Detektion und Anreicherung von Rare Antigen-spezifische B-Zellen für die Analyse von Phänotypen und Funktion

Zusammenfassung

Eine einfache aber wirksame Methode, die magnetischen Nanopartikel verwendet antigen-reaktiven B-Zellen für die funktionale und phänotypische Analyse zu erfassen und zu bereichern beschrieben.

Zusammenfassung

B-Zellen, die mit einem spezifischen Antigen reaktiv sind, treten normalerweise bei einer Häufigkeit von <0,05% der Lymphozyten auf. Seit Jahrzehnten suchen Forscher nach Methoden, um diese seltenen Zellen zu isolieren und anzureichern, um ihren Phänotyp und ihre Biologie zu untersuchen. Die Ansätze basieren zwangsläufig auf dem Prinzip, dass B-Zellen natives Antigen anhand von Zelloberflächenrezeptoren erkennen, die in ihrer Spezifität repräsentativ für Antikörper sind, die schließlich von ihren differenzierten Töchtern sezerniert werden. Der vielleicht naheliegendste Ansatz zur Lösung des Problems ist die Verwendung von Fluorochrom-konjugierten Antigenen in Verbindung mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS). Der Nutzen dieser Methoden ist jedoch durch die Zellfrequenz und die erreichbare Analyse- und Isolationsrate durch elektronische Sortierung begrenzt. Es wird eine neuartige Methode zur Anreicherung seltener antigenspezifischer B-Zellen mit magnetischen Nanopartikeln beschrieben, die zu einer hohen Ausbeute an antigen-reaktiven B-Zellen aus großen Ausgangszellpopulationen führt. Diese Methode ermöglicht eine verbesserte Überwachung des Phänotyps und der Biologie von antigenreaktiven Zellen vor und nach einer in vivo Antigenbegegnung, z. B. nach Immunisierung oder während der Entwicklung von Autoimmunität.

Einleitung

bei einer Frequenz von 0,05 bis 0,005% in dem normalen Repertoire Analysen von Antikörper-sezernierenden Zellvorläuferfrequenz limitierende Verdünnung haben vorgeschlagen, dass B-Zellen reaktive typischerweise auf ein bestimmtes Antigen auftreten, je nach der Impfung Status und Größe / Anzahl der Epitope auf dem Antigen vorhanden. Die geringe Häufigkeit dieser Zellen hat es schwierig gemacht, Veränderungen in ihren Status während der Entwicklung von Immunantworten zu untersuchen, beispielsweise nach der Impfung oder der Exposition gegenüber einem fremden Antigen oder während der Entwicklung der Autoimmunität. Früher haben Forscher Isolierung von Antigen-reaktiven B - Zellen im Bereich von Adsorbentien Antigen beschichteten Platten oder Säule unter Verwendung von Techniken durchgeführt, um Antigen-beschichteten Rücksetzen der roten Blutkörperchen, um fluoreszenzaktivierte Zellsortierung ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} though Diese Techniken wurden erfolgreich bei der Identifizierung und Isolierung von Antigen-reaktiven B-Zellen, wurden die Ergebnisse hinsichtlich der Ausbeute, Reinheit und Skalierbarkeit variiert. Kürzlich haben wir ein neues Verfahren, um sowohl zu erkennen und seltenen B-Lymphozyten-Subpopulationen mittels magnetischer Nanopartikel anreichern. Das Verfahren ermöglicht mit relativ hoher Ausbeute und Reinheit aus großen Populationen Ausgangs Anreicherung und ist mit der Analyse von Antworten auf Antigen-kompatibel. Durch die Anreicherung von Populationen von Zellen in Suspension, beseitigt das Verfahren Einschränkungen, die mit der Geometrie von Antigen-beschichteten Platten oder Säulen und Grenzdurchsatz verbunden sind. Da schließlich angereicherten Zellen mit Antigen und einem fluoreszierenden Reporter verbunden bleiben, können sie weiter durch FACS-Sortierung gereinigt werden. Wie hierin beschrieben, haben wir diesen Ansatz für die Untersuchung von peripheren Blut-Tetanustoxoid-reaktiven B-Zellen vor und nach der Immunisierung von menschlichen Subjekten, sowie Autoantigen-reaktiven B-Zellen von Patienten mit verschiedenen autoi verwendetmmune Störungen, einschließlich Typ - 1 - Diabetes, Morbus Basedow und Hashimoto-Krankheit ^7. Das Verfahren arbeitet gleichermaßen gut in Maus und Mensch, und ist kompatibel mit der Analyse von Antigen-reaktiven B-Zellen aus einer Vielzahl von Geweben (Manuskript in Vorbereitung).

In ihrem Grundformat, peripheren mononukleären Blutzellen zuerst mit biotinyliertem Antigen mit Antikörpern inkubiert Oberflächenantigene für die phänotypische Analyse erforderlich zu Zelle. Dieser Markierungsschritt wird durch Waschen und Fixierung , gefolgt, und die Zugabe von zu fernen Rot-Fluoreszenzfarbstoff zum Nachweis des biotinylierten Antigen gekoppeltem Streptavidin bindenden Zellen (Abbildung 1). Frühere Studien haben antigenspezifischen B - Zellen in ähnlicher Weise identifiziert , aber unter Verwendung von Antigenen direkt konjugiert an ein Fluorochrom ^{8, 9, 10, 11.} Obwohl dies ein würdigerAnsatz, die Verwendung von biotinylierten Antigenen in Verbindung mit Streptavidin ermöglicht eine größere Signalverstärkung ( und somit eine bessere Differenzierung von bindenden und nicht-bindenden Zellen), insbesondere , wenn Antigene sind kleiner ^{12, 13, 14.} Eine weitere Überlegung ist die Verwendung von anstelle von Avidin Streptavidin da Streptavidin deglycosyliert wird, abnehmend unspezifische Bindung. Des weiteren verwenden wir Quantenausbeute (Helligkeit), und die geringe Größe (~ 1,3 kD) fernen Rot-Fluoreszenzfarbstoff als Fluorochrom aufgrund ihrer Photostabilität. Protein Fluorochrome wie Phycoerythrin (~ 250 kD) und Allophycocyanin (~ 105 kD) ¹⁵ sind nicht optimal , weil sie möglicherweise viele antigene Epitope enthalten. Die Verwendung eines kleinen organischen Fluoreszenzfarbstoff aus einem einzigen Epitop zusammengesetzt, wie weit Rot-Fluoreszenzfarbstoff, verringert die Komplexität der isolierten Zellpopulation.

Sobald Zellen biotinyliert-antigen und fernen Rot-Fluoreszenzfarbstoff-Streptavidin adsorbiert, werden sie angereichert mit Anti-fernen Rot-Fluoreszenzfarbstoff-konjugierte magnetische Nanopartikel. Single - Nanopartikel werden von den meisten Durchflusszytometer detektiert und daher nicht vor der Reinigung durch FACS entfernt werden müssen Sortier- und Downstream - Assays ^16. Magnetauswahl für antigen-spezifische B Zellen bereichert die Population von Interesse, wodurch die Zeit und Kosten für seltene Ereignisse Sortier eines Durchflusszytometers verwenden.

Im Folgenden zeigen wir repräsentative Ergebnisse aus der Anreicherung von Tetanus-Toxoid-spezifischen B-Zellen aus einem Subjekt vor und sieben Tage nach der Booster-Immunisierung Tetanustoxoid. Wir haben uns für diese spezielle Anwendung als Beispiel , um die Fähigkeit dieser Methode zu demonstrieren , Antigen-spezifische B - Zellen nach einer akuten in vivo Stimulation zu bereichern. Wenn Cytometrie mit Strömungs gekoppelt ist dieses Verfahren anreichern können und differenzierantigenspezifischen naiven, Speicher undPlasmablasten B-Zellen und ermöglicht es dem Forscher Änderungen in ihrer Frequenz über die Zeit zu verfolgen. Zusätzlich umfassen wir eine weitere mögliche Downstream - Assay, beispielsweise einem ELISPOT - Assay, was zeigt , dass die Zellen die Fähigkeit zur Sekretion von Antikörper folgenden Anreicherungs beibehalten. Eine weitere Anwendung dieses Verfahrens könnte beinhalten adoptiven Transfer von angereicherten Zellen in einen Wirt. Wir haben zuvor gezeigt Zellen aufrechtzuerhalten, die Fähigkeit als Antigen zu wirken Zellen zu Antigen-spezifischen T-Zellen nach der Isolierung und Übertragung präsentiert (Daten nicht gezeigt). Daher gibt es eine Anzahl von möglichen stromabwärts Assays, die mit dem Verfahren verbunden werden könnten, die zusammen das Verständnis der antigenspezifischen Immunantwort informiert. Wir haben das nachfolgend beschriebene Verfahren, einschließlich der Kontrollen Gesamtausbeute, Reinheit, Zellspezifität zu bestimmen und zerlegbare Bereicherung.

Protokoll

1. Isolierung von humanen PBMCs

1. Sammeln Sie 30 bis 50 ml Blut mit heparinisierten Blutentnahmeröhrchen.
   HINWEIS: Die Menge Blut verwendet wird, hängt von der speziellen Versuchs Frage und Frequenz in Blut von antigenspezifischen B-Zellen von Interesse. Heparinisiertem Blut kann sofort weiterverarbeitet werden oder geschaukelt bei Raumtemperatur über Nacht leicht am nächsten Tag für die Verarbeitung. Die Verzögerung bei der Verarbeitung hat eine sehr geringe Wirkung auf die Effizienz der Anreicherung und mit minimalem Verlust der Lebensfähigkeit verbunden.
2. Mischungsvollblut 1: 1 mit sterilem, Raumtemperatur Magnesium und Calcium freie Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS).
3. In einem 50 ml sterilen konischen Röhrchen, 10 ml Dichtegradientenlösung Raumtemperatur. Speichern der geöffneten Dichtegradienten Flaschen im Dunkeln bei 4 ° C, aber auf Raumtemperatur erwärmt vor dem Gebrauch.
4. Wenn möglich, stellen Sie die Pipettenpistole auf die langsame Einstellung und / oder gelten nur sehr wenig, aber konsequent, Druck Trigger langsam30-35 ml des verdünnten Blutes auf der Oberseite des Dichtegradienten Schicht, darauf achten, daß die beiden zu mischen.
   HINWEIS: Wenn sich die Spitze der Pipette gegen die Kante der konischen 50 ml, während das verdünnte Blut Zugabe wird eine konsistente stetigen Strom sicherzustellen.
5. Zentrifuge bei 400 × g für 30 min bei 20 ° C mit der Bremse ausgeschaltet.
6. Entfernen Sie die obere Schicht, die Plasma und Blutplättchen enthält, darauf achten, daß die Schicht aus einkernigen Zellen unter nicht zu stören.
7. Mit einer sterilen Pipette, sammeln die mononukleäre Zellschicht (Buffy-Coat) und in einen separaten sterilen 50 ml konischen Röhrchen.
8. Hinzufügen PBS zu der Zellsuspension auf ein Volumen von 50 ml. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min bei 20 ° C mit Bremse.
9. Überstand entfernen und resuspendieren pelletierten Zellen in 10 ml PBS. Zählen von Zellen und bestimmen die Lebensfähigkeit einer Zählkammer oder automatisierten Zellzähler verwendet wird.
10. Die Zellen bei 10 ⁷ Zellen / ml und auf Eis bis zur Weiterverarbeitung bereit.

2. Färbung von Zellen

1. Entfernen Sie 1-2 x 10 ⁶ Zellen für jede Fluoreszenzkompensation / FMO Steuerung benötigt, falls zutreffend. Zentrifuge Rest der Zellen bei 400 xg für 10 min bei 4 ° C mit Bremse.
2. Die Zellen in steril filtriert, kaltem FACS - Puffer (PBS + 1% Rinderserumalbumin (BSA) + 0,01% Natriumazid) bei 3-6 x 10 ⁷ Zellen / ml (Entfernen in einem 1,5 ml Zentrifugenröhrchen). Stellen Sie sicher, dass der FACS-Puffer ist kalt und halten sie auf dem Eis in der gesamten Färbeverfahren.
   1. Teilen Sie die Zellpopulation in Quarten (AD), wenn der Test zu optimieren. Verwenden Fraktion A antigen-spezifische B Zellen von Interesse, die Verwendung Fraktionen B und C zu bestimmen, um die Spezifität der Anreicherung / Färbung (siehe 2.5 und 2.6 unten), und die Verwendung Fraktion D zu bestimmen, um die Frequenz und die Anzahl der Antigen-spezifischen Zellen zu bereichern in die unenriched Bevölkerung Berechnung der Ausbeute zu ermöglichen und fold Bereicherung.
3. Human FcyR blockiert reAgenten Fraktionen AD auf Eis Bindung von Antikörpern an Fc-Rezeptoren zu verhindern.
   Hinweis: Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für geeignete Bedingungen.
4. In fluorochromkonjugierten Antikörper gegen Oberflächenantigene von Interesse Fraktionen AD für 30 Minuten auf Eis in der dunklen Zelle, man aufpassen, nicht zu schließen Fluorochrome, die mit den anti-fernen Rot-Fluoreszenzfarbstoff-Antikörper gekoppelt an magnetische Nanopartikel reagieren überqueren können.
   HINWEIS: Diese umfassen Antikörper-Konjugate zu nahen IR-Fluoreszenzfarbstoff, Cy5, Cy5.5 und Cy7. Jegliche Lebensfähigkeit Flecken, die hinzugefügt werden, sollten mit der Verwendung eines Fixiermittels kompatibel sein. Wenn man die Zellen nicht beabsichtigen Verwendung von FACS, zu analysieren, sondern die Antikörper-sezernierenden Frequenz, beispielsweise durch ELISPOT, Oberflächenfärbung mit Antikörpern ist unnötig festzustellen.
5. Um zu testen, um die Spezifität des Assays, Fraktion B mit einer ausreichenden Menge an unmarkiertem Antigen für 30 min auf Eis inkubiert, so dass die Mehrheit der Rezeptoren mit einer Affinität von zumindest10 ^-6 M blockiert.
   HINWEIS: In der Regel eine gute Ausgangskonzentration ist ein 50-100 - fachen Überschuß der Menge an Antigen ausreichend angesehen in 2,6 unterhalb (zB 50-100 uM). Dies sollte keine B-Zellen mit hoher Affinität Block für das unmarkierte Antigen an das biotinylierte Antigen zu binden, das 2.6 unten in Schritt hinzugefügt wird, wodurch eine Bestätigung der Spezifität der angereicherten Zellen ermöglicht. Dieser Schritt kann in Verbindung mit Schritt 2.4 oben abgeschlossen werden.
6. Hinzufügen biotinyliertem Antigen Fraktionen A, B und D. Inkubieren auf Eis für 30 min.
   HINWEIS: Die Konzentration des biotinylierten Antigens sollte die optimale Menge an Bindungs ​​Zellen aus unspezifischen Bystander-Zellen für eine ausreichende Erkennung und Trennung erforderlich, um festzustellen, titriert werden. Typischerweise zum Test eine gute Ausgangskonzentration ist 1-5 um.
   HINWEIS: Die Fraktionen A und D, kann dieser Schritt gleichzeitig mit Schritt 2.4 oben erfolgen. Für Fraktion B, sollte dieser Schritt nach dem Schritt 2.5 (Waschen in betw erfolgeneen Schritte ist nicht erforderlich).
7. Wegzulassen biotinyliertem Antigen aus Fraktion C, um jegliche Bindung von B-Zellen gegenüber anderen Reagenzien in dem Protokoll, wie Streptavidin- fernen Rot-Fluoreszenzfarbstoff und die magnetischen Kügelchen zu bestimmen.
8. Wasche die Zellen zweimal durch Suspendieren der Zellen in 1 ml kaltem FACS - Puffer pro 5 x 10 ⁷ Zellen und Zentrifugation bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C.
9. Nach dem letzten Waschen verdünnen pro 5 x 10 ⁷ Zellen in 1 ml 2% Formaldehyd konzentrierten Zellsuspension und lassen für 5 min in der Dunkelheit auf Eis setzen.
   HINWEIS: Die Fixierung der Zellen an diesem Punkt stellt sicher, dass das biotinylierte Antigen mit dem BCR für das verbleibende des Verfahrens gebunden bleibt. Für lebende Zellen - für Downstream-Analyse, wie in Elispots oder Adoptiv Transfers, lassen Sie den Fixierungsschritt.
10. Wasche die Zellen zweimal mit 1 ml kaltem FACS - Puffer pro 5 x 10 ⁷ Zellen und Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C. Resuspendieren in 1 ml Puffer kalt FACS pro 5 x 107 - Zellen.
11. In 1-2 ug Streptavidin-weit-rot-fluoreszierenden Farbstoff / ml und Inkubation auf Eis für 20 Minuten im Dunkeln. Daraufhin wird die Menge für jede Anwendung von Streptavidin.
12. Wasche die Zellen zweimal mit 1 ml kaltem FACS - Puffer pro 5 x 10 ⁷ Zellen und Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C. Fraktion D Präparat wird an dieser Stelle beendet, da es die Anreicherung nicht unterzogen werden, die magnetischen Kügelchen verwendet wird.
    Hinweis: Dieses Beispiel wird verwendet, um die Frequenz und die Anzahl von Antigen-spezifischen B-Zellen in der Probe zu bestimmen. Dies wird verwendet, um die Ausbeute zu bestimmen und Fold Anreicherung durch Anreicherung erreicht.

3. Magnetische Nanopartikel-basierte Anreicherung

1. Die Zellen aus Proben AC in 1 ml kaltem Trennpuffer (PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA) pro 5 x 10 ⁷ Zellen und durch ein 40 um - Filter jegliche Klumpen zu beseitigen , die die Säule verstopfen könnte.
2. In Anti-Cy5 / Anti-fernen Rot-Fluoreszenzfarbstoff-Nanopartikel. for optimale Ergebnisse sollte die Konzentration von Nanopartikeln für jede Verwendung titriert werden, aber ein guter Ausgangspunkt ist 50 & mgr; l Suspension pro 5 x 10 ⁷ Zellen / ml. Drehen im Dunkeln bei 4 ° C für 10 min.
3. Wasche zweimal mit 1 ml kaltem Trennpuffer bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C. Die Zellen in 1 ml kaltem Trennpuffer pro 5 x 10 ⁷ Zellen.

4. Magnetische Anreicherung LS oder LD von Spalten mithilfe von

1. Platzieren Sie drei LS oder LD Spalten im Magnetfeld eines Magnetscheider und 3 ml Trennpuffer die Spalten zu benetzen (siehe Produktbeschreibung, um zu bestimmen, welche Art von Säule ist am besten geeignet). Lassen Sie alle 3 ml durch die Säule passieren und nach der Entnahme zu verwerfen.
   Hinweis: Obwohl Trennung von magnetischen Nanopartikeln markierten Zellen erreicht werden kann, eine der magnetischen Trennvorrichtungen verwenden, die im Handel erhältlich sind, hat das Labor den meisten Erfolg mit der Verwendung von LS Säulen hatten, in terms Ausbeute, Reinheit und Effizienz der Anreicherung.
2. Platzieren drei 15 ml konische Röhrchen mit "Fraktion A / (B) / (C) negativ", für Zellen negativ selektierten, unter der Spalte. Hinzufügen das magnetische Teilchen markierten Zellen an ihre jeweiligen Spalten- und damit das gesamte Volumen durch.
3. In 3 ml kaltem Trennpuffer auf und lassen diese durch die Säule passieren und wiederholen Sie mit 2 ml. Sammeln Sie die negativ selektierten Zellen und beiseite stellen auf dem Eis.
4. Entfernen Sie die Säule aus dem Magnetfeld und legen Sie auf einem 15 ml konischen Röhrchen mit "Fraktion A / (B) / (C) positiv", für positiv markierten Zellen.
5. Füllen Sie die Spalte an die Spitze mit etwa 6 ml Trennpuffer und sofort stürzen dieses Volumen durch die Säule Zellen zu sammeln, die auf das Magnetfeld mit dem mitgelieferten Kolben gebunden hatte.
6. Um Reinheit zu erhöhen, können die positiv markierten Zellen weiterhin eine zweite saubere Säule angereichert werden unter Verwendung der proce Wiederholungdure.
7. Spin sowohl die negativ und positiv ausgewählten Fraktionen bei 400 xg für 10 min bei 4 ° C und suspendieren in gewünschte Endvolumen. Fahren Sie mit dem Downstream-Analyse, wie FACS, ELISPOT oder Adoptivtransfer.

Ergebnisse

Die Analyse der Reinheit, Ausbeute und Fold-Anreicherung unter Verwendung von Durchflusszytometrie

Populationen angereichert, wie oben beschrieben zwangsläufig kontaminierenden Zellen enthalten, die nicht Streptavidin- fernen Rot-Fluoreszenzfarbstoff gebunden haben, sind aber in der Matrix gefangen. Diese Verunreinigungen können aus angereicherter Populationen durch FACS-Sortierung entfernt werden. Zur Abschätzung Reinheit der an...

Diskussion

Hier beschreiben wir eine neuartige Methode Isolierung und Anreicherung von Antigen-bindenden B-Zellen aus menschlichen peripheren Blut zu erreichen. Das Verfahren ist ohne weiteres auf Mäuse und zu anderen Geweben, wie die Milz und Lymphknoten, und ist kompatibel mit Nachanreicherung Analyse der Zell-Phänotyp und die Funktion (Manuskript in Vorbereitung).

Der Benutzer sollte in einer Anzahl von Variablen sein, die cognizant Erfolg dieses Verfahrens beeinflussen kann. Aus Erfahrung neigen to...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Antigen des Interesses		variabel Mindestens	100 μ g leicht zu biotinylieren; Wenn Sie Protein verwenden, versuchen Sie, Protein zu verwenden, das durch ELISA validiert wurde. Es muss sich um einen Spediteur handeln. Frei von Proteinen.
Biotin zur Markierung; z.B. EZ Link Sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335	Biotin ist in verschiedenen Formulierungen erhältlich, wie z.B. solchen, die Abstandshalter unterschiedlicher Länge enthalten, so dass der verwendete Typ von dem Forscher bestimmt werden sollte
Streptavidin-Alexa Fluor 647	Invitrogen	S21374	von anderen Lieferanten beziehen kann.
Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Mikrokügelchen	Miltenyi Biotech	130-091-395
LS Säulen	Miltenyi Biotech	130-042-401
MACS manuelle Separatoren	Miltenyi Biotech	variabel
Formaldehyd Verdünnen			auf 2% mit PBS; optional, wenn für den Downstream-Assay lebende Zellen
benötigt PBS ohne Calcium und Magnesium
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	17-1440-02
Vollblut in heparinisierten Entnahmeröhrchen
FACS-Puffer (PBS + 1 % BSA + 0,01 % Natriumazid)
Trennpuffer (PBS + 0,5 % BSA + 2 mM EDTA)
50 ml konische Röhrchen
15 ml konische Röhrchen
1,5 ml Eppendorf-Röhrchen
Oberflächenmarker-Reaktivantikörper, Fc-Block, lebende/tot diskriminierende Färbung, bei Bedarf
ELISPOT-Lieferungen, falls erforderlich