Reifung von humanen Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten in Biowires Verwendung elektrischer Stimulation

Zusammenfassung

Die kardiale biowire Plattform ist eine in vitro - Methode verwendet , um durch die Kombination von dreidimensionaler Zellkultivierung mit elektrischer Stimulation humanen embryonale und induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen (HPSC-CM) zu reifen. Dieses Manuskript zeigt den detaillierten Aufbau der Herzens biowire Plattform.

Zusammenfassung

Humanen pluripotenten Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten (HPSC-CMs) haben eine viel versprechende Zellquelle und haben ermutigt, so die Untersuchung ihrer möglichen Anwendungen in der Herzforschung, einschließlich der Wirkstoffforschung, Krankheitsmodelle, Tissue Engineering und der regenerativen Medizin. Jedoch durch bestehende Protokolle produzierten Zellen zeigen eine Reihe von Unreife verglichen mit nativem Erwachsenen Kardiomyozyten. Viele Anstrengungen wurden unternommen, HPSC-CMs, mit nur mäßiger Reifung erreicht so weit zu reifen. Daher ist es ein engineered System, genannt biowire, wurde durch die Bereitstellung sowohl physikalische als auch elektrische Signale entwickelt HPSC-CMs zu einem reiferen Zustand in vitro zu führen. Das System verwendet eine mikrofabrizierte Plattform HPSC-CMs in Kollagen Typ I entlang einer Naht starren Schablone gelieren zusammen in fluchtHerzGewebe (biowire) Samen, die mit einer progressiv ansteigenden Frequenz der elektrischen Feldstimulierung ausgesetzt wird. Im Vergleich zu nicht stimulierten Kontrollen,stimulierte biowired einen verbesserten Reifegrad strukturellen und elektro Kardiomyozyten zeigen. Solche Änderungen sind abhängig von der Stimulationsrate. Dieses Manuskript beschreibt ausführlich die Gestaltung und Erstellung von biowires.

Einleitung

Zell-basierte Therapie ist eine der vielversprechendsten und untersuchten Strategien Herz-Reparatur / Regeneration zu erreichen. Es wurde von Herz-Tissue Engineering und der Co-Lieferung von Biomaterialien ^{1, 2} unterstützt. Die meisten verfügbaren Zellquellen haben in Tiermodellen für ihre potenziell positiven Auswirkungen auf beschädigt, krank oder im Alter von Herzen ³ untersucht worden. Insbesondere haben erhebliche Anstrengungen humanen pluripotenten Stammzellen (HPSC) abgeleitetes Kardiomyozyten (HPSC-CM), eine potentiell unbegrenzte autologe Zellquelle für Herz-Tissue Engineering verwenden gemacht worden. HPSC-CMs kann mit mehreren etablierten Protokollen ⁴ hergestellt ^{werden, 5, 6.} Die erhaltenen Zellen fötale artige Phänotypen darstellen, mit einer Reihe von unreifen Eigenschaften im Vergleich zu erwachsenem ventrikulären Kardiomyocyten jedoch, ^{7, 8.} Dies kann ein Hindernis für die Anwendung von HPSC-CMs als Modelle von adulten Herzgeweben in der Wirkstoffforschung und in der Entwicklung von adulten Herzkrankheitsmodellen ⁹ sein.

Um diese Einschränkung der phänotypischen Unreife zu überwinden, werden neue Ansätze wurden Kardiomyozyten Reifung zu fördern aktiv untersucht. Frühe Studien zeigten wirksame pro-Reifungseigenschaften in neonatalen Ratten - Kardiomyozyten über zyklische mechanische oder elektrische Stimulation ^{10 11.} Gel Kompaktierung und zyklische mechanische Stimulation wurden ebenfalls ¹² einige Aspekte der HPSC-CM Reifung verbessern ^{gezeigt, 13,} mit minimaler Verstärkung der elektrophysiologischen und Calcium Handhabungseigenschaften. Daher wurde durch die Bereitstellung sowohl strukturelle Cues und elektrisches Feld stimulatio ein Plattformsystem „biologische wire“ (biowire) genannt erdachtn die Reifung von HPSC-CMs ¹⁴ zu verbessern. Dieses System verwendet eine mikrofabrizierte Plattform ausgerichtet Herzgewebe zu schaffen, das auf elektrische Feldstimulation zugänglich ist. Dies kann dazu verwendet werden, um die strukturelle und elektroLaufZeit von HPSC-CMs zu verbessern. Hier beschreiben wir die Einzelheiten einer solchen biowires machen.

Protokoll

1. Master Design und Herstellung

HINWEIS: Verwenden Sie weiche Lithographie zur Herstellung von Bauelementen. Machen einen zweischichtigen SU-8-Master für Polydimethylsiloxan (PDMS) Guß.

1. Gestalten Sie das Gerät mit einem Design und Erstellung von Software (Abbildung 1A, links). Zeichnen jede Schicht des Master getrennt. Drucken der Vorrichtungskonstruktion auf zwei Photomasken bei 20.000 dpi, entsprechend den beiden Schichten des Master ^15. Stellen Sie das Vorrichtungsmuster als transparent und die Umgebung so dunkel; die Masken werden als Vorlage dienen optisch das Vorrichtungsmuster auf SU-8 durch Lithographie übertragen (wie von anderen ¹⁵ beschrieben).
2. Dispense etwa 4 ml von SU-8 50 auf die Mitte einer 4-Zoll-Siliziumwafer. Coat die SU-8 50 gleichmäßig auf dem Wafer mit einer Schleuderbeschichtungsvorrichtung durch Verspinnen bei 2.000 Umdrehungen pro Minute (RPM) für 30 s verwendet. Backen der Wafer auf einer Heizplatte 95 ° C für 10 min. Belichten der Wafer mit ultraviolettem (UV) LiGht bei 200 mJ / cm ² .
3. Gießen Sie ca. 4 ml SU-8 2050 auf die Mitte des Wafers und drehen Sie sich bei 2500 U / min für 30 s. Auf der 95 ° C Heizplatte für 15 min aufbacken. Abkühlen auf Raumtemperatur (RT).
4. Wiederholen Sie Schritt 1.3 zwei weitere Male.
5. Bedecken Sie den beschichteten Wafer mit der ersten Schicht-Transparent-Photomaske. Setzen Sie den Wafer auf UV-Licht bei 270 mJ / cm ² , um die erste Schicht zu machen. Auf der 95 ° C Heizplatte für 15 min aufbacken.
6. Machen Sie die zweite Schicht von SU-8 2050, indem Sie Schritt 1.3 zweimal wiederholen.
7. Richten Sie die Maske der zweiten Schicht auf die Funktionen der ersten Ebene mit einem Maskenausrichter aus. Dann mit UV-Licht bei 240 mJ / cm2 aussetzen. Bei 95 ° C für 15 min backen.
   HINWEIS: Die Belichtungszeit wird durch die erforderliche Gesamt-UV-Dosis und die am Tag vor der Verwendung gemessene UV-Licht-Ausgangsintensität bestimmt.
8. Entwickeln Sie den Wafer durch Eintauchen in Propylenglykolmonomethyletheracetat (PGMEA) und Schütteln bei 200 U / min für 30 min auf einem Orbitalschüttler.
9. Ortder Master in eine Petrischale und gießt vorsichtig die PDMS-Mischung (Base in einem Verhältnis von 10 bis Vernetzer: 1 nach Gewicht) auf der Mitte des Wafers. Decken Sie alle Funktionen und Luftblasen vermeiden.
10. Wärme in einem Ofen bei 70 ° C für 2 h. Mit einem scharfen Messer um den Rand der PDMS biowire Vorlage schneiden (1A, rechts). Ziehen Sie die PDMS vom Master. Schneiden Sie das Gerät mit der Klinge. Setzen Sie die PDMS biowire Vorlage in einem Sterilisationsbeutel und Dampfautoklaven bei 121 ° C für 20 min.
11. In einem Schrank biologischen Sicherheit (BSC) wird die PDMS biowire Vorlage in eine Petrischale. Pinzette benutzen zu halten , und ein Stück sterilen chirurgischen Seidennaht (6-0) in der Mitte des Kanals der PDMS Mikrotiterplatten zu montieren , indem sie in den Nuten an den beiden Enden des Kanals (1B-I) Seating.

2. Erstellung der elektrischen Stimulationskammer

1. Bildet ein Paar von rechteckigen Polycarbonat Stücken (Länge x Breite x Dicke: 2 cm x0,85 cm x 0,35 cm) und sie als den Rahmen der elektrischen Stimulationskammer (Abbildung 2).
2. Bohren zwei 3 mm breite Löcher 2 cm voneinander entlang der Mittellinie jedes Polycarbonat Rahmenstück.
3. Schneiden Sie zwei Stücke von 1,5 cm langen Kohlenstoffstangen. Bohren, um ein 1 mm breites Loch durch den Kohlestab etwa 3 mm vom Ende. Fädeln ein Platindraht durch den Kohlestab Loch ein und ziehen den Draht durch sie um den Kohlestab gewickelt wird. Befestigen eines Clips an das andere Ende des Platindrahtes für die spätere Verbindung mit dem elektrischen Stimulator.
4. Setzen Sie die Kohlenstoffstäbe in das Polycarbonat Rahmenstücke. Platzieren Sie den zusammengebauten Rahmen mit den Kohlenstoffstäbe in eine Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen.
5. Gießen 2 ml PDMS in den Brunnen. Unterzutauchen die Unterseite des Polycarbonat-Rahmen in PDMS PDMS, während das Oberflächenniveau hält nahe an, aber nicht den Boden der Kohlenstoffstäbe erreicht wird. Wärme in einem Ofen bei 70 ° C für 2 h.
6. Nehmen Sie die elektrische Stimulation Kammer aus den sechs-Well Platte und sie in einer Sterilisationsbeutel für die Dampfsterilisation bei 121 ° C für 20 min.

3. Die enzymatische Dissoziation von HPSC-CMs

1. Induce HPSC zur Differenzierung zu Kardiomyozyten unter Verwendung eines etablierten Protokolls ^4.
   ANMERKUNG: In Kürze, erzeugen Kardiomyozyten über etablierte Embryoidkörper (EB) Protokolle in der Stamm Pro Medium durch die Supplementierung mit sequentieller bone morphogenetic protein 4, basischem Fibroblasten - Wachstumsfaktor, Activin A, die vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor und Dickkopf homolog 1 ^4. Verwenden Sie EBs von Tag 20-34 der Differenzierung biowires zu machen.
2. Sammelt die EBs von der niedrigen Befestigungsplatte mit einer P1,000 Pipettierspitze und in ein konischen Rohr. Pellet durch Zentrifugation für 5 min bei 125 xg und RT. Überstand verwerfen und das Pellet mit vorgewärmten, 37 ° C Kollagenase Typ I, das 1% Desoxyribonuclease I (DNAse I). Inkubieren bei 37 ° C für 2 hfür die Verdauung.
3. 5 ml vorgewärmtem, 37 ° C Waschmedium und Zentrifuge für 5 min bei 125 x g und RT. Überstand verwerfen. Das Pellet mit 2 ml Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) -Lösung und Inkubation für 5 min bei 37 ° C.
4. 1 mL Stop-Medium mit 3% (v / v) DNase I.
5. Anhängen einer 20 g (0,9 mm) Nadel in eine 5-ml-Spritze und passieren die Suspension durch EB es 3-5 mal.
6. 7 ml Waschmedium und Zentrifuge bei 280 × g für 5 min. Überstand verwerfen. Das Pellet in Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) und speichern Sie auf dem Eis. Bestimmen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer. Nehmen 0,5 x 10 ⁶ Zellen und Pellet durch Zentrifugation bei 280 × g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand.
7. Vorkühl- alle Gelkomponenten auf Eis, bevor sie in einem sterilen Röhrchen vermischen. Mischen Sie die folgenden Kollagengel Komponenten (Endkonzentration): 2,1 mg / ml Rattenschwanz-Kollagen Typ I, 24,9 mM Glucose, 23,8 mM NaH₃ CO, 14,3 mM NaOH, 10 mM HEPES und 10% extrazellulärer Matrix in 1x M199 Medium. Fügen Sie die Kollagen und extrazelluläre Matrix zuletzt. Mischen durch Pipettieren von oben und unten.
8. Resuspendieren 0,5 x 10 ⁶ Zellen mit 3,5 & mgr; l von Kollagengel und gut mischen.
9. Verwenden Spitze einer Pipette P10 4 ul der Zellsuspension in den 0,5 cm langen Kanals (1B-II) hinzuzufügen. Justieren der Position der Naht mit einer sterilen Pinzette, falls erforderlich.
10. Den Boden der Petrischale mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), um sicherzustellen, das Gel nicht zu berühren. für 30 min bei 37 ° C inkubieren.
11. Ersetzen der PBS mit 12 ml Kulturmedium (zB Stamm Pro oder Medium durch die Zell Hersteller empfohlen), ausreichend , um die Zellen (1B-III) zu bedecken. Kultur in einem Inkubator bei 37 ° C für 1 Woche. Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag.

4. Elektrische Stimulation für Biowire Anbau

1. Imder BSC, 2 ml PBS zu jedem Well einer Sechs-Well-Platte, das eine elektrische Stimulator Kammer beherbergen wird. Verwenden einer sterilen Pinzette vorsichtig auf die im Autoklaven behandelt elektrische Stimulationsvorrichtung in das Bohrloch zu platzieren. Entsorgen Sie die PBS aus dem Brunnen.
2. Deckt die Kohlenstoffstangen mit 5 ml vorgewärmtes Kulturmedium. Verwenden einer sterilen Pinzette die biowires in der elektrischen Stimulationskammer zu montieren und zu orientieren sie senkrecht zu den Kohlenstoffstangen (Abbildung 2).
3. Setzen Sie den Deckel auf der Oberseite der Sechs-Well-Platte, aber lassen Sie genügend Platindrähte außerhalb der Platte zu erreichen mit dem elektrischen Stimulator zu verbinden. Platzieren Sie die Sechs-Well-Platte in einem Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C und eine Verbindung des Platindrahtes mit dem elektrischen Stimulator.
4. Stimuliert die biowires einen elektrischen Stimulator mit folgenden Einstellung verwendet: zweiphasige wiederholender Puls, 1-ms Pulsdauer, 3 V / cm und 1 Impuls pro Sekunde (PPS). Erhöhen Sie die PPS alle 24 h auf die folgenden Werte: 1,83, 2,66, 3,49, 40,82, 5,15 und 6. Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag.
5. Beachten Sie die Kardiomyozyten Kontraktilität als Reaktion auf elektrische Stimulation unter einem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung.
   HINWEIS: Nach einer Woche der Stimulation, die biowires reif wird (die Ergebnisse Abschnitt).

Ergebnisse

Das rationale für die Verwendung einer Naht in den Biowires dient als Vorlage für die Bildung von 3D-Konstrukten, die sich in einer Achse ausrichten und die Form von Herzfasern nachahmen. Wir zeigen, dass nach sieben Tagen Kultur im Biowire die Zellen das Gel um die Naht umgebaut haben (Abbildung 3A ). Die Zellen versammelten sich entlang der Achse der Naht, um ausgerichtetes Herzgewebe zu bilden (Abbildung 3 ). Nach 7 Tagen Vorkultur wurden die Biowires...

Diskussion

Dieses Manuskript beschreibt die Einrichtung und Durchführung der konstruierten Plattform, biowire, die Reifung von HPSC-CMs zu verbessern. Das Gerät kann in Standard-Mikrofabrikationsanlagen hergestellt werden und kann mit biowires gemeinsamen Zellkulturtechniken und einem elektrischen Stimulator erzeugt werden.

Unseres Wissens gibt es keine berichtete ähnliches Verfahren wie biowires. Diese Strategie zeigt, dass eine verbesserte Reifungseigenschaften auf der elektrischen Stimulationsregime...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
L-Ascorbinsäure	Sigma	A-4544	hPSC-CM Nährmedienkomponente
AutoCAD	Autodesk, Inc		Software zum Entwerfen
Gerätekohlenstoffstäben und Oslash; 3 mm			Elektrische Stimulatorkammer Komponente
Kollagen, Typ 1, Rattenschwanz	BD Biosciences	354249	Kollagengel: 2,1 mg/mL Rattenschwanzkollagen Typ I in 24,9 mM Glukose, 23,8 mM NaHCO3, 14,3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1x M199 Medien mit 10 % Wachstumsfaktor-reduziertem Matrigel.
Kollagenase Typ I	Sigma	C0130	0,2 % Kollagenase Typ I (w/v) und 20 % FBS (v/v) in PBS mit Ca2+ und Mg2+. Sterilisieren mit 0,22 μ m filtrieren und 12 mL Aliquots herstellen. Bei -20 °C lagern.
Desoxyribonuklease I (DNase I)	EMD Millipore	260913-25MU	1 mg/ml DNase I Stammlösung in Wasser herstellen. Steril filtrieren und 0,5 mL Aliquots bei − 20 &Grad; C
Bohrer & Bohrer (& Oslash; 1 mm und 2 mm)	Dremel		Bohren von Löchern in Polycarbonat-Rahmen
Elektrischer Stimulator	Grass	s88x
Fötales Rinderserum (FBS)	WISENT Inc.	080-450
D-(+)-Glukose	Sigma	G5767	Kollagen Gel Komponente
L-Glutamin	Thermo Fisher Scientific	25030081
H2O	MilliQ		18.2 MΩ · cm bei 25 &°; C, ultrarein, um alle Lösungen
herzustellen HEPES	Sigma	H4034	Kollagen-Gelkomponente
Heizplatte	Torrey Pines	HS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Thermo Fisher Scientific	12440053
Mask Aligner	EVG	EVG 620
Matrigel, Wachstumsfaktor reduziert	Corning	354230	Kollagen-Gel-Komponente
Medium 199 (M199)	Thermo Fisher Scientific	11825015	Kollagen-Gel-Komponente
Monothioglycerin (MTG)	Sigma	M-6145	hPSC-CM Nährmedienkomponente
Orbitalschüttler	VWR	89032-088
Penicillin/Streptomycin (P/S)	Thermo Fisher Scientific	15070063
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Ca2+ und Mg2+	Thermo Fisher Scientific	14040133
Platte (6 Well)	Corning	353046
Platte (6 Wells), geringe Bindung	Corning	3471
Platindrähte, 0,2 mm			Elektrische Stimulatorkammerkomponente
Polydimethylsiloxan (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Propylenglykolmonomethylether Acetat (PGMEA)	Reh & Ingalls Inc.		Zur Entwicklung des Wafers
Pouch, Peel-open-Convertors		92308	Für die Dampfsterilisation
Siliziumwafer, 4 Zoll	UniversityWafer Inc.
Natriumbicarbonat (NaHCO3)	Sigma	S5761	Kollagen-Gel-Komponente
Natriumhydroxid	Sigma	S8045	Kollagen-Gel-Komponente
Sprin-Beschichter	Spezialbeschichtungssysteme	G3P-8
StemPro-34 Kulturmedium	Thermo Fisher Scientific	10639011	hPSC-CM-Kulturmedium. Um 50 mL herzustellen, fügen Sie 1,3 mL Supplement hinzu, 500 μ L von 100&mal; L-Glutamin, 250 μ L von 30 mg/ml Transferrin, 500 μ l von 5 mg/ml Ascorbinsäure, 150 μ L von 26 μ l /2 mL Monothioglycerin (MTG) und 500 μ L (1 %) Penicillin/Streptomycin.
Stopp-Medium			Waschmedium: FBS (1:1)
SU-8 50	MicroChem Corp.		Fotolack,
Master-Komponente SU-8 2050	MicroChem Corp.		Photoresist, Masterkomponente
Transferrin	Roche	10-652-202	hPSC-CM Nährmedienkomponente
Trypsin/EDTA, 0,25 %	Thermo Fisher Scientific	25200056	hPSC-CM Nährmedienkomponente
Waschmedium			IMDM mit 1 % Penicillin/Streptomycin