Die Verwendung von Trace Eyeblink klassische Konditionierung hippocampale Funktionsstörung in einem Rattenmodell der Fetal Alcohol Spectrum Disorders bewerten

Zusammenfassung

Spur Eyeblink klassische Konditionierung (ECC) wurde verwendet, um zu beurteilen hippocampal-abhängige assoziativen Lernens bei erwachsenen Ratten, die eine hohe Konzentration (11,9 % V/V) von Alkohol während der frühen Entwicklung des Neugeborenen Gehirns verabreicht. ECC-Verfahren sind in der Regel fundierte Diagnose-Tools zur Erkennung von Funktionsstörungen des Gehirns über viele psychologische und biomedizinische Einstellungen.

Zusammenfassung

Neugeborene Ratten verabreicht wurden eine relativ hohe Konzentration von Ethylalkohol (11,9 % V/V) während der postnatalen Tagen 4-9, eine Zeit des fetalen Gehirns organisatorischen Wandel unterzogen und ist ähnlich wie beschleunigte Veränderungen im Gehirn, die während des dritten Trimesters beim Menschen auftreten. Dieses Modell der fetale Alkohol-Spektrum-Störungen (FASDs) produziert schwere Hirnschäden, imitiert den Betrag und das Muster der Alkoholexzesse, die in einige alkoholische schwangeren auftritt. Wir beschreiben die Verwendung von Trace Eyeblink klassische Konditionierung (ECC), ein höherer Ordnung-Variante des assoziativen Lernens, langfristige hippocampal Dysfunktion beurteilen, die in der Regel bei Erwachsenen Nachkommen Alkohol ausgesetzt gesehen wird. In 90 Tage alt Nagetiere bereiteten sich chirurgisch mit Aufnahme und stimulierende Elektroden, die elektromyographische (EMG) gemessen blinken Aktivität aus dem linken Augenlid Muskel und leichten Schock posterior auf dem linken Auge, bzw. geliefert. Nach einer 5-Tage Erholungszeit unterzog sie 6 Sitzungen der Ablaufverfolgung ECC zu bestimmen, assoziativen Lernens Unterschiede zwischen Alkohol ausgesetzt und Ratten zu kontrollieren. Trace ECC ist eines der vielen möglich ECC-Verfahren, die leicht geändert werden können mit der gleichen Ausrüstung und Software, so dass verschiedene neuronale Systeme beurteilt werden können. ECC-Verfahren können im Allgemeinen als Diagnose-Tools verwendet werden, für die Erkennung von neuronalen Pathologie in verschiedenen Gehirn-Systeme und andere Bedingungen, die das Gehirn zu beleidigen.

Einleitung

Es ist kaum vorstellbar, dass der Alkoholmissbrauch in der heutigen Zeit bei besserer Gesundheitsversorgung und verbesserter Zugänglichkeit zu Gesundheitsdiensten weiterhin ein großes globales Gesundheitsproblem darstellt. Leider hat sich gezeigt, dass eine schwangere Frau, die große Mengen Alkohol konsumiert, ein Kind mit schweren Hirnschäden und lebenslangen neurodevelopmentellen Störungen zur Welt bringen kann, wie sie bei Betroffenen mit fetalem Alkoholsyndrom (FAS) zu beobachten sind^1,2,3. Bei Frauen mit nachgewiesener mütterlicher Alkoholanamnese ist der sich entwickelnde Fötus ebenfalls geringen Alkoholmengen oder unterschiedlichen Trinkmustern ausgesetzt, die variable Blutalkoholkonzentrationen hervorrufen. In diesem letzteren Fall zeigen die Kinder zwar möglicherweise nicht die schweren morphologischen oder neurobehavioralen Störungen wie bei FAS, können jedoch dennoch lebenslange kognitive Beeinträchtigungen sowie emotionale Auffälligkeiten aufweisen, die von leicht bis schwer reichen^3,4. Insgesamt bilden FAS und weniger schwere Formen pränataler, alkoholbedingter Störungen ein Spektrum sogenannter fetalen Alkoholspektrumstörungen (FASD). Es überrascht nicht, dass FASD vollständig vermeidbar sind, doch verblüffenderweise zeigen Schätzungen, dass sie in Populationen mit verbreitetem Alkoholmissbrauch die wichtigste nicht-genetische Ursache für neuronale und kognitive Behinderungen darstellen und etwa 2 % bis 5 % der jungen Kinder in den USA sowie in europäischen Ländern wie Frankreich und Schweden betreffen. Bezüglich der Inzidenz allein des FAS in den USA liegt die Prävalenz bei 2 bis 7 Fällen pro 1.000 Lebendgeburten⁵, was darauf hindeutet, dass die Gesamtinzidenz von FASD deutlich höher ist als die von FAS.

Neuroimaging-Studien an Kindern mit FASD haben gezeigt, dass sie Gehirnveränderungen aufweisen, wie beispielsweise einen dünneren Balken (Corpus callosum)⁶, einen kleineren vorderen Kleinhirnwurm (anterior cerebellar vermis)⁷ und eine kleinere Hippocampusformation⁸. Diese strukturellen Gehirnveränderungen liegen einigen der langfristigen neurokognitiven Störungen zugrunde, die bei Kindern mit FASD beobachtet werden. Die genauen Zusammenhänge zwischen mütterlichem Alkoholkonsum vermittelten Gehirnveränderungen und den Unterschieden im Profil (d. h. Art, Ausmaß) bestimmter neurokognitiver Beeinträchtigungen sind bisher noch nicht eindeutig geklärt. Als Ausgangspunkt eignet sich jedoch der Hippocampus hervorragend, um seine Anfälligkeit gegenüber pränatalen Alkoholeffekten zu untersuchen. Tatsächlich weisen Kinder mit FASD Defizite in hippocampusvermittelten Verhaltensweisen wie Ortslernen^9,10 und verzögerter Objekterinnerung¹¹ auf.

Nagermodelle von FASD haben sich als äußerst wertvoll erwiesen, um die Mechanismen aufzuklären, die zu den neurokognitiven Störungen führen, die bei Kindern mit FASD beobachtet werden. Ein gut etabliertes Modell der Binge-Exposition, das wir übernommen haben, beinhaltet die Verabreichung von Alkohol an Ratten während der postnatalen Tage 4–9.^12,13, eine Phase, in der das Gehirn eine rasche Bildung von Synapsen und dendritischen Kontakten durchläuft, vergleichbar mit der 24. Schwangerschaftswoche des Menschen und sich bis in die 3^rd Schwangerschaftsdrittel^14,15,16,17Dieses spezielle Modell induziert einen signifikanten Verlust von Hippocampus-Neuronen^18,19 und Neuronen in vielen anderen Hirnregionen wie dem Kleinhirn^{12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23}, begleitet von schweren Beeinträchtigungen kognitiver Funktionen in verschiedenen Bereichen^21,24,25. Kognitive Störungen durch frühe Alkoholexposition bei Ratten können auf verschiedene Weisen untersucht werden, insbesondere mit klassische Augenlid-Konditionierung (ECC). ECC ist ein Paradigma, das seit über einem Jahrhundert verwendet wird, um die grundlegenden Mechanismen des Lernens wissenschaftlich zu untersuchen.^26,27 und bietet somit eine nützliche Methode, um die nachteiligen neurokognitiven Folgen, die aus einer alkoholexponierten Fetalentwicklung resultieren, besser zu verstehen. Es handelt sich um ein äußerst flexibles Paradigma, das es Forschern ermöglicht, eine Vielzahl unterschiedlicher ECC-Verfahren anzuwenden, wobei jedes dieser Verfahren über zahlreiche Säugetierarten hinweg, die auf der phylogenetischen Skala aufsteigen (von Mäusen bis zum Menschen), und zu verschiedenen Phasen der Gehirnentwicklung untersucht werden kann.^28,29,30,31Darüber hinaus werden die grundlegenden neuronalen Schaltkreise, die assoziatives Lernen in diesem Paradigma vermitteln, durch experimentelle und neuropsychologische Befunde bei denselben Arten gestützt.^{26,32,33,34,35,36,37}.

Eine Form der klassischen Konditionierung, die Spur-Konditionierung (trace ECC), wird in dieser Arbeit veranschaulicht (Abbildung 1). Zum besseren Verständnis wird sie mit der traditionelleren Form – der verzögerten Konditionierung (delay ECC) – verglichen. Das ECC-Paradigma orientiert sich an der klassischen Konditionierung mit Hunden, die erstmals vom Nobelpreisträger, dem Physiologen Ivan Pawlow, durchgeführt wurde. Pawlow entdeckte, dass bestimmte Reize wie Töne normalerweise keine Speichelsekretion hervorrufen, dass jedoch die Speichelreaktion verstärkt werden kann, wenn der Ton der Futtergabe vorausgeht und mit ihr überlappt, vorausgesetzt, diese Ton-Futter-Kontingenz bleibt bestehen. Dies ist ein Beispiel für die verzögerte Konditionierung, bei der die assoziative Stärke durch die unmittelbare zeitliche Kontiguität zwischen den beiden Reizen vermittelt wird, wodurch optimale Lernbedingungen für das Tier entstehen. Er testete auch andere Variationen der Ton-Futter-Kontingenz, beispielsweise indem er den Ton ausschaltete und eine „Spur“-Phase verstreichen ließ, bevor das Futter verabreicht wurde. Wenn diese beiden Reize ausreichend diskontinuierlich waren, fiel es den Hunden deutlich schwerer, Speichelsekretionen vor der Futtergabe auszulösen. Die zeitliche Diskontinuität zwischen dem Ausschalten des Tons und der Futtergabe stellt somit ein Beispiel für die Spur-Konditionierung dar. Da Nagetiere nicht spontan auf die Anwesenheit von Futter mit Speichelfluss reagieren, werden artgemäße Reize wie ein leichter elektrischer Reiz verwendet; sie zeigen auch nicht spontan eine defensiv bedingte Augenblinzreaktion auf Töne. Vor diesem Hintergrund beinhalten ECC-Verfahren bei Nagetieren die Präsentation eines Tons auf einem bestimmten Dezibelpegel, der in irgendeiner Weise mit einem leichten elektrischen Reiz am Augenlidmuskel (orbicularis oculi) oder am temporalis-Muskel gekoppelt wird, um eine Augenblinzreaktion hervorzurufen. Der Ton gilt als konditionierter Reiz (CS), während der elektrische Reiz als unkonditionierter Reiz (US) gilt. Bei der verzögerten Konditionierung wird der CS zuerst präsentiert und bleibt für eine bestimmte Dauer eingeschaltet. Danach wird der US verabreicht. Diese beiden Reize überlappen sich für eine gewisse Zeit und enden dann gleichzeitig; die resultierende Augenblinzreaktion, die durch den US ausgelöst wird, wird als unkonditionierte Reaktion (UR) bezeichnet. Bei diesem Verfahren lernen die Nagetiere, Augenblinzreaktionen nach der Präsentation des CS, aber kurz vor dem US, abzugeben, um diesen aversiven Reiz vorherzusehen. Die erlernte Augenblinzreaktion wird als konditionierte Reaktion (CR) bezeichnet. Bei der Spur-Konditionierung sind der CS und der US durch eine reizfreie Zeitspanne getrennt, die als Spur-Intervall bezeichnet wird; sie überlappen zeitlich nicht wie bei der verzögerten Konditionierung. Während dieses Intervalls muss das Tier die assoziativen Anforderungen zwischen den Reizen verarbeiten. Ähnlich wie bei der verzögerten Konditionierung tritt Lernen auf, wenn das Tier konsistent eine Blinkreaktion nach dem Ausschalten des CS, aber unmittelbar vor der Verabreichung des US, zeigt. Über eine gewisse Anzahl von Akquisitionstrainingsdurchgängen (CS gepaart mit US) entwickeln sich Lernkurven (z. B. basierend auf verschiedenen CR-Messungen). Läsions- und Neurobildgebungsstudien zeigen, dass erfolgreiches Lernen bei der verzögerten Konditionierung von einer intakten zerebellär-stammnahen neuroanatomischen Verschaltung abhängt^38,39,40, während die Spur-Konditionierung ein komplexeres Verfahren darstellt, das zusätzliche neuronale Beteiligung des Hippocampus^41,42,43,44 und anderer kortikaler Strukturen^45,46 erfordert. Aufgrund der zeitlichen Anforderungen, die notwendig sind, um Spur-CRs erfolgreich zu erlernen, ist diese Aufgabe auch schwieriger zu erlernen (sogar für gesunde Probanden).

Abbildung 1: Spuren-Augenblicks-Klassische Konditionierung. Es wird eine repräsentative tatsächliche Wellenform eines erwachsenen Rattentiers aus der nicht-intubierten Kontrollgruppe (UC) gezeigt. Der konditionierte Reiz (CS) in Form eines Tons (85 dB, 2,8 kHz) wird zunächst 380 ms lang präsentiert. Anschließend folgt ein Spurintervall von 500 ms, in dem keine Reize präsent sind. Danach wird ein elektrischer Schock als unkonditionierter Reiz (US) (1,6 mA) für 100 ms appliziert. Ein erfolgreiches Lernen in dieser Aufgabe zeigt sich dadurch, dass die Frequenz (%) oder Amplitude (in Volt) der Augenblinzler während des konditionierten Reaktionszeitfensters (gesamte CR-Periode) über mehrere Trainingssitzungen hinweg zunimmt. Insbesondere Nagetiere mit intaktem Hippocampus zeigen gewöhnlich mehr gut zeitlich abgestimmte konditionierte Reaktionen (Adaptive CRs) unmittelbar vor dem Beginn des Schock-US (innerhalb eines 200-ms-Fensters). Startlreaktionen (SRs) innerhalb der ersten 80 ms nach Beginn des Ton-CS sowie unkonditionierte Reaktionen (URs) werden ebenfalls gemessen. Nicht-assoziative Startlreaktionen sind bei gut trainierten Nagetieren typischerweise gering oder nicht vorhanden, während die URs in ihrer Frequenz und Amplitude hoch sein sollten. Diese Aufgabe erfordert, dass das Tier die Assoziation zwischen dem Ende des CS und dem Beginn des US (während des Spurintervalls) herstellt, wodurch sie von Natur aus schwieriger zu erlernen ist als die verzögerte ECC. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Hier zeigen wir die nachteiligen funktionellen Folgen einer alkoholbedingten Exposition in der Neugeborenenphase, die in Form von Binge-ähnlichen Episoden erfolgt, wie sie mittels einer Trace-ECC-Prozedur bewertet wird, bei der ein 85 dB starker Ton-Reiz (2,8 kHz) für 380 ms präsentiert wird, gefolgt von einem 1,6 mA starken Schock-Reiz, der 100 ms anhält, wobei diese Reize durch eine Trace-Phase von 500 ms getrennt sind. Wir haben in früheren Studien über die Nützlichkeit dieses Verhaltensassays berichtet, insbesondere bei der Untersuchung von Cholininterventionen und Eisen-Supplementierung zur Abschwächung der Auswirkungen einer alkoholbedingten Exposition in der Neugeborenenphase^18,47. Tatsächlich kann die Trace-ECC als diagnostisches Werkzeug zur Beurteilung alkoholbedingter hippocampaler Pathologien im Neugeborenenalter eingesetzt werden. Der Vorteil gegenüber der Delay-ECC liegt darin, dass sie empfindlicher gegenüber Störungen der Hippocampusfunktion ist, die bei Menschen mit FASD beeinträchtigt ist.

Die Demonstration der bedingten Augenbewegungsreflexe (ECC) reicht weit über den Bereich des fetalen Alkoholsyndroms hinaus. Viele Varianten der ECC (z. B. verzögert, Spuren-, Verbund- und Umkehrformen) können verwendet werden, um ontogenetische Unterschiede im Lernen während der Entwicklung aufzuklären, die neurobiologischen Grundlagen assoziativen Lernens bei normalen Säugetieren sowie die Anfälligkeit unterschiedlicher Gehirnsysteme gegenüber zahlreichen Einflüssen, einschließlich (aber nicht beschränkt auf) Teratogene, Umweltgifte, traumatische Hirnverletzungen, neurodegenerative Erkrankungen und psychiatrische Störungen.

Protokoll

HINWEIS: Alle Verfahren wurden genehmigt und gemäß den Richtlinien der East Carolina University IACUC durchgeführt. Long-Evans-Ratten wurden erzeugt, indem Weibchen mit männlichen Zuchtratten verpaart wurden. Die Welpen aus allen drei Behandlungsgruppen (siehe 1.1) stammten aus derselben Wurfgruppe einer Mutter. Es wurden fünf Würfe erzeugt, und jeder Wurf wurde am postnatalen Tag (PD) 3 auf 8 Welpen reduziert. Die verbleibenden zwei Welpen jedes Wurfes wurden separaten Experimenten zugeordnet. Sowohl männliche als auch weibliche Nachkommen (jeweils einer pro Expositionsgruppe) wurden in die Studie eingeschlossen. Insgesamt wurden N = 27 erwachsene Nachkommen in dieser Studie untersucht; 3 Ratten mussten aufgrund irreparabler gebrochener 3T-Drahtleitungen (siehe 3.1.1) am ersten Tag des ECC-Trainings ausgeschlossen werden.

1. Vorbereitung der Gruppen, Materialien und Lösungen

1. Am PD 3 die Welpen von der Mutter entfernen und auf eine temperaturregulierte Heizplatte legen, um sie warm zu halten. Die Welpen nach einem Zufallsverfahren auf eine der drei Gruppen verteilen: (1) alkoholintubierte (AI); (2) Schein-intubierte Kontrolle (SI); oder (3) nicht-intubierte Kontrolle (UC). Genehmigte Verfahren zur Kennzeichnung durchführen, beispielsweise [nicht-toxische] Tätowierung der Pfoten mit einem 30G × 1/2 Zoll Kanüle nach einem Nummerierungsschema. Die Welpen nach der Kennzeichnung zur Mutter zurückbringen.
2. Vorbereitung einer intragastrischen Intubationssonde(n) aus Polyethylen (PE) Größe 50 und 10. Die Gesamtlänge dieser Sonde ist abhängig vom Benutzer und kann entsprechend angepasst werden.
   1. Mit Mikroschere ein 7,6 cm langes Stück PE-50-Schlauch und ein 15,2 cm langes Stück PE-10-Schlauch abschneiden.
   2. Das PE-50-Schlauchstück vorsichtig an eine sterile 22G × 2,5 cm Kanüle anbringen.
   3. Ein Ende des PE-10-Schlauchs in das offene Ende des PE-50-Schlauchs einführen. Um das Einleiten in den PE-50-Schlauch zu erleichtern, kann eine diagonale Abschrägung an der Spitze des PE-10-Schlauchs erforderlich sein.
   4. Ein kleines Stück PE-50-Schlauch (ca. 2–3 mm) abschneiden und über das offene Ende des PE-10-Schlauchs schieben. Dies dient als visueller Anschlag.
   5. Die vollständige intragastrische Intubationssonde zur Sterilisation in frischem 70 % Isopropanol aufbewahren.
3. Aseptische Verfahren zur Herstellung einer Milchgrundlösung in 50-mL-Flaschen durchführen. Die Milchgrundlösung basiert auf einer Ernährungsformel, die erstmals von West et al. (1984)⁴⁸ beschrieben wurde. Die Flaschen bis zur Verwendung bei -18 °C lagern. Vor der Verwendung zwei Milchflaschen mit warmem Wasser auftauen.
   1. Mit einer sterilen Spritze 7,16 mL 95 %igen Ethylalkohol (USP) entnehmen und zu einer 50-mL-Milchflasche hinzufügen. Dadurch entsteht eine 11,9 %ige (V/V) Alkohollösung, die den Rattenwelpen während der ersten beiden Fütterungen des Tages verabreicht wird (siehe 2.1.1); die gesamte tägliche Alkoholdosis beträgt 5,25 g/kg/Tag. Die Alkoholgabe erfolgt in einem definierten Volumen (0,0278 mL/g pro Fütterung) in der angereicherten Milchlösung.
      HINWEIS: Diese Menge kann je nach Wurfgröße und erwartetem Verbrauch über 3–4 Tage angepasst werden. Die Menge des zugesetzten Alkohols muss ebenfalls angepasst werden, um eine 11,9 %ige (V/V) Lösung herzustellen.
   2. Die Flasche gut schütteln und entsprechend beschriften (d.h., 11,9 % v/v Ethylalkohol in Milch).
   3. Die zweite Milchflasche (ohne Alkoholzugabe) entsprechend beschriften (z.B., Nur-Milch) und für zusätzliche Fütterungen gemäß 2.1.1 verwenden.
   4. Beide Milchflaschen im Kühlschrank lagern.

2. Alkoholexposition in der Neugeborenenphase (postnatale Tage 4–9)

1. Verabreichen Sie AI- und SI-Würfen insgesamt 4 Intubationen pro Tag, beginnend am postnatalen Tag (PD) 4. Trennen Sie jede Intubation um jeweils 2 h. Da AI-Würfe mit einer tatsächlichen Lösung intubiert werden, gelten alle ihre Intubationen als Fütterungen.
   1. Intubieren Sie die AI-Würfe während der ersten beiden Fütterungen des Tages mit der 11,9 % v/v Ethylalkohol in Milch-Lösung und anschließend während der letzten beiden Fütterungen des Tages mit der Nur-Milch-Lösung, um ihr Wachstum zu unterstützen.
   2. Intubieren Sie die SI-Würfe viermal alle zwei Stunden ohne jegliche Lösung, um eine gleich lange Exposition gegenüber der PE-10-Sonde wie bei den AI-Würfen sicherzustellen. Die UC-Gruppe erhält keine Intubationen.
2. Trennen Sie die Würfe von der Mutter und legen Sie sie auf eine temperaturregulierte Heizplatte, um sie warm zu halten. Wiegen Sie jeden Wurf und notieren Sie sein Körpergewicht (in g). Konsultieren Sie eine vorab erstellte Fütterungstabelle, um das Intubationsvolumen für jeden AI-Wurf zu bestimmen, und vermerken Sie es auf einem Erfassungsbogen.
   1. Stellen Sie die 11,9 % v/v Ethylalkohol in Milch-Lösung in ein warmes Wasserbad und schütteln Sie sie gut durch.
   2. Intragastrale Intubationsprozedur:
      1. Spülen Sie die intragastrale Intubationssonde, die in 70 % Isopropylalkohol aufbewahrt wurde, gründlich mit warmem Wasser aus.
      2. Entnehmen Sie die korrekte Menge der Lösung mit einer sterilen 1-mL-Spritze.
      3. Tauchen Sie die Spitze der Intubationssonde (PE-10-Ende) in frisches Maisöl (dies erleichtert die Einführung).
      4. Messen Sie die Länge der PE-10-Sonde vom Maul des Wurfes bis zum Magen. Stellen Sie den PE-50-Stopp an, um den Stoppunkt zu markieren.
      5. Führen Sie die PE-10-Sonde vorsichtig in das Maul des Wurfes ein, führen Sie sie durch die Speiseröhre, leicht durch den gastroösophagealen Schließmuskel hindurch und in den Magen. Untersuchen Sie den Wurf, stabilisieren Sie ihn und drücken Sie den Spritzenkolben langsam herunter, um die Lösung zu verabreichen. Tun Sie dies langsam.
         HINWEIS: Um zu vermeiden, dass die Sonde versehentlich in die Luftröhre eingeführt wird, richten Sie die Sonde zunächst so aus, dass sie sich krümmt und mit dem weichen Gaumen in Kontakt kommt, bevor sie weiter vorwärts geführt wird. Nutzen Sie den Gaumen als Führungsstruktur, da die Sonde sich von dieser Region natürlich ablenken und in die Speiseröhre geleitet wird. Andernfalls könnte eine deutliche ventrale Abweichung der Spitze dazu führen, dass sie in die Luftröhre eindringt. Falls der Einführort unsicher ist, ziehen Sie die Sonde besser zurück und führen Sie die Intubation nicht fort – versuchen Sie es beim nächsten Mal erneut, mit korrekter Einführung.
      6. Entfernen Sie die PE-10-Sonde vorsichtig und untersuchen Sie den Wurf auf Rückfluss der Lösung, Blut oder physische Verletzungen. Stellen Sie den Wurf zu seinen Wurfgeschwistern zurück, falls er in Ordnung ist. Die gesamte Intubationsprozedur dauert pro Wurf etwa weniger als 1 min und insgesamt etwa 4 min für die vier intubierten Würfe pro Wurf (2 AI, 2 SI).
      7. Intragastrale Intubationsprozedur für SI-Würfe: Führen Sie die gleiche PE-10-Einführprozedur wie bei AI-Würfen durch, jedoch ohne Lösung und für die gleiche Dauer (1 min).
      8. Bringen Sie alle Würfe unmittelbar nach Abschluss der Prozedur am letzten Wurf zurück zur Mutter. Bringen Sie die Mutter zurück in das Vivarium, bis zur nächsten Fütterungssitzung (in 2 h).
      9. Spülen Sie die intragastrale Intubationssonde mit warmem sterilen Wasser aus und stellen Sie sie zur Lagerung wieder in 70 % Isopropylalkohol. Spülen Sie die Sonde vor jeder Fütterungssitzung gründlich mit Wasser aus.
      10. Wiederholen Sie die Schritte 2.2 (außer dem Wiegen der Würfe) bis 2.2.2.9 für die zweite Fütterungssitzung. Bei den letzten beiden Fütterungen intubieren Sie die AI-Würfe mit der Nur-Milch-Lösung unter Verwendung der gleichen Intubationsvolumina, die in 2.2 ermittelt wurden.
3. Wiegen Sie die Ratten in regelmäßigen Abständen, beispielsweise am PD 15 (wenn sich die Augen öffnen), PD 21 (Entwöhnung), PD 30, PD 60 und PD 90 (Operation), um repräsentative Wachstumskurven zu erhalten.

3. Herstellung und Modifizierung von Elektroden

1. Stellen Sie einen elektromyographischen (EMG-)„Headstage“ für jede Ratte her (Abbildung 2). Der Headstage ermöglicht die Aufzeichnung von Augenblinzreflexen über das Augenblinz-System (Abbildung 4).
   1. Stellen Sie einen Headstage her, der aus zwei polytetrafluorethylenbeschichteten (PTFE) Edelstahldrähten der Größe 3T (jeweils 5 cm), einem PTFE-beschichteten Edelstahldraht der Größe 10T (5 cm), drei männlichen Kontaktpins und einem Mikrostreifensockelisolator besteht, der auf 3 Löcher gekürzt wurde (siehe 3.1.4).
   2. Entfernen Sie die PTFE-Beschichtung vom 10T-Draht, indem Sie die Mitte mit einer gezahnten hochpräzisen Pinzette festhalten und die Beschichtung in beide Richtungen mit der glatten hochpräzisen Pinzette abziehen. Stellen Sie sicher, dass alle Reste der Beschichtung von diesem Draht entfernt wurden.
      1. Verpressen Sie ein Ende des 10T-Drahts mit einer gezahnten zahnmedizinischen Zange mit einem Kontaktpin; dieser dient als Erdungsdraht. Halten Sie einen 3T-Draht vorsichtig mit der glatten hochpräzisen Pinzette 1 bis 1,5 mm von einem Ende entfernt. Entfernen Sie die 1 bis 1,5 mm lange PTFE-Beschichtung, wobei der Rest der Beschichtung erhalten bleibt. Verpressen Sie einen Kontaktpin mit dem freigelegten Ende des 3T-Drahts.
      2. Führen Sie die gleichen Schritte für den zweiten 3T-Draht durch. Beide Drähte dienen als positive und negative Leitungen der EMG-Aufnahmeelektroden.
   3. Führen Sie Zugtests an allen Drähten durch, um sicherzustellen, dass sie sicher an den Pins befestigt sind. Achten Sie darauf, die Drähte nicht zu verbiegen oder zu beschädigen.
   4. Schneiden Sie ein Segment eines Sockelisolatorstreifens auf 3,5 Löcher zu (schneiden Sie die Mitte des vierten Lochs ab) mit der Schneidklinge eines Abisolierers. Kürzen Sie dieses Segment auf genau 3 vollständige Löcher und schleifen Sie gegebenenfalls beide Seiten ab. Dies gewährleistet, dass 3 vollständige Löcher verfügbar sind. Führen Sie die Pin-Draht-Einheiten in die drei Löcher des Mikrostreifens ein, bis die verpressten Enden bündig mit der Unterkante des Isolatorsegments abschließen. Die 10T-Baugruppe muss sich in einem äußeren Loch des Mikrostreifens befinden, nicht in der Mitte.
2. Modifizieren Sie bipolare Stimulations-Elektroden (Abbildung 2).
   1. Verwenden Sie für jede Ratte eine bipolare Stimulations-Elektrode. Diese Elektrode leitet über einen Stimulus-Isolator (siehe Augenblinz-System) eine geringe elektrische Strommenge als elektrischen Reiz (US) während der klassischen konditionierten Konditionierung (ECC) ab. Die Elektroden werden vom Hersteller in verdrillter Form geliefert und sind abgeschirmt.
   2. Lösen Sie die beiden Metalladern 2–3 Mal, um eine V-Form (mit einem Abstand von 5 mm) zu erzeugen, und richten Sie dann mit der glatten hochpräzisen Pinzette jede „Zinke“ so gut wie möglich gerade. Schaben Sie mit einer Rasierklinge 1 mm der Abschirmung von der Spitze jeder Zinke ringsum ab. Prüfen Sie jede Zinke auf Unregelmäßigkeiten und Biegungen und korrigieren Sie gegebenenfalls, ohne zusätzliche Abschirmung abzuschaben.
3. Entfernen Sie Herstellungsöl und Fremdpartikel von den EMG-Headstages und bipolaren Elektroden, indem Sie diese in 95 %igem Ethylalkohol waschen. Lassen Sie sie trocknen und sterilisieren Sie sie anschließend im Autoklaven.

Abbildung 2: Elektromyographische (EMG) Ableitelektroden und bipolare Elektrode. Der fertige EMG-Vorverstärker (rechts, orange) wird aus drei männlichen Kontaktpins, zwei PTFE-beschichteten Drähten der Größe 3T und einem PTFE-beschichteten Draht der Größe 10T sowie einem modifizierten Mikrostreifen hergestellt. Die drei Drähte sind jeweils etwa 5 cm lang und mit den Kontaktpins verpresst. Die fertige bipolare Elektrode (rechts, weiß) wird entdrillt, wieder gerade gebogen und V-förmig gegossen (5-mm-Aufspaltung). Die Abschirmung wird an den Spitzen der beiden Zinken entfernt. Klicken Sie hier, um eine vergrößerte Ansicht dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Augenlidchirurgische Prozedur (Postnataler Tag 90)

1. Herstellung der Materialien (siehe Materialien für detaillierte Angaben zu Bezugsquellen), Tiere, chirurgische und nicht-chirurgische Bereiche:
   1. Autoklavieren Sie chirurgische Instrumente und Materialien – die Zahl in Klammern ( ) gibt die ungefähre Menge pro erwachsenen Ratte oder Messung an: chirurgische Instrumente (1 Satz pro 4 Ratten, wie vom ECU IACUC genehmigt), Mullkompressen (3–4), Wattestäbchen (5–6), 20 x 20 Einwickelmatten (4 pro Operationssitzung), Porzellentiegel (1), mikrochirurgischer Spatel aus rostfreiem Stahl (1), 0,9 % Salzlösung (1 Spülfalsche), Petrischale (1) und 0-80 Edelstahlschrauben (3/Ratte).
   2. Weitere sterile Hilfsmittel, die benötigt werden: chirurgisches Skalpell, Größe 10 (1 pro 4 Ratten), chirurgisches Tuch (1 pro Ratte), tierärztliche Augensalbe, Povidon-Iod (1 Spülfalsche), 26G x 3/8" Kanüle (2 Stück), nickelierte Bohrspannvorrichtung mit Bohrer Nr. 55, nickelierte Schlitz-Feinmechanikerschraubendreher (1,8–2 mm Klinge).
   3. Bereiten Sie einen sterilen Ablagebereich für alle chirurgischen Instrumente und Materialien unter Verwendung eines zugelassenen Desinfektionsmittels für Forschungs- bzw. Medizinprodukte vor. Stellen Sie die Materialien auf diesen Bereich, sobald die Fläche bereit ist.
   4. Bereiten Sie einen sterilen chirurgischen Arbeitsbereich unter Verwendung eines zugelassenen Desinfektionsmittels für Forschungs- bzw. medizinische Anwendungen vor. Dieser Bereich umfasst eine temperaturgesteuerte Heizplatte, ein stereotaktisches Gerät mit einer Ratten-Anästhesiemaske, einen Glasperlensterilisator und einen Isofluran-Gasverdampfer (zur Anästhesie). Der Verdampfer ist über Schläuche mit der Anästhesiemaske sowie mit einer Induktionskammer verbunden, die sich in einem separaten Bereich für nicht sterile Tiervorbereitungsmaßnahmen befindet; jeder Schlauch wird durch ein eigenes Ventil gesteuert.
   5. Hände und Arme gründlich mit antimikrobieller Seife schrubben. Alle in Sterilisationsbeuteln oder -tüchern verpackten Gegenstände vorab öffnen, ohne das Innere zu berühren. Sterile Handschuhe unter aseptischen Bedingungen anlegen und alle erforderlichen Gegenstände in den Operationsbereich bringen. Den Bohrer im Pinzettenhalter auf die korrekte Tiefe einstellen (~ 2 mm) und den Schraubendreher vorbereiten. Die sterilen Materialien bis zum Beginn der Operation mit einem sterilen Tuch abgedeckt lagern.
   6. Bereiten Sie einen nicht sterilen Arbeitsbereich mit einer Waage, einem elektrischen Felltrimmer, sterilen 1-mL-Spritzen mit 26G × 3/8-Zoll-Nadeln (1 pro Ratte), einem Operationsprotokoll und Buprenorphin (0,03 mg/mL Konzentration), verabreicht in einer Dosis von 0,1 mL pro 100 Gramm Körpergewicht, vor.
      ACHTUNG: Buprenorphin ist ein halbsynthetisches Opioid der DEA-Schedule III und muss entsprechend gesichert und dokumentiert werden.
   7. Überprüfen Sie den Isofluran-Vaporisator auf den entsprechenden Gaspegel; füllen Sie bei niedrigem Stand nach. Lassen Sie die Gasfluss- und Mischungsregler vorerst ausgeschaltet. Schalten Sie das O₂ Tanken Sie nach und prüfen Sie, ob ausreichend Gas für alle Operationen vorhanden ist.
   8. Wägen Sie jede Ratte und notieren Sie das Körpergewicht im Operationsprotokoll. Verwenden Sie eine Buprenorphin-Injektions-Tabelle, um das korrekte Injektionsvolumen zu bestimmen.
   9. Schalten Sie das Ventil des Verdampfers auf die Induktionskammer ein und lassen Sie das Ventil zur Operationsmaske ausgeschaltet. Stellen Sie die Mischung auf 3 und die Flussrate auf 3 (3 % Isofluran mit 100 % O₂).₂ als Trägergas mit einem Volumenstrom von 3 L/min.
   10. Stellen Sie eine Ratte in die Induktionskammer und warten Sie, bis die geeignete Narkosetiefe erreicht ist (verlangsamte Atmung, fehlender Pedalreflex, fehlender Lidschlussreflex). Entfernen Sie die Ratte aus der Kammer, sobald die Narkosetiefe erreicht ist.
   11. Rasieren Sie den Kopf mit dem Felltrimmer, sodass eine ausreichende Menge Haut für die Inzisionsstelle und das linke Augenlid freiliegt. Falls erforderlich, platzieren Sie das Tier erneut in der Induktionskammer, um den Narkosezustand erneut zu erreichen, bevor Sie mit dem Rasieren fortfahren.
   12. Desinfizieren Sie die freigelegte Haut, indem Sie abwechselnd dreimal Isopropylalkohol und Povidon-Iod anwenden. Falls erforderlich, bringen Sie das Tier vor der Übertragung auf den Operationstisch erneut in die Induktionskammer, um die Anästhesietiefe erneut zu erreichen.
2. Chirurgie
   1. Schalten Sie das Ventil des Verdampfers zur Anästhesiemaske ein und schließen Sie das Ventil zur Induktionskammer. Stellen Sie die Mischung auf 2,5 und die Flussrate auf 2 ein (2,5 % Isofluran mit 100 % O₂).₂ als Trägergas mit einem Volumenstrom von 2 L/min). Überführen Sie die Ratte in die stereotaktische Vorrichtung und befestigen Sie den Kopf nach Standardverfahren am Zahntisch und den Ohrstiften (siehe Geiger et al., 2008)⁴⁹ als Beispiel).
   2. Verabreichen Sie der Ratte eine präoperative Injektion von Buprenorphin (s.c.) und entsorgen Sie die Nadel sorgfältig (unverschlossen) in einem Spitzenbehälter. Legen Sie ein steriles chirurgisches Tuch über die Ratte, wobei lediglich der Operationsbereich freigelegt und vom übrigen Körper abgegrenzt wird.
   3. Tragen Sie eine chirurgische Maske, eine chirurgische Haube, einen chirurgischen Kittel, Schutzbrille und jegliche sonstige vom IACUC vorgeschriebene persönliche Schutzausrüstung. Waschen und schrubben Sie Hände und Arme gründlich mit antimikrobieller Seife. Ziehen Sie sterile Handschuhe unter Anwendung eines sterilen Verfahrens an.
   4. Tragen Sie mit einem Wattestäbchen eine kleine Menge Augensalbe auf beide Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
   5. Fahren Sie mit der Operation fort, wenn die Ratte die geeignete Narkosetiefe erreicht hat. Überwachen Sie die Ratte während der gesamten Operation kontinuierlich und überprüfen Sie in regelmäßigen Abständen die Isofluran-Konzentration. Stellen Sie den Durchfluss und die Mischungsregler entsprechend während der Operation basierend auf der Reaktion der Ratte auf die Anästhesie ein.
   6. Führen Sie mit einer Skalpellklinge einen anteroposterioren Schnitt entlang der Mittellinie des Schädels durch. Dieser Schnitt sollte einen ausreichenden Bereich vor den Augen (d. h. die Exposition des Stirnbeins) sowie leicht hinter der Lambdasnaht freilegen.
   7. Entfernen Sie vorsichtig das Periost von der Schädelkalotte, um keine übermäßige Blutung zu verursachen. Entfernen Sie überschüssiges Bindegewebe und Blut mit einem Wattestäbchen.
   8. Bohren Sie ein Loch mit dem Bohrer unter Verwendung einer Pinzette, beginnend direkt hinter der Sagittalsutur an einem Parietalbein. Entfernen Sie Blut und Knochenabfälle mit einem Wattestäbchen. Greifen Sie eine 0-80-Schraube an dem Gewinde mit Splitterpinzette und befestigen Sie sie mit einem Uhrmacherschraubendreher in dem Bohrloch; ziehen Sie die Schraube gerade so fest an, dass das kortikale Hirngewebe nicht beschädigt wird (üblicherweise 3–4 volle Umdrehungen).
   9. Befolgen Sie die in 4.2.8 beschriebenen Verfahren, um zwei weitere 0-80-Schrauben am Schädel zu befestigen, eine direkt hinter der Sagittalspalte des gegenüberliegenden Parietalbeins und eine direkt vor der rechten Lambdaspalte. Es hat sich gezeigt, dass drei Schrauben ausreichen, um den Zement (siehe 4.2.18) am Schädel zu verankern, da eine vierte Schraube (vor der linken Lambdaspalte) die Platzierung der bipolarer Elektrode behindern würde.
   10. Entfernen Sie eine EMG-Kopfplatine aus der Petrischale. Richten Sie die Kopfplatine so aus, dass der 10T-Draht auf der rechten Seite der Ratte liegt. Biegen Sie den 10T-Draht nach oben, sodass er parallel zur unteren Kante des Mikrostreifens verläuft. Biegen Sie ihn leicht nach rechts, damit der Draht um die vorderen und hinteren 0-80-Schrauben herumgeführt werden kann. Legen Sie sie beiseite, aber nahe genug, um sie leicht erreichen zu können.
   11. [Unter der Annahme, dass man rechtshändig ist] Halten Sie die Pinzette mit 3 Zinken in der linken Hand und die Pinzette mit 4 Zinken in der rechten Hand. Fassen Sie mit der 4-zinkigen Pinzette die obere Haut an der Einschnittstelle des linken Auges und führen Sie die 3-zinkige Pinzette zur Augenecke; greifen Sie die Haut an dieser Ecke an. Behalten Sie den Griff mit der 3-zinkigen Pinzette bei und lösen Sie gleichzeitig den Griff der 4-zinkigen Pinzette.
   12. Nehmen Sie eine 26G x 3/8 Zoll-Nadel und führen Sie sie durch die Augenlidkante ein; drehen Sie die Nadel, sodass die abgeschrägte Seite nach oben zeigt. Verwenden Sie die mikrochirurgische Pinzette mit Plattform, um den mittleren 3T-Draht in die Öffnung der Nadel einzuführen. Schieben Sie ihn einige Zentimeter durch die Öffnung, ohne ihn vollständig nach unten durchzuführen; dieser Draht ist die negative Elektrode.
   13. Führen Sie die in 4.2.11 und 4.2.12 beschriebenen Schritte durch, um den äußeren 3T-Draht in den mittleren Abschnitt des Augenlids einzuführen; dieser Draht ist die positive Leitung.
   14. Halten Sie beide Nadeln mit einer Hand, während Sie mit der anderen Hand das Headstage (oder eine Pinzette) festhalten. Ziehen Sie die Nadeln in einer kontinuierlichen Bewegung vom Augenlid weg, wobei Sie das Headstage in dieselbe Richtung führen. Falls erforderlich, drehen Sie das Headstage so, dass der 10T-Draht zum rechten Auge des Tieres weist; achten Sie darauf, dass sich die 3T-Drähte nicht überkreuzen. Überprüfen Sie mit einer feinen Pinzette, ob die positive Leitung in der Mitte des Augenlids sitzt.
   15. Stellen Sie den Headstage so ein, dass er mittig zwischen den Augen liegt und optimal auf dem Frontalbein platziert ist, anterior zu den bilateral eingesetzten Schrauben. Halten Sie den Headstage mit einer Hand und die 3-Zoll-Tupferzange mit der anderen Hand. Wickeln Sie den 10T-Draht um eine oder beide Schrauben auf der 10T-Seite.
   16. Halten Sie eine 3-Zoll-Debakelpinzette in der einen Hand und eine 4-Zoll-Debakelpinzette in der anderen Hand. Verwenden Sie die 3-Zoll-Debakelpinzette, um die Haut an der Inzisionsstelle in Richtung linkes Schläfenbein zu fassen. Nutzen Sie die 4-Zoll-Debakelpinzette, um durch Ablösen der Haut (d. h. der oberflächlichen Faszie) vom Musculus temporalis eine kleine „Tasche“ zu bilden. Schneiden Sie mit der Iris-Schere weiteres Bindegewebe ab, indem Sie sich zur linken Augenecke hin vorarbeiten, um die Größe dieser Tasche zu vergrößern. Achten Sie darauf, nicht zu tief einzudringen oder Blutgefäße zu verletzen.
   17. Nehmen Sie eine bipolarer Elektrode und formen Sie die Drahtanschlüsse so, dass sie entlang der Krümmung des Musculus temporalis verlaufen können, wobei die beiden Zinken dorsal und ventral hinter dem linken Auge positioniert sind (siehe Video), und das untere Ende der bipolaren Elektrode direkt auf dem Schädel platziert werden kann. Achten Sie darauf, genügend Abstand zwischen dem Headstage und dieser Elektrode zu lassen, um Platz für die Stecker des Kommutatorkabels zu schaffen.Abbildung 3) um ungehindert anzulagern.
   18. Geben Sie das Pulver des Zementmaterials in den Tiegel – beginnen Sie mit etwa einem Drittel des Tiegels und passen Sie die Menge anschließend entsprechend an. Fügen Sie die flüssige Komponente hinzu, bis eine wässrige Konsistenz erreicht ist, und mischen Sie beide Komponenten mit dem Spatel. Sobald der Zement eine dickflüssigere Konsistenz annimmt, tragen Sie ihn auf die Schnittstelle auf, wobei alle Hautränder mit einem Rand von mindestens 1/8 Zoll abgedeckt werden müssen.
       1. Tragen Sie so viel Klebstoff auf, dass die Kopfhalterung und die bipolare Elektrode stabilisiert werden, ohne die Ratte daran zu hindern, beide Augen zu schließen. Wischen Sie sofort jeden Klebstoff ab, der auf unerwünschte Bereiche des Fells der Ratte tropft.
   19. Stellen Sie sicher, dass mindestens 4–5 Gewindegänge der bipolaren Elektrode unversiegelt bleiben, damit der bipolare Stecker aufgeschraubt werden kann.Abbildung 3). Entfernen Sie überschüssigen Zement von der Kopfplatte – die Oberseite des Mikrostreifens und die drei Kontaktstifte müssen sauber sein. Der Zement härtet schnell aus und könnte andernfalls verhindern, dass einer dieser Elektroden vollständig mit den Steckverbindern des Kommutatorkabels verbunden wird. Verwenden Sie Splitterpinzetten, um überschüssigen, teilweise getrockneten Zement zu entfernen.
   20. Warten Sie, bis der Kleber aushärtet; er wird dann durchsichtig. Kürzen Sie mit einer mikrochirurgischen Schere die überstehenden Längen der beiden 3T-Drähte auf wenige Zentimeter Arbeitslänge.
   21. Nehmen Sie die mikrochirurgische Pinzette mit Plattform in die linke Hand und die mikrochirurgische Pinzette mit feinen Spitzen in die rechte Hand. Fassen Sie einen 3T-Draht mit der linken Pinzette leicht vor dem Augenlid. Mit der rechten Pinzette schieben Sie das Augenlid nach oben, um mehr vom 3T-Draht freizulegen, und halten Sie es dort fest. Lassen Sie die linke Pinzette los und greifen Sie mit der linken Hand das Headstage (stellen Sie sicher, dass es fest sitzt). Nutzen Sie die rechte Pinzette, um etwas PTFE-Isolierung abzustreifen, wodurch der Draht Kontakt herstellen kann Orbicularis oculi Muskel
       HINWEIS: Achten Sie darauf, beim 3T-Draht nicht zu stark zu ziehen, da er sich sonst vom Kontaktstift lösen könnte. Falls ein Draht sich löst, ist ein Austausch des Kontaktstifts nicht mehr möglich, da der gehärtete Zement sich ohne Knochenbruch nicht frei vom Schädel lösen lässt.
   22. Führen Sie die Schritte in 4.2.21 durch, um überschüssiges PTFE vom zweiten 3T-Draht zu entfernen.
   23. Greifen Sie die beiden mikrochirurgischen Pinzetten wie in 4.2.21 beschrieben auf (Plattform links, feine Spitzen rechts). Positionieren Sie die linke Pinzette leicht vor einem der 3T-Drähte, wobei genügend Platz bleibt, um die rechte Pinzette direkt vor dem Augenlid zu positionieren. Fassen Sie den Draht mit beiden Pinzetten.
       1. Erzeugen Sie einen „Haken“, indem Sie die rechte Pinzette ruhig halten und die linke Pinzette in einer Bewegung nach oben und herum in Richtung Augenlid drehen. Lösen Sie vorsichtig zuerst die rechte und dann die linke Pinzette.
          HINWEIS: Das Befestigen der Elektroden an den Augenlidern hilft, die Möglichkeit zu minimieren, dass sie auf die Hornhaut reiben. Dies verringert zudem die Wahrscheinlichkeit eines Drahtbruchs während jeder Phase der Verhaltensmessung. Obwohl das Befestigen nicht vollständig verhindert, dass der Draht bei allen Tieren gegen die Hornhaut reibt, zeigen diese in der Regel keine Anzeichen von Augenschäden, was sich in hohen Blinkamplituden (gemessen mittels digitalem Oszilloskop in 5.1.7) und täglichen postoperativen Gesundheitskontrollen widerspiegelt (übermäßiges Tränen, teilweises Schließen der Augenlider, Bewegungsunfähigkeit aufgrund von Augenschäden). Zeigt eine Ratte anfängliche Anzeichen von Unbehagen, wird sie mit Isofluran anästhesiert (siehe 4.1.10) und ihre Elektroden werden erneut überprüft und/oder neu positioniert. Es wird ein Augensalbe aufgetragen, um Austrocknung der Hornhaut zu verhindern. Die Ratte wird täglich auf eventuelle postoperative Augenkomplikationen überwacht; falls diese andauern, ist tierärztliche Behandlung erforderlich. Ratten, die schwere Augenkomplikationen aufweisen, die weder durch Neupositionierung der Elektroden noch durch tierärztliche Behandlung behoben werden können, werden gemäß den Standardarbeitsanweisungen des ECU IACUC human entnommen.
   24. Führen Sie die Schritte in 4.2.23 für den zweiten 3T-Draht durch. Schneiden Sie den überschüssigen Draht mit der mikrochirurgischen Schere ab.
   25. Halten Sie den Körper der Ratte mit der einen Hand, während Sie mit der anderen Hand die Ratte aus den Ohrhalterungen befreien. Untersuchen Sie den Kopf auf Blut oder Ablagerungen, reinigen Sie ihn gegebenenfalls und verabreichen Sie eine postoperative Injektion mit Buprenorphin.
   26. Stellen Sie die Ratte in eine Wanne zur Erholung, die eine Wärmequelle (wie ein temperaturreguliertes Heizkissen mit Wasserdurchlauf) enthält, um die Genesung zu unterstützen. Tragen Sie im Operationsprotokoll die Endzeit der Operation sowie alle relevanten Notizen bezüglich der Ratte während des Eingriffs ein. Überwachen Sie die Ratte auf regelmäßige Atmung, und sobald sie Brustlage einnimmt oder sich bewegt, kann sie in ihren Heimkäfig zurückgebracht werden.
   27. Desinfizieren Sie die Instrumente erneut (außer der Mikro-Dissektionspinzette – da diese beschädigt werden könnte) mit dem Glasperlen-Sterilisator und stellen Sie sicher, dass der chirurgische Bereich aseptisch bleibt; wiederholen Sie die aseptischen Verfahren, wenn mehrere Augenlidoperationen durchgeführt werden.

5. Spur-Augenlid-Klassische-Konditionierung-Verfahren

Abbildung 3: Modifizierter operanter Konditionierungskasten für Augenlidkonditionierung. Ratten sind frei bewegliche Säugetiere, weshalb ein rotierender Kommutator verwendet wird, um den elektrischen Signalfluss von den am Kopf befestigten EMG- und bipolarer Steckverbindungen aufrechtzuerhalten. Der Kommutator ist an der Halterungsarm befestigt, der gegengewichtet ist, um Druck auf die Ratte zu vermindern. Ein Piezo-Hochtöner (Lautsprecher) gibt einen 2,8-kHz-Ton bei 85 dB aus, und diese Werte werden regelmäßig kalibriert. Akustikschaum hilft dabei, Umgebungsgeräusche zu dämpfen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Augenblick-Konditionierungssystem. Dieses speziell angefertigte System besteht aus einer EMG-Integrator-Einheit, die eingehende Signale von den Ratten filtert und verstärkt, einer Stimulus-Steuerungseinheit, die neben Tönen und Reizen verschiedene Stimuli abgibt, einem Vorverstärker für jeden Operantenkasten zur Erhöhung des EMG-Signalverstärkungsgrades und einem Stimulus-Isolator für jeden Operantenkasten; es ermöglicht die Einstellung unterschiedlicher Reizstärken (in mA). Ein digitales Oszilloskop (nicht Bestandteil des Standard-Augenblick-Systems) wird zu diagnostischen Zwecken während der Gewöhnung und beim Erwerb verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Ansicht dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Beginnen Sie die Gewöhnung und die Erwerbstraining 5 Tage nach der Operation. Geben Sie jeder Ratte einen Tag zum Anfassen und zur Gewöhnung an die Trainingsvorrichtung – bestehend aus einer modifizierten operanten Konditionskammer, die in einer größeren schallgedämpften Kammer untergebracht ist (Abbildung 3) – gefolgt von 6 Tagen Erwerbstraining. Führen Sie die Gewöhnungs- und Erwerbssitzungen mit einem selbstgebauten Augenblinksystem durch (Abbildung 4).
   1. Erstellen Sie eine Trainingsprotokolldatei und drucken Sie sie aus, um tägliche Aufzeichnungen zu führen. In diesem Protokoll sollten die Ratten vorab pseudozufällig (oder nach einer anderen Randomisierungsmethode) ihren Trainingskammern zugewiesen sein.
   2. Schalten Sie das Augenblinksystem und den Computer ein und starten Sie die Augenblinks-Software. Diese Softwareversion verfügt über verschiedene unabhängig laufende Module (oder Anwendungen). Starten Sie das Tiermodul, um eine *.RAT-Datei zu erstellen, die Versuchsinformationen enthält (Sitzungsnummer, Tier-ID, Geschlecht, Gewicht und Kammernummer). Eine einzelne RAT-Datei verwaltet bis zu vier Ratten, was eine Versuchsgruppe (Squad) darstellt. Geben Sie die entsprechenden Werte ein und speichern Sie die Datei. Erstellen Sie für jede zu trainierende Rattengruppe eine separate RAT-Datei.
   3. Bringen Sie die Ratten vom Tierhaltungsraum in den Versuchsraum und schließen Sie die Tür. Fassen Sie jede Ratte 5 Minuten lang an.
   4. Bringen Sie eine Ratte in ihre vorgesehene Kammer und verbinden Sie die EMG- und Bipolare-Stecker des Kommutatorkabels mit dem entsprechenden EMG-Kopfverstärker und der bipolaren Elektrode am Kopf der Ratte.
      HINWEIS: Bei der ersten Begegnung mit dem Kommutatorkabel kann eine Ratte Widerstand leisten und Stresssymptome zeigen. Gehen Sie vorsichtig mit der Ratte um und gewähren Sie Pausen zwischen erfolglosen Anbringungsversuchen, um den Stress zu verringern.
   5. Verwenden Sie einen Kommutator, der sich um 360° dreht und gleichzeitig die elektrische Signalübertragung/Empfang aufrechterhält, während sich die Ratte frei innerhalb der Kammer bewegt. Er verfügt über 5 Kanäle (3 für die EMG-Elektroden, 2 für die bipolaren Elektroden), die in die EMG-Integratoreinheit führen, welche das Rohsignal filtert und verstärkt.
   6. Stellen Sie sicher, dass sich die Ratte frei bewegen kann und nicht durch das Gewicht der Kommutatorkabelanordnung oder des Haltearms behindert wird. Passen Sie gegebenenfalls das Gegengewicht an der Rückseite des Haltearms an. Überprüfen Sie, ob alle Stecker fest sitzen, und schließen Sie dann die Kammertür. Führen Sie denselben Anschluss- und Kontrollvorgang für alle Ratten durch.
   7. Verwenden Sie ein Oszilloskop, um die EMG-Aktivität auf abnormale Signale (z. B. hochfrequente und/oder hochamplitudige elektrische Aktivität) zu überwachen, und ein Videosurveillance-System, um den Zustand der Tiere (z. B. motorische Aktivität, Empfindlichkeit gegenüber der Umgebung, Schmerzzeichen) zu überprüfen, falls verfügbar. Notieren Sie alle beobachteten Probleme im Trainingsprotokoll.
   8. Lassen Sie die Ratten sich 10 Minuten lang an ihre Kammern gewöhnen und bringen Sie sie anschließend in ihre Heimkäfige zurück.
   9. Reinigen und desinfizieren Sie die operanten Kammern, kehren Sie den Boden und säubern Sie die Tische. Führen Sie diese Maßnahmen nach jeder Sitzung durch.
2. Das Erwerbstraining erfolgt über 6 aufeinanderfolgende Tage (Sitzungen).
   1. Tag 1: Bringen Sie eine Ratte in ihre vorgesehene Kammer und verbinden Sie die EMG- und Bipolare-Stecker des Kommutatorkabels mit dem entsprechenden EMG-Kopfverstärker und der bipolaren Elektrode am Kopf der Ratte. Führen Sie die in 5.1.6 und 5.1.7 angegebenen Verfahren durch.
   2. Schalten Sie die Stimulusisolatoren ein und stellen Sie den Strom auf 0,4 mA (4 % von 10 mA, wie im Video gezeigt). Die Isolatoren liefern den elektrischen Strom abwechselnd (d. h. von Versuch zu Versuch) an die dorsalen und ventralen Zinken der bipolaren Elektrode. Dies hilft, die Ermüdung der Muskelfasern (an jeder Muskelstelle) bei wiederholten Stimulusanwendungen zu reduzieren.
   3. Beobachten Sie alle emittierten Augenblinksreaktionen und tolerierten Reizstärken in jedem Versuch für alle Ratten. Erhöhen Sie nach jedem zweiten Versuch die US-Schockintensität um 0,4 mA für jede Ratte, bis 1,6 mA erreicht sind (in den Versuchen 7 und 8). Überprüfen Sie, ob alle Ratten normal in ihren Kammern reagieren, ob alle Verstärkungs- und Verstärkereinstellungen konstant sind und ob korrekte elektrische Signale (d. h. geringes oder kein EMG-Rauschen) von ihnen ausgehen. Verwenden Sie für alle Tage des Erwerbstrainings eine Schock-US-Intensität von 1,6 mA.
      HINWEIS: Wenn eine Ratte Schmerz bei einer bestimmten Schockintensität zeigt (z. B. hoch vom Boden springen, an Wänden hochklettern, herumlaufen), wird der Versuch unterbrochen und die Ratte erhält zwei Versuche lang den vorherigen mA-Wert (0,4 mA niedriger). Danach wird erneut der nicht tolerierte höhere Schockwert verabreicht; zeigt die Ratte Toleranz, werden die Werte weiter erhöht, bis 1,6 mA erreicht sind. Falls die Ratte keinen Wert toleriert, wird der nächstniedrigere Wert (in 0,4-mA-Schritten), bei dem Toleranz gezeigt wird, für das gesamte Training verwendet.
   4. Verwenden Sie ein Oszilloskop, um die EMG-Aktivität auf abnormale Signale (z. B. hochfrequente und/oder hochamplitudige elektrische Aktivität) zu überwachen, und ein Videosurveillance-System, um den Zustand der Tiere (z. B. motorische Aktivität, Empfindlichkeit gegenüber der Umgebung, Schmerzzeichen) zu überprüfen.
      HINWEIS: Erklärung der Trace-ECC: Eine repräsentative Versuchsperiode mit aufgezeichneten EMG-Wellenformen ist in Abbildung 1 dargestellt, und das Trace-ECC-Verfahren wird im Video ausführlich erklärt. Die Spurkonditionierungs-Trainingsdatei ist so eingestellt, dass 100 Versuche durchgeführt werden (90 gepaarte CS-US-Versuche und 10 CS-allein-Versuche jeweils im 10^ten Versuch) mit einem durchschnittlichen Intertrial-Intervall von 30 Sekunden. Die gesamte Trainingssitzung dauert etwa 52 Minuten (vorausgesetzt, es gibt keine Unterbrechungen). Alle Ratten sind in Sitzung 1 naiv und entwickeln im Verlauf mehrerer Trainingstage differenzielle Lernkurven (bestimmt durch die Expression konditionierter Reaktionen, CRs).
   5. Starten Sie das Training: Führen Sie das Blink-Softwaremodul aus. Wählen Sie bei Aufforderung die korrekte RAT-Datei und die Trainingsdatei für die „Spur“-Augenblinks-Konditionierung aus.
   6. Notieren Sie die Startzeit und den Namen des Versuchsleiters im Trainingsprotokoll. Überwachen Sie zu diesem Zeitpunkt alle Aktivitäten: korrekte EMG-Signale, gute Augenblinksreaktionen auf den Schock-US (d. h. hohe/häufige URs), Gesundheitszustand der Tiere und ordnungsgemäße Funktion der Hardware. Notieren Sie alle bemerkenswerten Beobachtungen im Trainingsprotokoll.
   7. Die Datensammlung wird automatisch von der Software als RAW-Dateien erfasst (eine pro Ratte und Tag). Die RAW-Dateien enthalten EMG-Amplituden (in Volt), Frequenzzählungen, Latenz- und Flächendaten für Schreckreaktionen (SRs), URs und CRs (insgesamt und adaptiv). Der Schockartefakt überdeckt die ersten 100 ms des UR-Zeitraums; daher enthalten nur die letzten 140 ms des UR-Zeitraums UR-Daten.
   8. Am Ende des Trainings schließt die Software automatisch. Entfernen Sie alle Ratten aus ihren Trainingskammern und bringen Sie sie in den Tierhaltungsraum zurück.
   9. Wiederholen Sie die Schritte 5.2.5–5.2.6 für alle folgenden Trainingstage. Aktualisieren Sie vor dem Start des Blink-Moduls an einem bestimmten Tag die Sitzungsnummer in der RAT-Datei. Dadurch werden an diesem Tag neue RAW-Dateien für alle Ratten erstellt. Jede Ratte sollte 6 RAW-Dateien haben, vorausgesetzt, keine wurde aus dem Training entfernt.
3. Verarbeiten Sie die RAW-Dateien und erstellen Sie eine gefilterte Datei für die statistische Analyse.
   1. Führen Sie das Analysemodul aus. Überprüfen Sie jede Sitzung jeder Ratte versuchsweise auf problematische Versuche. Dies dient dazu, Versuche auszusortieren, die aus verschiedenen Gründen beeinträchtigt sein könnten (z. B. übermäßige Vor-CS-Grundlinienaktivität, übermäßige Bewegung, Elektrodenablösung, Kabel-/Drahtprobleme). Die Software verfügt über Algorithmen, die dem Versuchsleiter helfen, „schlechte Versuche“ zu erkennen und aus dem gefilterten Datensatz auszuschließen.
   2. Importieren Sie die gefilterten Daten in ein Tabellenkalkulationsprogramm und führen Sie die relevanten statistischen Analysen durch.

Ergebnisse

Die Eyeblink Software ist in der Lage eine große und umfassende Reihe von Daten für viele Arten von Messungen. Aus Platzgründen berichten wir in dieser Studie ergibt sich Vertreter für lernen und Leistung Maßnahmen, die adaptive CR Prozentsatz, adaptive CR Amplitude, UR-Prozentsatz und UR-Amplitude enthalten. Die adaptive CR-Zeitraum wurde gewählt, weil es den Erwerb von gut getimten Eyeblink Antworten über wiederholte Schulungen durch verbesserte synaptische Plastizität im Hippocampus während Spur ECC^50,51,52darstellt. Die UR-Maßnahmen wurden ausgewählt, um aufzuklären, ob die Neugeborenen Alkohol-induzierten lernen Defizite im ECC verfolgen aufgrund von Störungen im assoziativen Lernens oder Störungen bei der Reaktion auf den Schock waren uns - die motivationalen oder motor Unterschiede anstatt lernen Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen hinweisen können. Daten für jede einzelne Maßnahme wurden mit 2 (Sex) X 3 (neonatale Group) X 6 (Session) gemischt ANOVAs mit Session als Faktor wiederholt Maßnahmen analysiert. Signifikanten Haupteffekte für neonatale Behandlung wurden mittels Tukey post-hoc-Tests analysiert und signifikante Wechselwirkungen wurden mit einfachen Effekten Tests analysiert. Alle statistischen Analysen wurden mit einer minimalen alpha-Niveau von 0,05 durchgeführt und die Ergebnisse in Diagrammen sind Mittelwert ± SEM

Beginnend mit der adaptiven CR Prozentsatz Maßnahme, die ANOVA angegeben ein signifikanten Haupteffekt der neonatalen Gruppe F(2,21) = 11.69, p < 0,001, aber keine signifikanten Haupteffekt des Geschlechts (p = 0,71) oder signifikante Wechselwirkung zwischen diesen Faktoren (p = 0,20). Wie erwartet, adaptive CR Prozentsatz erhöht über die sechs Sitzungen des Trainings, F(5, 105) = 81.15, p < 0,001 und die Unterschiede zwischen den Neugeborenen Gruppen waren angewiesen auf einer bestimmten Ebene Sitzung, F(10, 105) = 4,58, p < 0,001. Es gab keine anderen signifikanten Wechselwirkungen mit der Sitzung Faktor. Ebenso für adaptive CR Amplitude, gab es wieder ein signifikanten Haupteffekt der neonatalen Gruppe F(2,21) 22,32, p = < 0,001, aber keine signifikanten Haupteffekt des Geschlechts (p = 0,21) oder signifikante Wechselwirkung zwischen diesen Faktoren (p = 0,48). CR-Amplitude erhöht auch deutlich über der sechs Sitzungen des Trainings, F(5, 105) 59.27, p = < 0,001 und die Unterschiede zwischen den Neugeborenen Gruppen waren angewiesen auf einer bestimmten Ebene Sitzung, F(10, 105) 4.31, p = < 0,001. Insgesamt zeigten beide CR-Maßnahmen erhebliche Unterschiede zwischen der Gruppe und diese Mittel bei verschiedenen Sitzungen des Trainings deutlich getrennt. Um zu bestätigen, welche Gruppen deutlich unterschieden, Tukey post-hoc-Tests zeigten, dass der Alkohol intubiert (AI) Ratten deutlich schlechter zu beiden CR-Maßnahmen als die unintubated-Kontrolle (UC) und Schein intubiert (SI) Ratten durchgeführt (p < 0,01 für CR-Anteil; p < 0.001 für CR-Amplitude), die nicht voneinander unterscheiden (p> 0,05). Einfache Effekte auf die bedeutende neonatale Gruppe x Session Interaktionen für beide CR-Maßnahmen, bestätigt, dass die AI-Ratten mehr erheblich, beim Erwerb von CRs Sitzung 2 Beginn und Durchführung beeinträchtigt wurden auf Session 6 im Vergleich zu UC und SI Ratten durchgeführt (alle p< 0,05), die in sechs Sitzungen nicht voneinander unterscheiden. Die einzige Ausnahme war adaptive CR Amplitude für SI Ratten nicht unterscheiden sich deutlich von AI Ratten bis 3 Uhr Sitzung begann. Diese Ergebnisse sind in Abbildung 5A, 5 bgezeigt.

Es gab keine signifikanten Unterschiede in der UR-Maßnahmen aufgrund von Geschlecht, neonatale Gruppe oder Wechselwirkungen dieser Faktoren mit der Sitzung Faktor. Diese negativen Ergebnisse zeigten, dass jede Gruppe durfte Eyeblink Antworten auf den Schock, die uns ebenso emittieren, und, dass das Lernen Defizite bei den AI-Ratten beobachtet nicht durch motivierende oder motor Unterschiede beeinflusst in blinken (Abbildung 6A, 6 b).

Abbildung 5 : Übernahme der Spur bedingt reagiert (Mittelwert ± SEM). Anfang Alkohol Exposition (AI-Gruppe) beeinflusst deutlich Erwerb von adaptive konditionierte Reaktion (CR) Prozentsatz (A) und Amplitude (B). Trace ECC ist von Natur aus schwer zu erwerben, daher die Maßnahmen sind relativ niedriger für alle Gruppen - mit Verzögerung ECC, Prozentsätze erreichen 80-85 % in Nager-Modelle von Kraniofasziale^21,53. Dennoch ist die Ablaufverfolgung ECC-Verfahren mehr Besteuerung auf den Hippocampus, die ist anfällig für Alkohol Auswirkungen während der frühen Entwicklung des Gehirns. * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001 zwischen UC und AI Ratten; Stichprobengrößen sind in Klammern angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6 : Übernahme von Unconditioned Antworten (Mittelwert ± SEM). Eyeblink Leistung (Prozentsatz der UR und UR-Amplitude) war nicht signifikant unterschiedlich zwischen den Gruppen. Der Mangel an Unterschiede zeigen, dass die Schock Intensität während der Ausbildung Übernahme änderten nicht differentiell Motivation bei den AI-Ratten oder ihre Fähigkeit, defensive produzieren blinken Antworten auf den Schock, im Vergleich zu beiden Kontrollgruppen (UC und SI). Stichprobengrößen sind in Klammern angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

Neonatalen Ratte Welpen, die Äthyl-Alkohol während der postnatalen Tagen 4-9 erhalten ausgestellt Spur Eyeblink Konditionierung Beeinträchtigungen im Erwachsenenalter. Diese Ergebnisse unterstützen die Idee, dass Alkohol Teratogen dauerhaften nachteilige Auswirkungen auf hippocampal Funktion. Insgesamt, Klimaanlage in der Spur-Verfahren reagiert war niedriger für Ratten, Alkohol im Vergleich zu Ratten in beiden Kontrollgruppen ausgesetzt. Die assoziativen Lernens Beeinträchtigungen bei der Alkohol-exponierten Ratten waren unbeeinflusst von motivationalen oder motor Unterschiede (d. h.., keine Unterschiede im Schock U.S. Intensität blinkend).

Während Trace ECC ein nützliches Diagnosetool für erhellendes Herausforderung-induzierte hippocampal Neuropathologie ist, müssen die Ergebnisse dieser Methode in den richtigen Kontext gesetzt werden. Zunächst beteiligt die wichtige Verfahrenselemente in dieser Demo die gezielte Gabe von Alkohol während einer bekannten Fenster der Anfälligkeit für das sich entwickelnde Gehirn, Herstellung von Elektrode Hardware, erlaubt die Aufzeichnung von elektromyographische Aktivität und liefert Schock, chirurgische Implantation der oben genannten Hardware und anschließende Tierversuche mit ein Learning-Paradigma, die eine kognitive Funktion von Interesse bewertet. In jeder Phase des Prozesses muss darauf geachtet werden, die Nager Themen nicht unnötig/unbeabsichtigten Schaden zuzufügen und ihre Gesundheit Zeichen, regelmäßig zu überwachen. Ihres Verhaltens Ergebnisse liefern das "Fenster" zur Erkenntnis, ein psychologisches Konstrukt, das ist nur genau beschrieben wann ihre Gesundheit nicht durch experimentelle Fehler umfasst Alkohol Dosierung, Hardware-Defekte oder chirurgische Implantation beeinträchtigt wird. Somit muss jeder Verfahrenselement in den Forschungsprozess in einer gesunden Art und Weise implementiert werden, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse von ECC Feststellungen in den Menschen übertragbar sind. Zweitens, das ECC-Paradigma bietet einen Einblick auf die Art des assoziativen Lernens, aber geachtet werden nicht zu Ergebnisse mit diesem Ansatz zu erweitern und sie weitgehend auf andere kognitive Bereiche - wie z. B. Arbeitsspeicher, kurz-/langfristige Erinnerungen und Bewusstsein - zuschreiben, wenn man einige Facetten dieser Domänen innerhalb einer ECC-Studie von experimentellen Design übernommen hat. Zum Beispiel diese Demonstration der Akquisitionsphase Spur ECC lernen untersucht, aber Merkfähigkeit bei den Ratten habe nicht geprüft, nachdem sie die Ausbildung abgeschlossen. Speicher ist somit eine unabhängige psychologische Prozess, der neben lernen ausgewertet werden soll. Durch Design kann man eine Erinnerung Aufbewahrung Intervall, um entweder kurz- oder langfristigen Speicher-Fähigkeit beurteilt integrieren. Drittens, Erkennung gibt es parallelen Speicher Systeme⁵⁴ , die möglicherweise gleichzeitig funktionieren zusammen mit motivierenden, Erlebnispädagogik und hormonelle Faktoren beitragen zu Verhalten, ist essenziell für Verständnis, die Assoziativität (während ECC) ist aber eine der vielen Prozesse, die zeigen, was "gut" oder "schlecht" über das lernen. Zu guter Letzt ist Spur ECC keine rein hippocampal-abhängige Aufgabe wie andere Hirnregionen ein Teil der Tschechischen Republik vermitteln können. So muss ein Verständnis der Wechselwirkungen zwischen verschiedenen neuronalen Schaltkreise und/oder der Art der Anregung Parameter, die in einer Studie verwendet werden berücksichtigt werden bei der Auswirkungen anhand der diskreten Ergebnisse. Das Kleinhirn trägt beispielsweise auch zur Ablaufverfolgung ECC, wo es die topographischen Merkmale der CR und CR timing beeinflusst, besonders wenn die ISI kurzer Dauer ist. Spur ECC wirkt nicht bei Menschen mit Kleinhirn Schäden, die mit einem langen Spur Intervall (1000 ms) getestet, sondern wirkt sich bei denjenigen, die eine kürzere Spur Intervall (400 ms)³⁴erhalten. Darüber hinaus bilaterale Läsionen des dorsalen medialen präfrontalen Kortex (mPFC), die auf der anterioren cingulären und medialen Agranular Regionen bei Mäusen verhindern, Erwerb von Trace CRs⁵⁵, während Zerstörung der kaudalen mPFC bei Kaninchen ähnliche Ergebnisse⁴⁶produziert. Diese Ergebnisse weisen auch wie wichtig es ist, wenn man bedenkt, dass Artenunterschiede im präfrontalen Beiträge zur zerebelläre Gehirn ergeben sich angetriebenen assoziativen lernen, wie Spur ECC. Während neonatale Alkohol Exposition bei PD 4-9 beeinträchtigt Akquisition von 500 ms Spur CRs für Erwachsenen in dieser und anderer Studien^{47,56 Ratten}, ist dies nicht der gleiche Fall für neonatale Alkohol ausgesetzt Ratten, die eine 300-ms Spur Intervall zu erleben, auch wenn bei einer relativ hohen Dosis von Alkohol (5 g/kg)⁵⁷, darauf hindeutet, dass die Ablaufverfolgung Beeinträchtigung bei Alkohol-exponierten Ratten abhängig von der Dauer des Intervalls Spur ist in Frage gestellt.

In dieser Studie wurde der Hippocampus betont, wie von entscheidender Bedeutung für die Vermittlung Spur ECC, und wenn von Neugeborenen Alkohol Exposition, herausgefordert wird im Zusammenhang mit neuronalen Schäden Exponate Beeinträchtigungen beim Erwerb von Trace CRs widerspiegelt. Es muss warnte jedoch, dass die Kleinhirn-Gehirn Stammzellen Schaltung, besonders der Interpositus Kern, für viele Facetten des ECC, einschließlich Erwerb, Ausdruck und topografische Merkmale der CR, abhängig von der ECC Aufgabe einschließlich Spur ECC^{36,40,55,58,59}unerlässlich. In der Tat interagiert diese neuralen Schaltkreis mit der Hippocampus für die Expression von CRs während höherer Ordnung Formen der ECC, wie Spur ECC⁶⁰fahren. Es ist nicht ganz klar, ob Alkohol Exposition während der frühen Entwicklung des Gehirns betrifft speziell hippocampal Funktion im Trace ECC. Viele verschiedene Hirnregionen sind anfällig für frühen Alkohol Beleidigung, einschließlich mPFC, Kleinhirn und Hippocampus^{18,19,23,47,61,62}, und es ist sehr wahrscheinlich, dass Alkohol stört die Funktionsweise dieser Strukturen in unterschiedlichem Umfang und unterschiedlicher, aber funktionell wichtige Unterschiede über viele ECC-Verfahren. Trotz der Fallstricke bezüglich der Interpretation der Ergebnisse von Trace ECC Studien erfolgreiche Akquisition von Trace CRs nachweislich mindestens ein intakter Hippocampus, abhängig von tierischen Läsion Studien^{42,44,63,64,65}unterstützt. Dieses Verfahren bleibt somit einen wertvollen Ansatz für den Nachweis der Verbindungen zwischen Entwicklungsstörungen Alkohol Exposition zu verfolgen bedingt reagiert, weil die neuralen Schaltkreis zugrunde liegt, ist viel besser verstanden als die der anderen hippocampal-abhängige Aufgaben wie Ort lernen in Morris Wasser-Irrgarten, neuartige Objekterkennung und kontextuellen und Spur Konditionierung zu befürchten.

ECC als Verhaltensstörungen Methode "Kognition, assay" hat weit verbreiteten Anwendbarkeit auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie Neuroteratology. In der Tat, neueste Erkenntnisse aus unserem Labor unterstützen das Konzept, die Entwicklung Hippocampus sehr empfindlich auf Alkohol Wirkungen, die durch verschiedene interventionelle Strategien^18,47gemindert werden kann. Der Hauptvorteil ist, dass ein besseres Verständnis der Alkohol-induzierten Spur ECC lernen Defizite sie prädiktiv für andere Probleme im Hippokampus-basierte Funktionen außerhalb der assoziativen Lernens - insbesondere bekannt durch die gleichen hippocampal Neurocircuitry vermittelt werden können.

Anwendung von Trace ECC und seinen anderen Varianten (z.B., Verzögerung, Umkehr, Diskriminierung, Verbindung), die neurobiologischen Mechanismen und assoziativen Lernens beteiligten neuronalen Systeme aufzuklären kann über den Bereich der fetalen Alkohol-Forschung erweitert werden. Beispielsweise hat dieses Paradigma in menschlichen Fällen und Tiermodellen der psychiatrischen Erkrankungen wie Schizophrenie^66,67, Neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit^68,69, und Drogen Missbrauch^70,71,72viel Aufmerksamkeit erhalten. Ihre Vorteile als Forschungsmethode, neurokognitiven Funktion und Dysfunktion zu beurteilen sind somit offensichtlich in vielen psychologischen und biomedizinische Disziplinen, einschließlich der Neurowissenschaften.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Exposition gegenüber Alkohol bei Neugeborenen
190 Proof Ethylalkohol (USP)	Pharmco-AAPER	225-36000 [ECU Medical Storeroom]	Kann ersetzt werden; sollte USP sein; vermeiden Sie die Verwendung von 200 Proof Ethylalkohol
Behälter / Korb für Welpen	Jedes
Maisöl	Jede
erhitzte Wassertherapiepumpe in Lebensmittelqualität mit / Pads	Gaymar	TP-500	Um Welpen warm zu halten; kann ersetzt werden
Injektionsnadeln 22G x 1 Zoll, Steril	Alle
Injektionsnadeln 30G x 1/2 Zoll, Steril	Alle
Isopropylalkohol 70%	EMD Millipore	PX1840-4 [Fisher Scientific]	Kann ersetzt werden; Reagenz Qualität www.fishersci.com
Long-Evans-Ratten (weibliche und männliche Züchter)	Charles River Laboratories	N/A [ECU Abt. für vergleichende Medizin]	Alter und Gewicht müssen angegeben werden; die Preise variieren je nach folgenden Faktoren www.criver.com
Mikro-Präparierschere, 3,5 Zoll, 23 mm Klingen	Biomedizinische Forschungsinstrumente	11-2200	Zum Schneiden von PE-Schläuchen brisurgical.com
Polyethylen 10 Schläuche (0,011 Zoll. Ausweis; 0,024 Zoll O.D.)	BD Diagnostic Systems	22-204008 [Fisher Scientific]	Kann ersetzt werden www.fishersci.com
Polyethylen 50 Schlauch (0,023 Zoll. Ausweis; 0,038 Zoll O.D.)	BD Diagnostic Systems	22270835 [Fisher Scientific]	Kann ersetzt werden www.fishersci.com
>Geregelter Wasserkocher oder Babymilchflaschenwärmer	Beliebig		Optional; hilft beim Aufwärmen von kalten Milchlösungen
Tuberkulinspritzen, steril, 1,0 ml	beliebig
Tuberkulinspritzen, steril, 10 ml	beliebig		Kann verwendet werden, um Ethylalkohol herauszuziehen oder Mikropipetten geeigneter Größe zu verwenden
Waage	Alle		Sollte eine gute Auflösung (in Grammeinheiten) haben
Name	Company<	strong>Katalognummer<	strong>Kommentare
>EMG Kopfbühnenherstellung und bipolare Elektrode ModifikationBipolare
Elektrode, 2-Kanal-SS Twisted	Plastics One, Inc.	MS303/2-B/SPC  ELECT SS  2C TW .008"	Muss eine benutzerdefinierte Länge von 20 mm unter dem Sockel angeben www.plastics1.com
Centi-Loc Strip Socket Insulator (auch bekannt als Micro Strip)	ITT Cannon / ITT Interconnect Solutions	CTA4-IS-60* oder CTA4-1S-60*	*Abhängig vom Hersteller; siehe www.onlinecomponents.com oder www.avnetexpress.avnet.com
Dentalzange, gezahnt	CMF Medicon	390.20.05	Kann ersetzt werden; wird zum Crimpen von Drähten an männlichen Kontaktstiften verwendet www.medicon.de
Mikro-Präparierschere, 3,5 Zoll, 23 mm Klingen	Biomedical Research Instruments	11-2200	Nur zum Schneiden von 3T-Drähten verwenden; das Schneiden von 10T-Drähten beschädigt die Klinge - verwenden Sie stattdessen die Klinge der Abisolierzange brisurgical.com
PTFE-beschichteter Edelstahldraht, 10T (blanker Durchmesser .010 in)	Sigmund Cohn-Medwire	316SS10T	www.sigmundcohn.comPTFE-beschichteter
Edelstahldraht, 3T (blanker Durchmesser 0.003 in)	Sigmund Cohn-Medwire	316SS3T	www.sigmundcohn.com
Rasierklinge	Beliebig		Zum Abisolieren von 1 mm von den Zacken der bipolaren Elektrode
Relia-Tac Socket Contact Pin, Male	Cooper Interconnect	220-P02-100	Siehe Allied Electronics Cat # 70144761 www.alliedelec.com
Pinzette, hohe Präzision, gezahnt, 4 3/4 Zoll	Elektronenmikroskopie	Wissenschaften 78314-00D	Zum festen Greifen von 10T Draht beim Abisolieren von PTFE mit einer glatten Pinzette www.emsdiasum.com
Pinzette, hohe Präzision, glatt, 4 3/4 Zoll	Elektronenmikroskopie Wissenschaften	78313-00B	www.emsdiasum.com
Pinzette, ultrafeine Spitzen, 4 3/4 Zoll	Elektronenmikroskopie	Wissenschaften 78510-0	Zum Abisolieren von 1 mm PTFE von einem Ende des 3T-Drahtes; Greifen Sie den abgeschirmten Teil mit einer glatten Pinzette www.emsdiasum.com
Abisolierzange, 16-26 AWG	Beliebig		Verwenden Sie das Klingende, um Mikrostreifen zu schneiden
Name	<>Unternehmen<	strong>Katalognummer<	strong>Kommentare
>Augenlidchirurgie
Chirurgische Instrumente (hochwertiger Edelstahl)2
x Verbandszange, 4 Zoll gezahnt	Biomedizinische Forschungsinstrumente	30-1205	Kann ersetzt werden; zusätzliche Pinzette zum Greifen von Elektroden/Schrauben außerhalb des Operationstabletts brisurgical.com
Verbandzange, 3 Zoll gezackt	Biomedizinische Forschungsinstrumente	30-1200	Kann ersetzt werden brisurgical.com
Instrumentenablage	Biomedizinische Forschungsinstrumente	24-1355	Kann ersetzt werden brisurgical.com
Messergriff Nr. 3, 5 in	Biomedizinische Forschungsinstrumente	26-1000	Kann ersetzt werden brisurgical.com
Mikro-Präparierzange, 3,5 Zoll, feine Spitzen	Biomedizinische Forschungsinstrumente	10-1630	Kann ersetzt werden brisurgical.com
Mikro-Präparierzange, 3,5 Zoll, glatte Plattform (0,3 x 5 mm)	Biomedizinische Forschungsinstrumente	10-1720	brisurgical.com
Mikro-Präparierschere, 3,5 Zoll, extrem empfindlich, 15 mm Klingen	Biomedizinische Forschungsinstrumente	11-2000	Kann ersetzt werden brisurgical.com
Einfache Splitterzange, 3,5 Zoll	Biomedizinische Forschungsinstrumente	30-1600	Kann ersetzt werden brisurgical.com
#10 Chirurgische Klinge aus Edelstahl für #3 Griff, steril	Alle		Kann ersetzt werden
0-80 x 0,125 Zoll Edelstahlschrauben	Plastics One, Inc.	0-80 x 0,125	ersetzt werden www.plastics1.com
Alkohol-Vorbereitungspads, steril	Fisher Scientific	22-363-750 [Fisher	Scientific Kann ersetzt werden www.fishersci.com
Betadine Povidon-Iod	Purdue Frederick Co.	6761815101 [Fisher Scientific]	Kann ersetzt werden www.fishersci.com
Betadine Povidon-Iod Prep Pads	Moore Medical	19-898-946 [Fisher Scientific]	Kann substituiert werden www.fishersci.com
Wattestäbchen, autoklavierbar	Beliebig		Typischerweise 7,6 cm oder 15,2 cm langer
Bohrer für Pin Vise, #55 (0,052 Zoll)	Jedes		Metall sollte Rost und Korrosion widerstehen
Mullpads, 2 Zoll x 2 Zoll	Fisher Scientific	22-362-178 [Fisher Scientific]	Kann ersetzt werden www.fishersci.com
Allzweckhandschuhe aus Latex/Nitril/Vinyl	Beliebig
Glasperlen-Sterilisator	Beliebig		Sterilisieren Sie Instrumente zwischen Operationen Beheizte
Wassertherapiepumpe mit Pads x 2	Gaymar	TP-500	Kann ersetzt werden; separate Pumpen werden empfohlen - 1 für die Chirurgie, 1 für die Wiederherstellung
Injektionsnadeln 26G x 3/8 Zoll, steril	Jedes
Isofluran	Vedco	NDC 50989-150-12	Der Hersteller kann ersetzt werden; Möglicherweise ist eine tierärztliche Genehmigung erforderlich
Isofluran-Verdampfersystem, Tischplatte, nicht reatmende	Parkland Scientific	V3000PK	Kann ersetzt werden www.parklandscientific.com
Juwelierschraubendreher mit 1,8-2 mm Klinge	Jedes		Metall sollte Rost und Korrosion widerstehen
Ortho-Jet BCA-Paket (Zahnzement)	Lang Dental	B1334	Enthält Pulver (1 lb) und Flüssigkeit www.langdental.com
Sauerstofftank mit Druckregler, großer			lokaler
Lieferant Porzellantiegel, hochformig, glasiert, 10 ml	CoorsTek, Inc.	07-965C [Fisher Scientific]	Kann ersetzt werden durch Fisher FB-965-I Wide-Form Tiegel www.fishersci.com
Puralube Veterinary Ophthalmic Salbe, Sterile	Henry Schein Company	NC0144682 [Fisher Scientific]	Kann ersetzt werden www.fishersci.comQuatricide
PV-15	Pharmacal	PV-15	Antimikrobielles Desinfektionsmittel; kann ersetzt werden www.pharmacal.com
Rattengas-Anästhesiemasken für die stereotaktische Chirurgie	Stoelting Company	51610	www.stoeltingco.com
Rat Stereotaxic Apparatus w/ Ear Bars (45 Grad)	Alle		45-Grad-Stangen werden empfohlen, um eine Beschädigung des Trommelfells
zu verhindern Roboz Chirurgisches Instrument	Roboz Surgical	NC9358575 [Fisher Scientific]	Kann ersetzt werden; Zur Schmierung von Instrumenten während des Autoklavierens www.fishersci.com
Nagetier-Haarschneider	Beliebig
Natriumchlorid	Fisher	Scientific S641-500 [Fisher Scientific]	0,9 % Kochsalzlösung herstellen; Reagenzqualität; USP www.fishersci.com
Mikrospatel aus Edelstahl (Klinge: 0,75 L x 0,18 Zoll. W)	Fisher Scientific	21-401-15 [Fisher Scientific]	Kann ersetzt werden www.fishersci.comStarrett
Pin Vise, 0,000 Zoll - 0,055 Zoll	jedem Vernickelt		oder gleichwertig empfohlen, um Rost und Korrosion zu widerstehen
Sterile OP-Handschuhe	Alle
Sterilisationswickel, 20 Zoll x 20 Zoll, autoklavierbar	Propper Manufacturing	11-890-8C [Fisher Scientific]	Nützlich zum Einwickeln von autoklavierbaren Verbrauchsmaterialien und auf sterilem Feld während der Chirurgie www.fishersci.com
Chirurgisches Abdecktuch, steril/autoklavierbar	Beliebig		Möglicherweise muss für Ratten zugeschnitten
OP-Kittel*	Beliebig		*Falls von der IACUC
chirurgischen Maske benötigt	Alle
Tuberkulinspritzen, steril, 1,0 ml	Jede
Waage	Jede		Sollte eine gute Auflösung haben (in Grammeinheiten)
Name	Company<	strong>Katalognummer	Kommentare
Eyeblink System und Komponenten (unter der Annahme eines 4-Nagetier-Systems)
x 4	Plastics One, Inc.	SL2 + 3C	www.plastics1.com
Bipolares Elektrodenkabel, Dual 305 x 4	Plastics One, Inc.	305-305 80CM TT2 (C)	Bietet Steckende für die bipolare Elektrode an der Ratte und für den Kommutator; muss modifiziert werden www.plastics1.com
Kabel, 5 Kanal, geschirmt, 26 AWG x 4	Beliebig		Zur Herstellung von Kommutatorkabeln; dies muss von Grund auf neu hergestellt werden
Kammer für die operante Testbox (innen: 24 H x 23 B x 14 T in) x 4	Med-Associates		ausgetauscht werden; die Innenmaße sollten bequem in die operante Testbox passen, mit Platz für akustischen Schaum; passend für Lüfter - 55-60 dB www.med-associates.comEyeblink
System und Software	JSA Designs	N/A	Proprietär und angepasst für Forschungslabore
Schrumpfschlauch (Durchmesser 3/16 Zoll, 1/4 Zoll, 3/8 Zoll, 1/2 Zoll)	Beliebig		Zum Schutz von modifizierten Kommutatorkabeln, gelöteten Enden und Spleißen
Melamin Triple Peak Akustikschaum mit schwarzem Hypalon (24 x 48 Zoll)	McMaster-Carr	9162T5	Kann ersetzt werden; zugeschnitten auf 4 Gehäusekammern www.mcmaster.com
Operante Testbox (außen 12,5 L x 10 B x 13,5 Zoll H), komplett x 4	Med-Associates	ENV-007 Kundenspezifisches Paket	Mit Edelstahlgitterboden und kundenspezifischer Oberseite (3 Zoll Loch in der Mitte für Kommutatorkabel) www.med-associates.com
Oszilloskop (optional)	Beliebig		Empfohlene Mindestanforderungen: 200 MHz analoge Bandbreite, 1 GS/s Echtzeit-Abtastung, 4 Kanäle; siehe www.picotech.com /td>
Piezo-Hochtöner (Lautsprecher) x 4 (7 x 3 Zoll)	MCM Electronics	53-805	Muss den Frequenzbereichsspezifikationen für das Eyeblink-System (2500 Hz - 25 KHz) entsprechen www.mcmelectronics.com
>Lötstation, Löten, Flussmittel, Zinn	Beliebig		Zum Löten von 26 AWG-Kabeln an Buchsen (die auf Relia-Tac-Kontaktstifte passen) und bipolare Stecker
Stimulus Isolators x 4	WPI International	A365	Diese Geräte werden mit 16-9V Alkalibatterien betrieben; eine geeignete wiederaufladbare Version (A365R) ist erhältlich www.wpiinc.com
Tripolares Elektrodenkabel für SL3C Kommutator x 4	Plastics One, Inc.	335-335 80cm TT3 C	Bietet ein Steckende für den EMG-Kopftisch der Ratte und für den Kommutator; muss geändert werden www.plastics1.comUSB-LED-Leuchten
x 4	USB-basierte		Leuchten verursachen kein elektrisches "Rauschen" mit den EMG-Signalen der Ratten www.plastics1.com
Webcams x 4, Überwachungssoftware	Jeder
PC Computer mit MS Windows OS	Beliebig

Kann Milch In werden 5-Kanal-Kommutator Kann