Meiose ist der Entwicklungsprozess durch den Gameten durch eine einzelne Runde der DNA-Replikation und zwei aufeinanderfolgenden Runden Chromosom Segregation gebildet werden. Säugetier-Meiose kann untersucht werden, durch die Verwendung einer Technik um meiotische Chromosomen breitet sich vorzubereiten. Hier zeigen wir einen Weg der Vorbereitung der Oberfläche verbreitet Kerne aus Maus Spermatozyten.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Vorbereitung der meiotischen Chromosom erstreckt sich von Maus Spermatozyten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Säugetier-Meiose ist eine dynamische Entwicklungsprozess, der tritt in Keimzellen untersucht und charakterisiert. Mit einer Methode, um Kerne auf der Oberfläche der Folien zu verbreiten (anstatt Fallenlassen aus großer Höhe), zeigen wir eine optimierte Technik, die auf Maus Spermatozyten wurde 1997 erstmals beschrieben. Diese Methode ist weit verbreitet in Laboratorien, Säugetier-Meiose zu studieren, denn es ergibt sich eine Fülle von hochwertigen Kernen unterziehen Subverteiler Prophase I. Seminiferous Röhrchen zuerst befinden sich in eine Hypotonische Lösung Spermatozyten anschwellen. Dann in einer Saccharoselösung erstelle ich eine Zellsuspension Spermatozyten freigesetzt werden, und Kerne verteilen sich auf Fixiermittel getränkten Objektträger. Nach Immunostaining kann eine Vielfalt von Proteinen germane zu meiotische Prozesse untersucht werden. Zum Beispiel können Proteine des synaptonemalen komplexes, eine dreigliedrige Struktur, die das Chromosom Achsen/Kerne der homologen miteinander verbindet einfach visualisiert werden. Meiotischen Rekombination Proteine, die durch homologe Rekombination in der Reparatur von DNA-Doppel-Strangbrüchen beteiligt sind, kann auch Immunostained Fortschreiten der Prophase bewerten ich. Hier wir beschreiben und zeigen im Detail eine Technik weit verbreitet, Säugetier-Meiose in Spermatozyten von Jugendlichen oder erwachsenen männlichen Mäusen zu studieren.
Einleitung
Mäuse werden weitgehend als Modellorganismus zur Meiose bei Säugetieren zu studieren. Die normalen Entwicklungsprozesse und Mängel, die während der Meiose auftreten können ausgewertet werden. Die Timeline und Fortschreiten der hervorstechenden Merkmale, die während der Prophase I und Subverteiler auftreten, sowie eine Vielzahl von bestimmten Proteinen, die in Prozessen entscheidend zur Regulierung der Meiose kann bei Wildtyp und Mutanten Mäusen charakterisiert werden. Mehrere spezielle Prozesse, die während der Meiose auftreten, die ich im Detail (rezensiert in Händel und Schimenti1) studiert werden kann. Dazu gehören DNA Double-Strand Break (D....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Alle Methoden, bei denen Mäuse genutzt hohe ethische und Tierschutzstandards und wurden durch die institutionelle Animal Care and Use Committee am Drexel University College of Medicine genehmigt.
1. Vorbereitung der Lösungen und Instrumente
- Bereiten Sie hypotone Extraktion Puffer (HEB) in 50 mL Reinstwasser Labor Grad Wasser, pH 8,2-8,4 (Tabelle 1). Stellen Sie die Lösung frisch jedes Mal halten Sie auf dem Eis, und innerhalb von 2 h breitet sich vorzubereiten; Dies ist notwendig, die Reduzierung und Protease hemmende Aktivitäten von DVB-t und PMSF, bzw. zu optimieren. Verwenden Sie 10 mL HEB für jedes Paar der Maus Hoden. <....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Die Fähigkeit dieser Methode, bieten zahlreiche Oberfläche verbreiten Kerne mit intakten homologen hängt von drei Faktoren: 1) geeignete Inkubationszeit von seminiferous Röhrchen in hypotone Puffer (d.h. HEBR) angemessen zu schwoll Spermatocyte Kerne, die platzen, aber nicht zerfallen von längerer Inkubation in HEBR, 2) Micropipetting der Saccharose-Tröpfchen von Zellen zu einer getrennten Aussetzung der Kerne, die nicht miteinander verklumpt sind und 3) kippen jedes Fixiermittel beschich.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Um hohe Zahlen der Spermatocyte Kerne gut verteilt, gute Qualität zu erhalten, sind die wichtigsten Schritte dieses Protokolls geeignete Inkubationszeit von seminiferous Röhrchen in HEB, geeignete Zerkleinerung von seminiferous Röhrchen und die Technik eingesetzt, um das Fixativ beschichtete Dias die Saccharose Zellsuspension verteilt sind. Wir inkubieren seminiferous Röhrchen aus Hoden Wildtyp Männchen von postnatale Tag 15 bis zum Erwachsenenalter in HEB für 45 min, während Hoden aus vergleichsweise Alter Chtf18
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Die Autoren erkennen die technische Unterstützung von Abigail Harris. Sie erkennen auch Paula Cohen und Kim Holloway für die Hilfe, das Protokoll der Oberfläche verbreitet Kerne aus Maus Spermatozyten Vorbereitung zu optimieren. Die Autoren schätzen auch kritische Lektüre des Manuskripts von Karen Schindler.
Diese Arbeit wurde von NIH R01 GM106262, K.M.B unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16 % Paraformaldehyd (wässrige Formaldehydlösung) | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | 16 %ige Lösung mit 1X PBS zu 4 % Arbeitsmaterial verdünnen und Aliquote bei -20 &° einfrieren; C |
| Teflon-bedruckte Objektträger mit 3 Ringen | Elektronenmikroskopie Sciences | 63418-11 | |
| Premium-Objektträger aus ungeladenem Milchglas | Handelsmarken | Reinigen Sie Objektträger in Ethyl- oder Isopropylalkohol und lassen Sie sie vor der Verwendung trocknen; beschriften Sie die Objektträger am mattierten Ende mit einem Permanentmarker oder Bleistift, je nach späterer Verwendung der Objektträger | |
| Chirurgische Schere (scharfe und stumpfe Spitzen) | Feinwissenschaftliche Werkzeuge | 14001-12 | Eine andere Marke eines ähnlichen Typs funktioniert Eine |
| chirurgische Schere mit feiner Spitze (scharfe Spitzen) | Fine Science Tools | 14058-11 | Eine andere Marke eines ähnlichen Typs funktioniert Eine Zange |
| gerader feiner Spitze | Fine Science Tools | 11050-10 | Eine andere Marke eines ähnlichen Typs funktioniert |
| Eine gebogene Pinzette mit mittlerer Spitze | Fisher | 16100110 | Eine andere Marke eines ähnlichen Typs funktioniert |
| Skalpellgriff | Fine Science Tools | 10003-12 | Verschiedene Marken eines ähnlichen Typs funktionieren |
| Maus Anti-SYCP3 | Abcam | ab97672 | Verwendung bei 1:300 |
| Anti-Zentromer-Protein (abgeleitet aus menschlichem CREST-Patientenserum) | Antikörper Incorporated | 15-234-0001 | Verwendung bei 1:50 |
| Befeuchtete Kammer | Wir verwenden Nunc quadratische Kulturschalen 500 cm2/Well mit angefeuchtetem Papier Handtücher | ||
| Weitfeldmikroskop mit Epifluoreszenz | Leica Mikrosysteme | Alle Standardmodelle | |
| Coplin-Dosen Mehrere | Handelsmarken | 50 ml Fassungsvermögen; 40 mm (1,6 Zoll) Durchmesser, fasst 10 Objektträger (Rücken an Rücken) | |
| Petrischalen | Mehrere Handelsmarken | 100 x 15 mm Durchmesser, Polystyrol steril unbehandelt |
Referenzen
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spre....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
