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Methodenartikel

Vorbereitung der meiotischen Chromosom erstreckt sich von Maus Spermatozyten

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DOI:

10.3791/55378

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22. November 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry & Molecular Biology, Drexel University College of Medicine, 2Department of Obstetrics & Gynecology, Drexel University College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Meiose ist der Entwicklungsprozess durch den Gameten durch eine einzelne Runde der DNA-Replikation und zwei aufeinanderfolgenden Runden Chromosom Segregation gebildet werden. Säugetier-Meiose kann untersucht werden, durch die Verwendung einer Technik um meiotische Chromosomen breitet sich vorzubereiten. Hier zeigen wir einen Weg der Vorbereitung der Oberfläche verbreitet Kerne aus Maus Spermatozyten.

Zusammenfassung

Säugetier-Meiose ist eine dynamische Entwicklungsprozess, der tritt in Keimzellen untersucht und charakterisiert. Mit einer Methode, um Kerne auf der Oberfläche der Folien zu verbreiten (anstatt Fallenlassen aus großer Höhe), zeigen wir eine optimierte Technik, die auf Maus Spermatozyten wurde 1997 erstmals beschrieben. Diese Methode ist weit verbreitet in Laboratorien, Säugetier-Meiose zu studieren, denn es ergibt sich eine Fülle von hochwertigen Kernen unterziehen Subverteiler Prophase I. Seminiferous Röhrchen zuerst befinden sich in eine Hypotonische Lösung Spermatozyten anschwellen. Dann in einer Saccharoselösung erstelle ich eine Zellsuspension Spermatozyten freigesetzt werden, und Kerne verteilen sich auf Fixiermittel getränkten Objektträger. Nach Immunostaining kann eine Vielfalt von Proteinen germane zu meiotische Prozesse untersucht werden. Zum Beispiel können Proteine des synaptonemalen komplexes, eine dreigliedrige Struktur, die das Chromosom Achsen/Kerne der homologen miteinander verbindet einfach visualisiert werden. Meiotischen Rekombination Proteine, die durch homologe Rekombination in der Reparatur von DNA-Doppel-Strangbrüchen beteiligt sind, kann auch Immunostained Fortschreiten der Prophase bewerten ich. Hier wir beschreiben und zeigen im Detail eine Technik weit verbreitet, Säugetier-Meiose in Spermatozyten von Jugendlichen oder erwachsenen männlichen Mäusen zu studieren.

Einleitung

Mäuse werden weitgehend als Modellorganismus zur Meiose bei Säugetieren zu studieren. Die normalen Entwicklungsprozesse und Mängel, die während der Meiose auftreten können ausgewertet werden. Die Timeline und Fortschreiten der hervorstechenden Merkmale, die während der Prophase I und Subverteiler auftreten, sowie eine Vielzahl von bestimmten Proteinen, die in Prozessen entscheidend zur Regulierung der Meiose kann bei Wildtyp und Mutanten Mäusen charakterisiert werden. Mehrere spezielle Prozesse, die während der Meiose auftreten, die ich im Detail (rezensiert in Händel und Schimenti1) studiert werden kann. Dazu gehören DNA Double-Strand Break (DSB) Bildung und Reparatur, Rekombination, synaptonemalen Komplex-Bildung und Chromosom Abtrennung.

Ein wichtiger Aspekt des Studiums meiotische Prozesse ist die Fähigkeit, Kerne zu untersuchen, mit homologe Chromosomen, die visuell und optisch besser gelöst werden zu unterscheiden und identifizieren die Subverteiler Prophase I. Prophase ich besteht aus 5 Subverteiler Das zeichnen sich durch Besonderheiten einschließlich der Bildung des synaptonemalen Komplexes (SC). Der SC ist eine dreigliedrige Protein-Gerüst, das ermöglicht die Kopplung und DNA Double-Strand Break Reparatur von homologe. Während Leptonema richten Sie homologe wie axiale Elemente des SC niedergelegt sind. Dann erleichtert die Befestigung der zentralen Elemente des synaptonemalen komplexes während Zygonema Paarung und physische Verbindung (Synapsis) zwischen Paaren von homologen. Während Pachynema Synapsis homologe wird vollständig und DNA-Frequenzweichen werden von der Reparatur einer ausgewählten Population von DNA-Doppel-Strangbrüchen durch homologe Rekombination gebildet. Der SC zerlegt in Diplonema, so dass homologe zu desynapse, sondern bleiben an ihren Zentromere und an Standorten der DNA Frequenzweichen verbunden. Schließlich während Diakinesis, homologe erneut und die Umstellung auf Metaphase erfolgt in1.

Historisch, Oberfläche-Verbreitung von meiotischen Chromatin ergab einige Kerne, insbesondere von frühen Stadien der Prophase ich2. Infolgedessen wurden diese Methoden geändert, um zu verbessern, die Trennung von Zellen aus dem Gewebe (Hoden oder Eierstöcke), die Technik des sich ausbreitenden meiotische Chromatin und die Ausbeute an qualitativ hochwertigen meiotische Kerne für Auswertung2,3, 4. Darüber hinaus diese Methode erwies sich als nützlich bei der Erhaltung nuklearen und Chromatin Proteine in meiotischen Kerne gebunden, wie veröffentlichten Immunolocalization Techniken5,6,7gezeigt. Daher die Methode zunächst von Peters2 beschrieben und gezeigt hier Erträge viele separate platzen Spermatocyte Kerne enthalten homologe durchläuft die Leptotän, Zygotene, Pachytene, Diplotene und Diakinesis Subverteiler Prophase ich.

Die Technik der Vorbereitung der Oberfläche verbreitet Kerne (auch genannt Chromatin Verbreitung Analyse) ist weit verbreitet, Meiose in den Bereichen der Fortpflanzungs- und Zelle Biologie zu studieren. Folien mit Oberfläche verbreitet Kernen können anschließend Immunostained mit Antikörpern gegen interessierender Proteine oder silberne Färbung unterzogen, und dann analysiert werden mit Mikroskopie. Die Methode ist ähnlich bei männlichen und weiblichen Mäusen, obwohl Änderungen für weibliche Mäuse2beschrieben worden sind. Es ist nicht unbedingt seminiferous Röhrchen overmince. Kerne müssen auch gut verteilt, so dass nach Immunostaining homologe und damit verbundenen Proteine sind deutlich mit Mikroskopie zu sehen. Oberfläche-Ausbreitung Kerne können bereit sofort in ein paar Stunden und entweder Immunostained oder bei-80 ° C für maximal 3 Wochen vor dem Auftauen und Immunostaining gespeichert werden. Jedoch werden optimale Ergebnisse für einige Proteine am besten erreicht, wenn Immunostaining sofort oder innerhalb von 2 Wochen der Vorbereitung der Oberfläche verbreitet Kernen durchgeführt wird. Folien können sein Immunostained mit einem Standardprotokoll mit Antikörper gegen Proteine des Interesses, gefolgt von Inkubation mit Sekundärantikörper konjugierten, fluoreszierende Proteine oder Farbstoffe, dann mit Fluoreszenz-Mikroskopie8abgebildet. Um postnatale Tag 15-21 Uhr gibt es ausreichend Gewebe pro paar Wildtyp Hoden um 6 bis 10 Folien zu erzielen, und ältere Mäuse (auch Erwachsene) erbringt weitere Folien. Allerdings werden Wildtyp-Mäusen 6 Wochen auch mehr Post-meiotische Zellen (d.h. Spermatids) auf den Folien nach Immunostaining liefern. Darüber hinaus können alle Subverteiler Prophase ich bei Jugendlichen und Erwachsenen Mäusen beobachtet werden. Hoden von männlichen postnatalen Tage 10 bis 15 ergibt viel mehr Leptotän und Zygotene Zellen. Mäuse, die älter als postnatale Tag 14 bis 15 erbringt mehr Pachytene und Diplotene Kerne.

Hier wir beschreiben und zeigen eine weit verbreitete Methode zur Vorbereitung Oberfläche verbreitet Kerne aus Maus Spermatozyten.

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Protokoll

Alle Methoden, bei denen Mäuse genutzt hohe ethische und Tierschutzstandards und wurden durch die institutionelle Animal Care and Use Committee am Drexel University College of Medicine genehmigt.

1. Vorbereitung der Lösungen und Instrumente

  1. Bereiten Sie hypotone Extraktion Puffer (HEB) in 50 mL Reinstwasser Labor Grad Wasser, pH 8,2-8,4 (Tabelle 1). Stellen Sie die Lösung frisch jedes Mal halten Sie auf dem Eis, und innerhalb von 2 h breitet sich vorzubereiten; Dies ist notwendig, die Reduzierung und Protease hemmende Aktivitäten von DVB-t und PMSF, bzw. zu optimieren. Verwenden Sie 10 mL HEB für jedes Paar der Maus Hoden.
  2. Bereiten Sie eine 100 mM-Zuckerlösung (frisch jedes Mal) durch Zugabe von 0,342 g Saccharose, 10 mL von hochreinen Labor Grad Wasser. Stellen Sie den pH-Wert auf 8.2
  3. Bereiten Sie Fixativ Lösung (1 % Paraformaldehyd (PFA), 0,15 % Triton x-100, pH 9.2 mit 1 N HCl oder 1 N NaOH angepasst) frische Monats- und laden es bei Raumtemperatur vor Licht geschützt. Verdünnen Sie eine 16 % im Handel erhältlichen PFA ab Lager auf 4 % mit 1 X PBS-Puffer für den Einsatz als Lager arbeiten und anschließend speichern Sie 4 % Aliquote bei-20 ° C.
    1. Um die Fixativ Lösung vorzubereiten, fügen Sie 10 mL 4 % PFA-Lösung und 600 µL 10 % Triton x-100, 30 mL 1 X PBS, gut mischen und anpassen den pH-Wert 9,2 mit 1 N HCl oder 1 N NaOH. Speichern Sie die Fixativ Lösung in einem 50 mL konische Röhrchen eingewickelt in Alufolie bei Raumtemperatur (für nicht mehr als 4 Wochen).
  4. Bereiten Sie Waschlösungen (während Folien die letzte 30 min Trocknen sind) mit Foto-Flo 200: 0,4 % Foto-Flo 200/PBS (320 µL von Foto-Flo 200 in 80 mL 1 X PBS) und 0,4 % Foto-Flo 200/dH2O (160 µL von Foto-Flo 200 in 40 mL Reinstwasser Labor Grad Wasser). Verwenden Sie ein 50 mL Coplin Glas, gefüllt mit 40 mL der Lösungen zu höchstens 10 Folien gleichzeitig waschen.
  5. Bereiten Sie die folgenden Instrumente: 1 paar chirurgische Schere (auf die Haut einzuschneiden), 1 paar feine Spitze chirurgische Schere (auf das Peritoneum einschneiden), 2 Paar gerade feine Spitze Pinzette (aus jedem Hoden sezieren), 1 gerade Kante Rasierklinge (zu jedem Hoden einschneiden), 2 Paar gebogene Spitze Pinzette (jeder Hoden zu immobilisieren und squeeze-out die seminiferous Röhrchen), 50 mL Gläser Coplin, Teflon gedruckt 3 Ring Rutschen, 1 Skalpell mit Größe 11 Messer, feuchte Kammer, 100 x 15 mm Petrischalen, feine Spitze permanent-Marker oder Bleistift, und eine rotierende Plattform Shaker.
    1. Platz Premium ungeladenen vorgereinigt mattierte Ende Glas-Objektträger aufrecht in ein 50 mL Coplin Glas, gefüllt mit Fixativ Lösung bis zur Verwendung.
      Hinweis: Bleistift wird bevorzugt, wenn Dias anschließend in Verfahren, die Ethanol, wie Fluoreszenz in Situ Hybridisierung verwendet werden.

2. Spermatocyte Kernen verbreiten

  1. Eine männliche Maus nach institutionellen Richtlinien (z.B. zervikale Dislokation mit oder ohne CO2 Erstickung) einschläfern.
  2. Verwenden Sie P10 - P20 Männchen meiotische Zellen in der ersten Welle der Spermatogenese zu bewerten; Wir verwenden routinemäßig P15 - P17 Männchen Zellen von allen Subverteiler Prophase i. bieten Erwachsenen Hoden erhalten Zellen von Prophase ich auch, aber sie ergeben auch mehr postmeiotic Zellen, wie z. B. Spermatids.
  3. Ernte und wiegen die Hoden (Aufzeichnen der gekoppelten Gewichte); dann legen Sie sie in eine Petrischale mit ein paar Tropfen kalt HEB um sie feucht zu halten.
  4. Halten Sie die Hoden gegen den Boden der Schale mit gebogene Spitze Pinzette und verwenden Sie eine geraden Kante Rasierklinge, um einen kleinen vertikalen Mittellinie Schnitt durch die Kapsel der Hoden zu machen. Während noch in der Hand des Hodens gegen den Boden der Schale mit einer Pinzette, mit einen zweiten Satz von gebogene Spitze Pinzette oder einer geraden Kante Rasierklinge drücken Sie vorsichtig die seminiferous Röhrchen aus den Hoden.
    1. Legen Sie die Röhrchen in eine 15 mL konische Röhrchen mit 10 mL kalte HEB, kümmert sich um zu vermeiden, dass Teile der Kapsel in die Röhre. Wiederholen Sie diese Schritte mit dem zweiten Hoden.
  5. Inkubieren Sie die Decapsulated seminiferous Röhrchen in das konische Rohr mit HEB für 30-60 min, abhängig von der Größe der Hoden auf Eis. Inkubieren seminiferous Röhrchen aus einem Paar Hoden mit einem Gewicht von 30 mg oder weniger für 30 min, Tubuli von ein paar Hoden mit einem Gewicht von 31 bis 50 mg für 30-45 Minuten und größere Hoden für 60 Minuten. Verändern Sie die Zeiten für einen einzigen Hoden nicht.
    Hinweis: Die optimale Inkubationszeit variieren abhängig von der Erfahrung der Experimentator, der verwendeten Reagenzien und die Mäuse, die analysiert wird.
  6. Während seminiferous Röhrchen in HEBR Inkubation sind, verwenden Sie einen Marker oder Bleistift die mattierten Enden der vorgereinigten Folien mit Maus, Foliennummer, und Datum beschriften. Dann legen Sie die vorgereinigten Folien in einem Coplin JAR-Datei mit dem Fixativ Lösung.
  7. Gießen Sie nach Inkubation Tubuli und HEB in einer sauberen Petrischale und separate Tubuli ca. 3 mm Durchmesser Klumpen. Jede Strähne ergibt 2 Rutschen und die Anzahl der Folien ergab hängt von der Größe der Hoden.
    Hinweis: Wir erhalten 8 Dias von Wildtyp und 6 Dias von subfertilen Chtf18-null-P16 Hoden (die durch verminderte Anzahl von meiotischen und mitotischen Keimzellen8kleiner sind). Ein Erwachsener Hoden mit einem Gewicht von 100 mg oder mehr würde voraussichtlich 16 Folien ergeben.
  8. Platz 23 µL 100 mM Saccharose-Lösung in einem Ring eine Teflon gedruckt, 3 ring Folie und fügen Sie ein Büschel von seminiferous Röhrchen in den Ring.  Dann mit gebogene Spitze Pinzette halten die Klumpen, die Tubuli mit einer Größe 11 Rasierklinge sanft zerkleinern, bis die Lösung trüb wird.
    Hinweis: Nicht overmince, da dies in den zersplitterten Chromosomen führt. Beachten Sie, dass fragmentierte Chromosomen einen mutierten Phänotyp auch hindeuten könnte.
  9. Entfernen Sie Fremdkörper, fügen Sie ein weiteres 23 µL Saccharoselösung und mithilfe einer Mikropipette sanft die Mischung ein paar Mal rauf und runter, pipette helfen die Zellen in der Suspension zu trennen.
  10. Entfernen Sie eine Folie in die Coplin JAR-Datei mit Fixativ Lösung einweichen und kippen Sie die Folie über das Glas zu, so dass eine großzügige Tröpfchen in der unteren Ecke der Folie sammelt.
    1. Pipettieren 20 µL Zellsuspension Saccharose aus dem Ring der Teflon gedruckte 3 Ring Folie in das Fixativ Tröpfchen auf eine Prämie gefrostet Objektträger und Pipettieren der Suspension nach oben und unten 2 - 3 Mal.
      Hinweis: Das Fixativ Tröpfchen sollte groß genug Volumen sein, so dass die Zugabe von 20 μl Zellsuspension Saccharose, es ermöglicht Berichterstattung über die gesamte Folie, wenn die Mischung verteilt ist (siehe unten 2.11).
  11. Langsam kippen der Folie auf der Gegenseite der Tropfen, die Zellsuspension entlang der Länge der Folie zu verbreiten. Neigen Sie dann langsam die Folie zurück zu verbreiten die Zellsuspension entlang der Breite der Folie um es vollständig zu bedecken. Vermeiden Sie die Verbreitung der Suspension über den gleichen Bereich der Folie mehr als einmal sonst die Zellen mit einander überlappen.
  12. Sofort legen Sie Folie flach in eine feuchte Kammer, und wiederholen Sie Schritte 2,8 bis 2.11, bis alle Klumpen von seminiferous Röhrchen verwendet wurden, um Dias zu machen. Es ist wichtig nicht zu bewegen, die feuchte Kammer während des Trocknungsprozesses reißen und überlappenden Zellen zu vermeiden.
  13. Lassen Sie die Folien in einer überdachten feuchte Kammer bei Raumtemperatur für 2,5 h auszubrüten, so dass sie langsam und nicht vollständig trocknen. Hohe Luftfeuchtigkeit und langsame Trocknung in diesem Schritt sind wichtig für angemessene Verbreitung des Chromatins. Dann entfernen Sie den Deckel der Kammer und lassen Sie Folien komplett eine zusätzliche 30 Minuten an der Luft trocknen.
  14. Folien (Rücken an Rücken oder in einem Zick-Zack-Muster) in einem Coplin Glas mit 0,4 % Foto-Flo 200/1 X PBS-Lösung legen und waschen Sie die Folien zweimal, 5 min, durch Rühren sanft die Coplin jar auf einer Plattform drehen Shaker. Verwenden Sie frische Lösung für jede Wäsche und verschiedene Mäuse in separaten Gläsern aller Waschungen verhindern Sie Folien.
  15. Waschen Sie die Folien in einem Coplin Glas mit 0,4 % Foto-Flo 200/dH2O Lösung für 5 min einmal beim Rühren.
  16. Entfernen Sie Folien aus der Coplin jar (letzten waschen), sorgfältig wischen Sie die Kanten und Böden der Folien, überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und Folien an einer abgewinkelten, fast aufrechten Position zum Trocknen legen. Ein Experimentator, der beherrschen diese Technik verarbeiten und Oberfläche-Ausbreitung Kerne von 4 oder 5 Mäuse an einem Tag vorzubereiten.
  17. Einmal trocken (15-20 min), verarbeiten Folien sofort für Immunfluoreszenz-Färbung oder Speicher bei-80 ° C in einer dicht verschlossenen Folie Box lichtgeschützt für maximal 3 Wochen (abhängig von der Zielproteine evaluiert; optimale Ergebnisse können erreicht werden, wenn gefärbt, die gleichen Tag oder innerhalb von 2 Wochen).
    1. Werden Sie bei-80 ° C gelagert, dann Folien auf Raumtemperatur kommen und waschen in einem Coplin JAR-Datei mit 1 X PBS oder Block für 5 min vor der Färbung.
      Hinweis: Viele verschiedene Immunfluoreszenz-Färbung-Protokolle werden gute Ergebnisse liefern; finden Sie Immunostaining Protokoll8, Berkowitz Et Al..

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Ergebnisse

Die Fähigkeit dieser Methode, bieten zahlreiche Oberfläche verbreiten Kerne mit intakten homologen hängt von drei Faktoren: 1) geeignete Inkubationszeit von seminiferous Röhrchen in hypotone Puffer (d.h. HEBR) angemessen zu schwoll Spermatocyte Kerne, die platzen, aber nicht zerfallen von längerer Inkubation in HEBR, 2) Micropipetting der Saccharose-Tröpfchen von Zellen zu einer getrennten Aussetzung der Kerne, die nicht miteinander verklumpt sind und 3) kippen jedes Fixiermittel beschich...

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Diskussion

Um hohe Zahlen der Spermatocyte Kerne gut verteilt, gute Qualität zu erhalten, sind die wichtigsten Schritte dieses Protokolls geeignete Inkubationszeit von seminiferous Röhrchen in HEB, geeignete Zerkleinerung von seminiferous Röhrchen und die Technik eingesetzt, um das Fixativ beschichtete Dias die Saccharose Zellsuspension verteilt sind. Wir inkubieren seminiferous Röhrchen aus Hoden Wildtyp Männchen von postnatale Tag 15 bis zum Erwachsenenalter in HEB für 45 min, während Hoden aus vergleichsweise Alter Chtf18

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren erkennen die technische Unterstützung von Abigail Harris. Sie erkennen auch Paula Cohen und Kim Holloway für die Hilfe, das Protokoll der Oberfläche verbreitet Kerne aus Maus Spermatozyten Vorbereitung zu optimieren. Die Autoren schätzen auch kritische Lektüre des Manuskripts von Karen Schindler.

Diese Arbeit wurde von NIH R01 GM106262, K.M.B unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Photo-Flo 200Kodak1464510
16 % Paraformaldehyd (wässrige Formaldehydlösung)Electron Microscopy SciencesRT 1571016 %ige Lösung mit 1X PBS zu 4 % Arbeitsmaterial verdünnen und Aliquote bei -20 &° einfrieren; C
Teflon-bedruckte Objektträger mit 3 RingenElektronenmikroskopie Sciences63418-11
Premium-Objektträger aus ungeladenem MilchglasHandelsmarkenReinigen Sie Objektträger in Ethyl- oder Isopropylalkohol und lassen Sie sie vor der Verwendung trocknen; beschriften Sie die Objektträger am mattierten Ende mit einem Permanentmarker oder Bleistift, je nach späterer Verwendung der Objektträger
Chirurgische Schere (scharfe und stumpfe Spitzen)Feinwissenschaftliche Werkzeuge14001-12Eine andere Marke eines ähnlichen Typs funktioniert Eine
chirurgische Schere mit feiner Spitze (scharfe Spitzen)Fine Science Tools14058-11Eine andere Marke eines ähnlichen Typs funktioniert Eine Zange
gerader feiner SpitzeFine Science Tools11050-10Eine andere Marke eines ähnlichen Typs funktioniert
Eine gebogene Pinzette mit mittlerer SpitzeFisher16100110Eine andere Marke eines ähnlichen Typs funktioniert
SkalpellgriffFine Science Tools10003-12Verschiedene Marken eines ähnlichen Typs funktionieren
Maus Anti-SYCP3Abcamab97672Verwendung bei 1:300
Anti-Zentromer-Protein (abgeleitet aus menschlichem CREST-Patientenserum)Antikörper Incorporated15-234-0001Verwendung bei 1:50
Befeuchtete KammerWir verwenden Nunc quadratische Kulturschalen 500 cm2/Well mit angefeuchtetem Papier Handtücher
Weitfeldmikroskop mit EpifluoreszenzLeica MikrosystemeAlle Standardmodelle
Coplin-Dosen MehrereHandelsmarken50 ml Fassungsvermögen; 40 mm (1,6 Zoll) Durchmesser, fasst 10 Objektträger (Rücken an Rücken)
PetrischalenMehrere Handelsmarken100 x 15 mm Durchmesser, Polystyrol steril unbehandelt
Mehrere mit

Referenzen

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