Imaging Neurone innerhalb Dickhirnschnitten Mit der Golgi-Cox-Methode

Summary

Wir präsentieren ein Protokoll der Golgi-Cox-Färbung in dicken Hirnschnitten für die Verwendung, um Neuronen mit langen Dendritenbäume innerhalb einzelner Gewebeproben enthalten ist, zu visualisieren. Zwei Varianten dieses Protokolls werden auch vorgestellt, Kresylviolett Gegenfärbung einzubeziehen und das Einfrieren von nicht verarbeiteten Gehirne für die Langzeitlagerung.

Abstract

Der Golgi-Cox-Methode von Neuron-Färbung ist seit mehr als zweihundert Jahren beschäftigt unser Verständnis der neuronalen Morphologie innerhalb histologischen Hirnproben vorzurücken. Zwar ist es aus praktischer Sicht zu bevorzugen ist, um Hirnschnitt bei der größten Dicke möglich ist, um die Wahrscheinlichkeit des Identifizierens stained Neuronen zu erhöhen, die vollständig innerhalb einzelnen Abschnitte enthalten ist, herzustellen, ist dieser Ansatz aus technischen Sicht von dem Arbeitsabstand von hohen begrenztem Lineare Wiedergabe Mikroskopobjektive. Wir berichten hier über ein Protokoll Neuronen färbt das Golgi-Cox-Verfahren in Mausgehirnschnitte verwenden, die bei 500 & mgr; m Dicke geschnitten werden, und Neuronen in der gesamten Tiefe dieser Abschnitte zur Visualisierungen mit einem hochauflösenden 30X 1,05 NA Silikon ausgerüstet ein aufrechtes Mikroskop Ölimmersionsobjektiv, das einen 800 um Arbeitsabstand aufweist. Wir berichten auch zwei nützliche Varianten dieses Protokolls, das verwendet werden kann, um die Oberfläche des gegenzufärbenmontiert Gehirnschnitt mit der Kresylviolett Nissl-Färbung, oder ganze Gehirne für die Langzeitlagerung vor dem Schneiden und Endverarbeitung gefrieren. Das Hauptprotokoll und seine zwei Varianten produzieren gefärbte dicke Hirnschnitten, wobei durchwegs voll Neuron Dendritenbäume und Dendriten Stacheln können zuverlässig sichtbar gemacht und quantifiziert werden.

Introduction

Die Visualisierung von einzelnen Neuronen innerhalb von Gewebeproben ermöglicht die in - situ - Analyse von Neuronen morphologischer Eigenschaften, die unser Verständnis des Gehirns deutlich fortgeschritten sind und wie sie durch endogene Krankheit oder exogene Umweltfaktoren beeinflusst werden. Die Golgi-Cox-Färbeverfahren sind ein kostengünstiges, relativ einfaches Mittel eine Stichprobe von Neuronen im Gehirn Anfärben. Zuerst von Golgi ¹ entwickelt und modifiziert von Cox ² in den 1800er Jahren haben die Forscher weiter verfeinert , diese Technik im Laufe der Jahre klar, gut gefärbten Neuronen zu er....

Protocol

Erwachsene weibliche CD1-Stamm-Mäuse wurden in dieser Studie verwendet. Ähnliche Färbung kann unter Verwendung beider Geschlechter in verschiedenen Altersstufen durchgeführt werden. Versuchstiere wurden nach den Grundsätzen und Richtlinien des Canadian Council on Animal Care betreut, und das experimentelle Protokoll wurde von der University of Guelph Animal Care Committee genehmigt.

1. Golgi-Cox Staining

1. Golgi-Cox Imprägnierung von Brains
   1. Macht die Golgi-Cox Lösung von 1% (w / v) Kaliumdichromat, 0,8% (w / v) Kaliumchromat und 1% (w / v) Quecksilberchlorid durch das Kaliumdichromat Auflösen und Kaliumc....

Results

500 & mgr; m dicke Gehirnschnitte - Dieses Golgi-Cox-Färbung Protokoll und seine beiden beschriebenen optionalen Varianten können einzelne Neuronen innerhalb von 400 zu visualisieren eingesetzt werden. Repräsentatives Bild montages von zweidimensionalen Z-Projektionen Ziel unter Verwendung eines 10X aufgefangen und 5 um Schritte in der Z - Achse ist in Abbildung 1 gezeigt: A1 - C1 für einen großen Bereich der koronalen Hirnschnitten, die den anterioren cingulären Cor.......

Discussion

Wir beschreiben hier ein Golgi-Cox Färbeprotokolls zusammen mit zwei nützliche Varianten für Neuronen im dicken Hirnschnitten sichtbar zu machen. Wie in den Repräsentative Ergebnisse gezeigt, die Verwendung eines hochauflösenden Ziel, die eine lange 800 & mgr; m Arbeitsabstand hat ermöglicht die zuverlässige Visualisierung der gesamten Neuronen über die gesamte Tiefe des Gehirns bei 500 & mgr; m geschnitten Abschnitte. Diese Studie von relativ dicken Hirnschnitten erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass gefärbt Neur.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kaliumdichromat	Fisher Scientific	P188-100	Gefährliches
Kaliumchromat	Fisher Scientific	P220-100	Gefährliches
Quecksilberchlorid	Fisher Scientific	S25423	Gefährliches
Filterpapier der Klasse 1	Fisher Scientific	1001-185
Isofluran	Pharmazeutische Partner von Kanada
20 mL Szintillationsfläschchen	Fisher Scientific	03-337-4
Saccharose	Bioshop Deutschland	SUC700.1
Natriumphosphat monobasisch	Sigma Aldrich	S5011-500G
Natriumphosphat zweibasig	Sigma Aldrich	S9390-500G
50 mL konisches Röhrchen	Fisher Scientific	12-565-271
Isopentan	Fisher Scientific	AC126470010	Auch bekannt als 2-Methylbutan; gefährlicher
Agar	Sigma Aldrich	A1296-100G
kleine Waage	Fisher Scientific	02-202-100
Vibratom	Leica	VT1000 S
6-Well-Gewebekulturplatten	Fisher Scientific	08-772-1b
Gewebekultureinsätze mit Netzboden	Fisher Scientific	07-200-214
Paraformadelhyde (PFA), 16%	Elektronenmikroskop Sciences	15710-S	Gefährliches
Ammoniumhydroxid	Fisher Scientific	A669S-500	Gefährliches
Kodak Fixiermittel A	Sigma Aldrich	P7542
Superfrost plus Objektträger	Fisher Scientific	12-550-15
CitroSolv Clearingmittel	Fisher Scientific	22-143-975
wasserfreier Ethylalkohol	Kommerzielle Alkohole	N/A
cresylviolet	Sigma Aldrich	C1791
permount	Fisher Scientific	SP15-100
aufrechtes Mikroskop	Modell
Olympus BX53Farbkamera, 12 Bit	MBF Biosciences	DV-47d	QImaging-Teil 01-MBF-2000R-F-CLR-12
3D motorisierter Mikroskoptisch, Controller und Ender	MBF Biosciences	N/A	Lieferung und integriert mit dem Mikroskop von MBF Biosciences
4X Mikroskopobjektiv	Olympus	4x 0,16 N.A. UplanSApo
10X Mikroskopobjektiv	Olympus	10x 0,3 N.A. UPlan FL N
30X Mikroskop Objektiv	Olympus	30x 1.05 N.A. UPlanSApo
60X Mikroskopobjektiv	Olympus	60x 1.42 N.A. PlanAPO N
Silikon-Immersionsöl	Olympus	Z-81114
Neurolucida Software	MBF Biosciences	Version 10
ImageJ Software	U.S. National Institutes of Health	Aktuelle Version Mit	dem OME Bio-Formats Plugin installiert
Photoshop Software	Adobe-Version	CS6