim ersten Kontakt mit dem Kommutator-Kabel kann es vorkommen, dass die Ratte sich wehrt und Anzeichen von Stress zeigt. Handhaben Sie die Ratte vorsichtig und gewähren Sie Pausen zwischen erfolglosen Anbringungsversuchen, um ihren Stress zu verringern.
   5. Verwenden Sie einen Kommutator, der sich dreht 360° während die elektrische Signaldarreichung/-aufnahme aufrechterhalten wird, während sich eine Ratte frei in einer Box bewegt. Es verfügt über 5 Kanäle (3 für die EMG-Elektroden, 2 für die bipolarer Elektroden), die in die EMG-Integrator-Einheit führen, welche das Rohsignal filtert und verstärkt.
   6. Stellen Sie sicher, dass sich die Ratte frei bewegen kann und durch das Gewicht der Kommutatorkabelanordnung oder des Stativarms nicht behindert wird. Passen Sie gegebenenfalls das Gegengewicht an der Rückseite des Stativs an. Überprüfen Sie, ob alle Stecker fest sitzen, und schließen Sie dann die Boxtür. Führen Sie denselben Anschluss- und Überprüfungsprozess für alle Ratten durch.
   7. Verwenden Sie ein Oszilloskop, um ihre EMG-Aktivität auf abnormale Signale (z. B. elektrische Aktivität mit hoher Frequenz und/oder hoher Amplitude) zu überprüfen, und ein Videosurveillance-System, um ihren Zustand zu kontrollieren (z. B. motorische Aktivität, Empfindlichkeit gegenüber der Umgebung, Anzeichen von Schmerz), falls verfügbar. Notieren Sie alle beobachteten Probleme im Trainingsprotokoll.
   8. Lassen Sie die Ratten 10 Minuten lang an ihre Kammern gewöhnen und bringen Sie sie anschließend in ihre Heimkäfige zurück.
   9. Reinigen und desinfizieren Sie die operanten Boxen, kehren Sie den Boden und reinigen Sie den bzw. die Tische. Führen Sie diese Schritte nach jeder Sitzung durch.
2. Die Erwerbstraining erfolgt über 6 aufeinanderfolgende Tage (Sitzungen).
   1. Tag 1: Überführen Sie eine Ratte in ihre vorgesehene Box und verbinden Sie die EMG- und Bipolarstecker des Kommutatorkabels mit dem entsprechenden EMG-Headstage und der Bipolarelektrode am Kopf der Ratte. Führen Sie die in 5.1.6 und 5.1.7 angegebenen gleichen Verfahrensschritte durch.
   2. Schalten Sie die Stimulusisolatoren ein und stellen Sie den auszuliefernden Strom auf 0,4 mA ein (4 % von 10 mA, wie im Video gezeigt). Die Isolatoren leiten den elektrischen Strom abwechselnd (d. h. von Durchgang zu Durchgang) zwischen den dorsalen und ventralen Zungen der bipolarer Elektrode. Dies trägt dazu bei, die Muskelfaserermüdung (an jeder Muskelstelle) bei wiederholten Stimulusaufgaben zu verringern.
   3. Beobachten Sie alle aufgezeichneten Augenblinzreaktionen und gezeigten Toleranzen in jedem Durchlauf für alle Ratten. Erhöhen Sie nach jedem zweiten Durchlauf die Intensität des elektrischen Reizes (US) um 0,4 mA pro Ratte, bis eine Intensität von 1,6 mA erreicht ist (in den Durchläufen 7 und 8). Überprüfen Sie sorgfältig, ob alle Ratten normal in ihren Käfigen reagieren, ob alle Verstärkungs- und Verstärkereinstellungen konstant sind und ob korrekte elektrische Signale (d. h. geringe oder keine EMG-Störungen) von ihnen ausgehen. Verwenden Sie während aller Tage der Erwerbstraining eine Reizintensität (US) von 1,6 mA.
      HINWEIS: Wenn eine Ratte Schmerzreaktionen auf ein bestimmtes Schockniveau zeigt (z. B. hoch vom Boden springen, an Wänden hochklettern, herumlaufen), wird der Versuch unterbrochen und die Ratte erhält zwei Versuche lang den vorherigen mA-Wert (0,4 mA niedriger). Danach wird erneut der höhere, zuvor nicht tolerierte Schockwert verabreicht; zeigt die Ratte dann Toleranz, werden schrittweise steigende Werte bis zur Obergrenze von 1,6 mA verabreicht. Falls die Ratte keinen Wert toleriert, wird während des gesamten Trainings der nächstniedrigere Wert (in 0,4-mA-Schritten) verwendet, bei dem eine Toleranz beobachtet wird.
   4. Verwenden Sie ein Oszilloskop, um ihre EMG-Aktivität auf abnormale Signale zu überprüfen (z. B., elektrische Aktivität mit hoher Frequenz und/oder hoher Amplitude) und ein Videosurveillancesystem, um ihren Zustand zu überprüfen (z. B., motorische Aktivität, Empfindlichkeit gegenüber der Umgebung, Schmerzzeichen
      HINWEIS: Erläuterung der Trace ECC: Ein repräsentatives Versuchsepoch mit aufgezeichneten EMG-Wellenformen ist dargestellt Abbildung 1 und das Spur-ECC-Verfahren wird im Video ausführlich erläutert. Die Spur-Konditionierungstrainingsdatei ist so eingestellt, dass sie 100 Durchgänge liefert (90 gepaarte CS-US-Durchgänge und alle 10 Durchgänge 10 CS-allein-Durchgänge)^th Versuch) mit einem durchschnittlichen Inter-Versuchs-Intervall von 30 s. Die gesamte Trainingssitzung dauert ungefähr 52 min (unter der Annahme keiner Unterbrechungen). Alle Ratten sind in Sitzung 1 naiv und entwickeln im Verlauf mehrerer Trainingstage unterschiedliche Lernkurven (bestimmt durch die Expression konditionierter Reaktionen, CRs).
   5. Training starten: Führen Sie das Blink-Softwaremodul aus. Wählen Sie bei Aufforderung die korrekte RAT-Datei und die Trainingsdatei aus für "Spur" Augenlid-Konditionierung
   6. Notieren Sie die Startzeit und den Namen des Versuchsleiters im Trainingsprotokoll. Überwachen Sie ab diesem Zeitpunkt alle Aktivitäten: ordnungsgemäße EMG-Signale, gute Augenblinzelreaktionen auf den Schock-US (d. h. hohe bzw. häufige URs), den Gesundheitszustand der Tiere sowie die einwandfreie Funktion der Hardware. Tragen Sie alle bemerkenswerten Beobachtungen im Trainingsprotokoll ein.
   7. Die Datenerfassung erfolgt automatisch durch die Software als RAW-Dateien (eine pro Ratte und Tag). Die RAW-Dateien enthalten Daten zur EMG-Amplitude (in Volt), Frequenzzählungen, Latenzzeiten sowie Flächendaten für Schreckreaktionen (SRs), URs und CRs (gesamt und adaptiv). Aufgrund von Störsignalen durch den Reiz wird die erste 100 ms des UR-Zeitraums überlagert; daher enthalten nur die letzten 140 ms des UR-Zeitraums valide UR-Daten.
   8. Am Ende des Trainings schließt die Software automatisch. Entfernen Sie alle Ratten aus ihren Trainingsboxen und bringen Sie sie zurück zu das Vivarium
   9. Wiederholen Sie die Schritte 5.2.5–5.2.6 für alle folgenden Trainingstage. Aktualisieren Sie vor dem Start des Blink-Moduls an einem bestimmten Tag die Sitzungsnummer in der RAT-Datei. Dadurch können an diesem Tag neue RAW-Dateien für alle Ratten erstellt werden. Jede Ratte sollte 6 RAW-Dateien erhalten, vorausgesetzt, keine wurde vom Training ausgeschlossen.
3. Verarbeiten Sie die RAW-Dateien und erstellen Sie eine Datei, die für die statistische Analyse gefiltert wurde.
   1. Führen Sie das Analysemodul aus. Überprüfen Sie jede Sitzung für jede Ratte einzeln pro Durchlauf auf problematische Durchläufe. Dies erfolgt, um Durchläufe herauszufiltern, die aus verschiedenen Gründen beeinträchtigt sein könnten (z. B., übermäßige Aktivität vor der CS-Baseline, übermäßige Bewegung, Elektrodenablösung, Kabel-/Leitungsprobleme). Die Software verfügt über Algorithmen, die dem Experimentator bei der Erkennung und Entfernung helfen "schlechte Versuche" aus dem gefilterten Datensatz ausgeschlossen werden.
   2. Importieren Sie die gefilterten Daten in ein Tabellenkalkulationsprogramm und führen Sie die entsprechenden statistischen Analysen durch.

Ergebnisse

Die Eyeblink Software ist in der Lage eine große und umfassende Reihe von Daten für viele Arten von Messungen. Aus Platzgründen berichten wir in dieser Studie ergibt sich Vertreter für lernen und Leistung Maßnahmen, die adaptive CR Prozentsatz, adaptive CR Amplitude, UR-Prozentsatz und UR-Amplitude enthalten. Die adaptive CR-Zeitraum wurde gewählt, weil es den Erwerb von gut getimten Eyeblink Antworten über wiederholte Schulungen durch verbesserte synaptische Plastizität im Hippocampus während Spur ECC^50,51,52darstellt. Die UR-Maßnahmen wurden ausgewählt, um aufzuklären, ob die Neugeborenen Alkohol-induzierten lernen Defizite im ECC verfolgen aufgrund von Störungen im assoziativen Lernens oder Störungen bei der Reaktion auf den Schock waren uns - die motivationalen oder motor Unterschiede anstatt lernen Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen hinweisen können. Daten für jede einzelne Maßnahme wurden mit 2 (Sex) X 3 (neonatale Group) X 6 (Session) gemischt ANOVAs mit Session als Faktor wiederholt Maßnahmen analysiert. Signifikanten Haupteffekte für neonatale Behandlung wurden mittels Tukey post-hoc-Tests analysiert und signifikante Wechselwirkungen wurden mit einfachen Effekten Tests analysiert. Alle statistischen Analysen wurden mit einer minimalen alpha-Niveau von 0,05 durchgeführt und die Ergebnisse in Diagrammen sind Mittelwert ± SEM

Beginnend mit der adaptiven CR Prozentsatz Maßnahme, die ANOVA angegeben ein signifikanten Haupteffekt der neonatalen Gruppe F(2,21) = 11.69, p < 0,001, aber keine signifikanten Haupteffekt des Geschlechts (p = 0,71) oder signifikante Wechselwirkung zwischen diesen Faktoren (p = 0,20). Wie erwartet, adaptive CR Prozentsatz erhöht über die sechs Sitzungen des Trainings, F(5, 105) = 81.15, p < 0,001 und die Unterschiede zwischen den Neugeborenen Gruppen waren angewiesen auf einer bestimmten Ebene Sitzung, F(10, 105) = 4,58, p < 0,001. Es gab keine anderen signifikanten Wechselwirkungen mit der Sitzung Faktor. Ebenso für adaptive CR Amplitude, gab es wieder ein signifikanten Haupteffekt der neonatalen Gruppe F(2,21) 22,32, p = < 0,001, aber keine signifikanten Haupteffekt des Geschlechts (p = 0,21) oder signifikante Wechselwirkung zwischen diesen Faktoren (p = 0,48). CR-Amplitude erhöht auch deutlich über der sechs Sitzungen des Trainings, F(5, 105) 59.27, p = < 0,001 und die Unterschiede zwischen den Neugeborenen Gruppen waren angewiesen auf einer bestimmten Ebene Sitzung, F(10, 105) 4.31, p = < 0,001. Insgesamt zeigten beide CR-Maßnahmen erhebliche Unterschiede zwischen der Gruppe und diese Mittel bei verschiedenen Sitzungen des Trainings deutlich getrennt. Um zu bestätigen, welche Gruppen deutlich unterschieden, Tukey post-hoc-Tests zeigten, dass der Alkohol intubiert (AI) Ratten deutlich schlechter zu beiden CR-Maßnahmen als die unintubated-Kontrolle (UC) und Schein intubiert (SI) Ratten durchgeführt (p < 0,01 für CR-Anteil; p < 0.001 für CR-Amplitude), die nicht voneinander unterscheiden (p> 0,05). Einfache Effekte auf die bedeutende neonatale Gruppe x Session Interaktionen für beide CR-Maßnahmen, bestätigt, dass die AI-Ratten mehr erheblich, beim Erwerb von CRs Sitzung 2 Beginn und Durchführung beeinträchtigt wurden auf Session 6 im Vergleich zu UC und SI Ratten durchgeführt (alle p< 0,05), die in sechs Sitzungen nicht voneinander unterscheiden. Die einzige Ausnahme war adaptive CR Amplitude für SI Ratten nicht unterscheiden sich deutlich von AI Ratten bis 3 Uhr Sitzung begann. Diese Ergebnisse sind in Abbildung 5A, 5 bgezeigt.

Es gab keine signifikanten Unterschiede in der UR-Maßnahmen aufgrund von Geschlecht, neonatale Gruppe oder Wechselwirkungen dieser Faktoren mit der Sitzung Faktor. Diese negativen Ergebnisse zeigten, dass jede Gruppe durfte Eyeblink Antworten auf den Schock, die uns ebenso emittieren, und, dass das Lernen Defizite bei den AI-Ratten beobachtet nicht durch motivierende oder motor Unterschiede beeinflusst in blinken (Abbildung 6A, 6 b).

Abbildung 5 : Übernahme der Spur bedingt reagiert (Mittelwert ± SEM). Anfang Alkohol Exposition (AI-Gruppe) beeinflusst deutlich Erwerb von adaptive konditionierte Reaktion (CR) Prozentsatz (A) und Amplitude (B). Trace ECC ist von Natur aus schwer zu erwerben, daher die Maßnahmen sind relativ niedriger für alle Gruppen - mit Verzögerung ECC, Prozentsätze erreichen 80-85 % in Nager-Modelle von Kraniofasziale^21,53. Dennoch ist die Ablaufverfolgung ECC-Verfahren mehr Besteuerung auf den Hippocampus, die ist anfällig für Alkohol Auswirkungen während der frühen Entwicklung des Gehirns. * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001 zwischen UC und AI Ratten; Stichprobengrößen sind in Klammern angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6 : Übernahme von Unconditioned Antworten (Mittelwert ± SEM). Eyeblink Leistung (Prozentsatz der UR und UR-Amplitude) war nicht signifikant unterschiedlich zwischen den Gruppen. Der Mangel an Unterschiede zeigen, dass die Schock Intensität während der Ausbildung Übernahme änderten nicht differentiell Motivation bei den AI-Ratten oder ihre Fähigkeit, defensive produzieren blinken Antworten auf den Schock, im Vergleich zu beiden Kontrollgruppen (UC und SI). Stichprobengrößen sind in Klammern angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

Neonatalen Ratte Welpen, die Äthyl-Alkohol während der postnatalen Tagen 4-9 erhalten ausgestellt Spur Eyeblink Konditionierung Beeinträchtigungen im Erwachsenenalter. Diese Ergebnisse unterstützen die Idee, dass Alkohol Teratogen dauerhaften nachteilige Auswirkungen auf hippocampal Funktion. Insgesamt, Klimaanlage in der Spur-Verfahren reagiert war niedriger für Ratten, Alkohol im Vergleich zu Ratten in beiden Kontrollgruppen ausgesetzt. Die assoziativen Lernens Beeinträchtigungen bei der Alkohol-exponierten Ratten waren unbeeinflusst von motivationalen oder motor Unterschiede (d. h.., keine Unterschiede im Schock U.S. Intensität blinkend).

Während Trace ECC ein nützliches Diagnosetool für erhellendes Herausforderung-induzierte hippocampal Neuropathologie ist, müssen die Ergebnisse dieser Methode in den richtigen Kontext gesetzt werden. Zunächst beteiligt die wichtige Verfahrenselemente in dieser Demo die gezielte Gabe von Alkohol während einer bekannten Fenster der Anfälligkeit für das sich entwickelnde Gehirn, Herstellung von Elektrode Hardware, erlaubt die Aufzeichnung von elektromyographische Aktivität und liefert Schock, chirurgische Implantation der oben genannten Hardware und anschließende Tierversuche mit ein Learning-Paradigma, die eine kognitive Funktion von Interesse bewertet. In jeder Phase des Prozesses muss darauf geachtet werden, die Nager Themen nicht unnötig/unbeabsichtigten Schaden zuzufügen und ihre Gesundheit Zeichen, regelmäßig zu überwachen. Ihres Verhaltens Ergebnisse liefern das "Fenster" zur Erkenntnis, ein psychologisches Konstrukt, das ist nur genau beschrieben wann ihre Gesundheit nicht durch experimentelle Fehler umfasst Alkohol Dosierung, Hardware-Defekte oder chirurgische Implantation beeinträchtigt wird. Somit muss jeder Verfahrenselement in den Forschungsprozess in einer gesunden Art und Weise implementiert werden, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse von ECC Feststellungen in den Menschen übertragbar sind. Zweitens, das ECC-Paradigma bietet einen Einblick auf die Art des assoziativen Lernens, aber geachtet werden nicht zu Ergebnisse mit diesem Ansatz zu erweitern und sie weitgehend auf andere kognitive Bereiche - wie z. B. Arbeitsspeicher, kurz-/langfristige Erinnerungen und Bewusstsein - zuschreiben, wenn man einige Facetten dieser Domänen innerhalb einer ECC-Studie von experimentellen Design übernommen hat. Zum Beispiel diese Demonstration der Akquisitionsphase Spur ECC lernen untersucht, aber Merkfähigkeit bei den Ratten habe nicht geprüft, nachdem sie die Ausbildung abgeschlossen. Speicher ist somit eine unabhängige psychologische Prozess, der neben lernen ausgewertet werden soll. Durch Design kann man eine Erinnerung Aufbewahrung Intervall, um entweder kurz- oder langfristigen Speicher-Fähigkeit beurteilt integrieren. Drittens, Erkennung gibt es parallelen Speicher Systeme⁵⁴ , die möglicherweise gleichzeitig funktionieren zusammen mit motivierenden, Erlebnispädagogik und hormonelle Faktoren beitragen zu Verhalten, ist essenziell für Verständnis, die Assoziativität (während ECC) ist aber eine der vielen Prozesse, die zeigen, was "gut" oder "schlecht" über das lernen. Zu guter Letzt ist Spur ECC keine rein hippocampal-abhängige Aufgabe wie andere Hirnregionen ein Teil der Tschechischen Republik vermitteln können. So muss ein Verständnis der Wechselwirkungen zwischen verschiedenen neuronalen Schaltkreise und/oder der Art der Anregung Parameter, die in einer Studie verwendet werden berücksichtigt werden bei der Auswirkungen anhand der diskreten Ergebnisse. Das Kleinhirn trägt beispielsweise auch zur Ablaufverfolgung ECC, wo es die topographischen Merkmale der CR und CR timing beeinflusst, besonders wenn die ISI kurzer Dauer ist. Spur ECC wirkt nicht bei Menschen mit Kleinhirn Schäden, die mit einem langen Spur Intervall (1000 ms) getestet, sondern wirkt sich bei denjenigen, die eine kürzere Spur Intervall (400 ms)³⁴erhalten. Darüber hinaus bilaterale Läsionen des dorsalen medialen präfrontalen Kortex (mPFC), die auf der anterioren cingulären und medialen Agranular Regionen bei Mäusen verhindern, Erwerb von Trace CRs⁵⁵, während Zerstörung der kaudalen mPFC bei Kaninchen ähnliche Ergebnisse⁴⁶produziert. Diese Ergebnisse weisen auch wie wichtig es ist, wenn man bedenkt, dass Artenunterschiede im präfrontalen Beiträge zur zerebelläre Gehirn ergeben sich angetriebenen assoziativen lernen, wie Spur ECC. Während neonatale Alkohol Exposition bei PD 4-9 beeinträchtigt Akquisition von 500 ms Spur CRs für Erwachsenen in dieser und anderer Studien^{47,56 Ratten}, ist dies nicht der gleiche Fall für neonatale Alkohol ausgesetzt Ratten, die eine 300-ms Spur Intervall zu erleben, auch wenn bei einer relativ hohen Dosis von Alkohol (5 g/kg)⁵⁷, darauf hindeutet, dass die Ablaufverfolgung Beeinträchtigung bei Alkohol-exponierten Ratten abhängig von der Dauer des Intervalls Spur ist in Frage gestellt.

In dieser Studie wurde der Hippocampus betont, wie von entscheidender Bedeutung für die Vermittlung Spur ECC, und wenn von Neugeborenen Alkohol Exposition, herausgefordert wird im Zusammenhang mit neuronalen Schäden Exponate Beeinträchtigungen beim Erwerb von Trace CRs widerspiegelt. Es muss warnte jedoch, dass die Kleinhirn-Gehirn Stammzellen Schaltung, besonders der Interpositus Kern, für viele Facetten des ECC, einschließlich Erwerb, Ausdruck und topografische Merkmale der CR, abhängig von der ECC Aufgabe einschließlich Spur ECC^{36,40,55,58,59}unerlässlich. In der Tat interagiert diese neuralen Schaltkreis mit der Hippocampus für die Expression von CRs während höherer Ordnung Formen der ECC, wie Spur ECC⁶⁰fahren. Es ist nicht ganz klar, ob Alkohol Exposition während der frühen Entwicklung des Gehirns betrifft speziell hippocampal Funktion im Trace ECC. Viele verschiedene Hirnregionen sind anfällig für frühen Alkohol Beleidigung, einschließlich mPFC, Kleinhirn und Hippocampus^{18,19,23,47,61,62}, und es ist sehr wahrscheinlich, dass Alkohol stört die Funktionsweise dieser Strukturen in unterschiedlichem Umfang und unterschiedlicher, aber funktionell wichtige Unterschiede über viele ECC-Verfahren. Trotz der Fallstricke bezüglich der Interpretation der Ergebnisse von Trace ECC Studien erfolgreiche Akquisition von Trace CRs nachweislich mindestens ein intakter Hippocampus, abhängig von tierischen Läsion Studien^{42,44,63,64,65}unterstützt. Dieses Verfahren bleibt somit einen wertvollen Ansatz für den Nachweis der Verbindungen zwischen Entwicklungsstörungen Alkohol Exposition zu verfolgen bedingt reagiert, weil die neuralen Schaltkreis zugrunde liegt, ist viel besser verstanden als die der anderen hippocampal-abhängige Aufgaben wie Ort lernen in Morris Wasser-Irrgarten, neuartige Objekterkennung und kontextuellen und Spur Konditionierung zu befürchten.

ECC als Verhaltensstörungen Methode "Kognition, assay" hat weit verbreiteten Anwendbarkeit auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie Neuroteratology. In der Tat, neueste Erkenntnisse aus unserem Labor unterstützen das Konzept, die Entwicklung Hippocampus sehr empfindlich auf Alkohol Wirkungen, die durch verschiedene interventionelle Strategien^18,47gemindert werden kann. Der Hauptvorteil ist, dass ein besseres Verständnis der Alkohol-induzierten Spur ECC lernen Defizite sie prädiktiv für andere Probleme im Hippokampus-basierte Funktionen außerhalb der assoziativen Lernens - insbesondere bekannt durch die gleichen hippocampal Neurocircuitry vermittelt werden können.

Anwendung von Trace ECC und seinen anderen Varianten (z.B., Verzögerung, Umkehr, Diskriminierung, Verbindung), die neurobiologischen Mechanismen und assoziativen Lernens beteiligten neuronalen Systeme aufzuklären kann über den Bereich der fetalen Alkohol-Forschung erweitert werden. Beispielsweise hat dieses Paradigma in menschlichen Fällen und Tiermodellen der psychiatrischen Erkrankungen wie Schizophrenie^66,67, Neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit^68,69, und Drogen Missbrauch^70,71,72viel Aufmerksamkeit erhalten. Ihre Vorteile als Forschungsmethode, neurokognitiven Funktion und Dysfunktion zu beurteilen sind somit offensichtlich in vielen psychologischen und biomedizinische Disziplinen, einschließlich der Neurowissenschaften.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Exposition gegenüber Alkohol bei Neugeborenen
190 Proof Ethylalkohol (USP)	Pharmco-AAPER	225-36000 [ECU Medical Storeroom]	Kann ersetzt werden; sollte USP sein; vermeiden Sie die Verwendung von 200 Proof Ethylalkohol
Behälter / Korb für Welpen	Jedes
Maisöl	Jede
erhitzte Wassertherapiepumpe in Lebensmittelqualität mit / Pads	Gaymar	TP-500	Um Welpen warm zu halten; kann ersetzt werden
Injektionsnadeln 22G x 1 Zoll, Steril	Alle
Injektionsnadeln 30G x 1/2 Zoll, Steril	Alle
Isopropylalkohol 70%	EMD Millipore	PX1840-4 [Fisher Scientific]	Kann ersetzt werden; Reagenz Qualität www.fishersci.com
Long-Evans-Ratten (weibliche und männliche Züchter)	Charles River Laboratories	N/A [ECU Abt. für vergleichende Medizin]	Alter und Gewicht müssen angegeben werden; die Preise variieren je nach folgenden Faktoren www.criver.com
Mikro-Präparierschere, 3,5 Zoll, 23 mm Klingen	Biomedizinische Forschungsinstrumente	11-2200	Zum Schneiden von PE-Schläuchen brisurgical.com
Polyethylen 10 Schläuche (0,011 Zoll. Ausweis; 0,024 Zoll O.D.)	BD Diagnostic Systems	22-204008 [Fisher Scientific]	Kann ersetzt werden www.fishersci.com
Polyethylen 50 Schlauch (0,023 Zoll. Ausweis; 0,038 Zoll O.D.)	BD Diagnostic Systems	22270835 [Fisher Scientific]	Kann ersetzt werden www.fishersci.com
>Geregelter Wasserkocher oder Babymilchflaschenwärmer	Beliebig		Optional; hilft beim Aufwärmen von kalten Milchlösungen
Tuberkulinspritzen, steril, 1,0 ml	beliebig
Tuberkulinspritzen, steril, 10 ml	beliebig		Kann verwendet werden, um Ethylalkohol herauszuziehen oder Mikropipetten geeigneter Größe zu verwenden
Waage	Alle		Sollte eine gute Auflösung (in Grammeinheiten) haben
Name	Company<	strong>Katalognummer<	strong>Kommentare
>EMG Kopfbühnenherstellung und bipolare Elektrode ModifikationBipolare
Elektrode, 2-Kanal-SS Twisted	Plastics One, Inc.	MS303/2-B/SPC  ELECT SS  2C TW .008"	Muss eine benutzerdefinierte Länge von 20 mm unter dem Sockel angeben www.plastics1.com
Centi-Loc Strip Socket Insulator (auch bekannt als Micro Strip)	ITT Cannon / ITT Interconnect Solutions	CTA4-IS-60* oder CTA4-1S-60*	*Abhängig vom Hersteller; siehe www.onlinecomponents.com oder www.avnetexpress.avnet.com
Dentalzange, gezahnt	CMF Medicon	390.20.05	Kann ersetzt werden; wird zum Crimpen von Drähten an männlichen Kontaktstiften verwendet www.medicon.de
Mikro-Präparierschere, 3,5 Zoll, 23 mm Klingen	Biomedical Research Instruments	11-2200	Nur zum Schneiden von 3T-Drähten verwenden; das Schneiden von 10T-Drähten beschädigt die Klinge - verwenden Sie stattdessen die Klinge der Abisolierzange brisurgical.com
PTFE-beschichteter Edelstahldraht, 10T (blanker Durchmesser .010 in)	Sigmund Cohn-Medwire	316SS10T	www.sigmundcohn.comPTFE-beschichteter
Edelstahldraht, 3T (blanker Durchmesser 0.003 in)	Sigmund Cohn-Medwire	316SS3T	www.sigmundcohn.com
Rasierklinge	Beliebig		Zum Abisolieren von 1 mm von den Zacken der bipolaren Elektrode
Relia-Tac Socket Contact Pin, Male	Cooper Interconnect	220-P02-100	Siehe Allied Electronics Cat # 70144761 www.alliedelec.com
Pinzette, hohe Präzision, gezahnt, 4 3/4 Zoll	Elektronenmikroskopie	Wissenschaften 78314-00D	Zum festen Greifen von 10T Draht beim Abisolieren von PTFE mit einer glatten Pinzette www.emsdiasum.com
Pinzette, hohe Präzision, glatt, 4 3/4 Zoll	Elektronenmikroskopie Wissenschaften	78313-00B	www.emsdiasum.com
Pinzette, ultrafeine Spitzen, 4 3/4 Zoll	Elektronenmikroskopie	Wissenschaften 78510-0	Zum Abisolieren von 1 mm PTFE von einem Ende des 3T-Drahtes; Greifen Sie den abgeschirmten Teil mit einer glatten Pinzette www.emsdiasum.com
Abisolierzange, 16-26 AWG	Beliebig		Verwenden Sie das Klingende, um Mikrostreifen zu schneiden
Name	<>Unternehmen<	strong>Katalognummer<	strong>Kommentare
>Augenlidchirurgie
Chirurgische Instrumente (hochwertiger Edelstahl)2
x Verbandszange, 4 Zoll gezahnt	Biomedizinische Forschungsinstrumente	30-1205	Kann ersetzt werden; zusätzliche Pinzette zum Greifen von Elektroden/Schrauben außerhalb des Operationstabletts brisurgical.com
Verbandzange, 3 Zoll gezackt	Biomedizinische Forschungsinstrumente	30-1200	Kann ersetzt werden brisurgical.com
Instrumentenablage	Biomedizinische Forschungsinstrumente	24-1355	Kann ersetzt werden brisurgical.com
Messergriff Nr. 3, 5 in	Biomedizinische Forschungsinstrumente	26-1000	Kann ersetzt werden brisurgical.com
Mikro-Präparierzange, 3,5 Zoll, feine Spitzen	Biomedizinische Forschungsinstrumente	10-1630	Kann ersetzt werden brisurgical.com
Mikro-Präparierzange, 3,5 Zoll, glatte Plattform (0,3 x 5 mm)	Biomedizinische Forschungsinstrumente	10-1720	brisurgical.com
Mikro-Präparierschere, 3,5 Zoll, extrem empfindlich, 15 mm Klingen	Biomedizinische Forschungsinstrumente	11-2000	Kann ersetzt werden brisurgical.com
Einfache Splitterzange, 3,5 Zoll	Biomedizinische Forschungsinstrumente	30-1600	Kann ersetzt werden brisurgical.com
#10 Chirurgische Klinge aus Edelstahl für #3 Griff, steril	Alle		Kann ersetzt werden
0-80 x 0,125 Zoll Edelstahlschrauben	Plastics One, Inc.	0-80 x 0,125	ersetzt werden www.plastics1.com
Alkohol-Vorbereitungspads, steril	Fisher Scientific	22-363-750 [Fisher	Scientific Kann ersetzt werden www.fishersci.com
Betadine Povidon-Iod	Purdue Frederick Co.	6761815101 [Fisher Scientific]	Kann ersetzt werden www.fishersci.com
Betadine Povidon-Iod Prep Pads	Moore Medical	19-898-946 [Fisher Scientific]	Kann substituiert werden www.fishersci.com
Wattestäbchen, autoklavierbar	Beliebig		Typischerweise 7,6 cm oder 15,2 cm langer
Bohrer für Pin Vise, #55 (0,052 Zoll)	Jedes		Metall sollte Rost und Korrosion widerstehen
Mullpads, 2 Zoll x 2 Zoll	Fisher Scientific	22-362-178 [Fisher Scientific]	Kann ersetzt werden www.fishersci.com
Allzweckhandschuhe aus Latex/Nitril/Vinyl	Beliebig
Glasperlen-Sterilisator	Beliebig		Sterilisieren Sie Instrumente zwischen Operationen Beheizte
Wassertherapiepumpe mit Pads x 2	Gaymar	TP-500	Kann ersetzt werden; separate Pumpen werden empfohlen - 1 für die Chirurgie, 1 für die Wiederherstellung
Injektionsnadeln 26G x 3/8 Zoll, steril	Jedes
Isofluran	Vedco	NDC 50989-150-12	Der Hersteller kann ersetzt werden; Möglicherweise ist eine tierärztliche Genehmigung erforderlich
Isofluran-Verdampfersystem, Tischplatte, nicht reatmende	Parkland Scientific	V3000PK	Kann ersetzt werden www.parklandscientific.com
Juwelierschraubendreher mit 1,8-2 mm Klinge	Jedes		Metall sollte Rost und Korrosion widerstehen
Ortho-Jet BCA-Paket (Zahnzement)	Lang Dental	B1334	Enthält Pulver (1 lb) und Flüssigkeit www.langdental.com
Sauerstofftank mit Druckregler, großer			lokaler
Lieferant Porzellantiegel, hochformig, glasiert, 10 ml	CoorsTek, Inc.	07-965C [Fisher Scientific]	Kann ersetzt werden durch Fisher FB-965-I Wide-Form Tiegel www.fishersci.com
Puralube Veterinary Ophthalmic Salbe, Sterile	Henry Schein Company	NC0144682 [Fisher Scientific]	Kann ersetzt werden www.fishersci.comQuatricide
PV-15	Pharmacal	PV-15	Antimikrobielles Desinfektionsmittel; kann ersetzt werden www.pharmacal.com
Rattengas-Anästhesiemasken für die stereotaktische Chirurgie	Stoelting Company	51610	www.stoeltingco.com
Rat Stereotaxic Apparatus w/ Ear Bars (45 Grad)	Alle		45-Grad-Stangen werden empfohlen, um eine Beschädigung des Trommelfells
zu verhindern Roboz Chirurgisches Instrument	Roboz Surgical	NC9358575 [Fisher Scientific]	Kann ersetzt werden; Zur Schmierung von Instrumenten während des Autoklavierens www.fishersci.com
Nagetier-Haarschneider	Beliebig
Natriumchlorid	Fisher	Scientific S641-500 [Fisher Scientific]	0,9 % Kochsalzlösung herstellen; Reagenzqualität; USP www.fishersci.com
Mikrospatel aus Edelstahl (Klinge: 0,75 L x 0,18 Zoll. W)	Fisher Scientific	21-401-15 [Fisher Scientific]	Kann ersetzt werden www.fishersci.comStarrett
Pin Vise, 0,000 Zoll - 0,055 Zoll	jedem Vernickelt		oder gleichwertig empfohlen, um Rost und Korrosion zu widerstehen
Sterile OP-Handschuhe	Alle
Sterilisationswickel, 20 Zoll x 20 Zoll, autoklavierbar	Propper Manufacturing	11-890-8C [Fisher Scientific]	Nützlich zum Einwickeln von autoklavierbaren Verbrauchsmaterialien und auf sterilem Feld während der Chirurgie www.fishersci.com
Chirurgisches Abdecktuch, steril/autoklavierbar	Beliebig		Möglicherweise muss für Ratten zugeschnitten
OP-Kittel*	Beliebig		*Falls von der IACUC
chirurgischen Maske benötigt	Alle
Tuberkulinspritzen, steril, 1,0 ml	Jede
Waage	Jede		Sollte eine gute Auflösung haben (in Grammeinheiten)
Name	Company<	strong>Katalognummer	Kommentare
Eyeblink System und Komponenten (unter der Annahme eines 4-Nagetier-Systems)
x 4	Plastics One, Inc.	SL2 + 3C	www.plastics1.com
Bipolares Elektrodenkabel, Dual 305 x 4	Plastics One, Inc.	305-305 80CM TT2 (C)	Bietet Steckende für die bipolare Elektrode an der Ratte und für den Kommutator; muss modifiziert werden www.plastics1.com
Kabel, 5 Kanal, geschirmt, 26 AWG x 4	Beliebig		Zur Herstellung von Kommutatorkabeln; dies muss von Grund auf neu hergestellt werden
Kammer für die operante Testbox (innen: 24 H x 23 B x 14 T in) x 4	Med-Associates		ausgetauscht werden; die Innenmaße sollten bequem in die operante Testbox passen, mit Platz für akustischen Schaum; passend für Lüfter - 55-60 dB www.med-associates.comEyeblink
System und Software	JSA Designs	N/A	Proprietär und angepasst für Forschungslabore
Schrumpfschlauch (Durchmesser 3/16 Zoll, 1/4 Zoll, 3/8 Zoll, 1/2 Zoll)	Beliebig		Zum Schutz von modifizierten Kommutatorkabeln, gelöteten Enden und Spleißen
Melamin Triple Peak Akustikschaum mit schwarzem Hypalon (24 x 48 Zoll)	McMaster-Carr	9162T5	Kann ersetzt werden; zugeschnitten auf 4 Gehäusekammern www.mcmaster.com
Operante Testbox (außen 12,5 L x 10 B x 13,5 Zoll H), komplett x 4	Med-Associates	ENV-007 Kundenspezifisches Paket	Mit Edelstahlgitterboden und kundenspezifischer Oberseite (3 Zoll Loch in der Mitte für Kommutatorkabel) www.med-associates.com
Oszilloskop (optional)	Beliebig		Empfohlene Mindestanforderungen: 200 MHz analoge Bandbreite, 1 GS/s Echtzeit-Abtastung, 4 Kanäle; siehe www.picotech.com /td>
Piezo-Hochtöner (Lautsprecher) x 4 (7 x 3 Zoll)	MCM Electronics	53-805	Muss den Frequenzbereichsspezifikationen für das Eyeblink-System (2500 Hz - 25 KHz) entsprechen www.mcmelectronics.com
>Lötstation, Löten, Flussmittel, Zinn	Beliebig		Zum Löten von 26 AWG-Kabeln an Buchsen (die auf Relia-Tac-Kontaktstifte passen) und bipolare Stecker
Stimulus Isolators x 4	WPI International	A365	Diese Geräte werden mit 16-9V Alkalibatterien betrieben; eine geeignete wiederaufladbare Version (A365R) ist erhältlich www.wpiinc.com
Tripolares Elektrodenkabel für SL3C Kommutator x 4	Plastics One, Inc.	335-335 80cm TT3 C	Bietet ein Steckende für den EMG-Kopftisch der Ratte und für den Kommutator; muss geändert werden www.plastics1.comUSB-LED-Leuchten
x 4	USB-basierte		Leuchten verursachen kein elektrisches "Rauschen" mit den EMG-Signalen der Ratten www.plastics1.com
Webcams x 4, Überwachungssoftware	Jeder
PC Computer mit MS Windows OS	Beliebig

Kann Milch In werden 5-Kanal-Kommutator Kann