Ein Protokoll zur Charakterisierung der morphologischen Veränderungen von Clostridium difficile In Antwort auf Antibiotika-Behandlung

Summary

Die Wirksamkeit von Antibiotika wird am häufigsten durch die Durchführung von kinetischen Abtötungsstudien und die Messung von koloniebildenden Einheiten (KBE) bestimmt. Durch die Integration der Rasterelektronenmikroskopie (REM) in diese Standardmethoden können wir die pharmakologischen Wirkungen der Behandlung zwischen verschiedenen Antibiotika unterscheiden.

Abstract

Die Beurteilung von Antibiotika-Maßnahmen mit neuer Arzneimittelentwicklung, die auf anaerobe Bakterien gerichtet ist, ist schwierig und technisch anspruchsvoll. Um einen Einblick in mögliche MOA zu erhalten, können morphologische Veränderungen, die mit der Antibiotika-Exposition verbunden sind, mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM) sichtbar gemacht werden. Die Integration von SEM-Imaging mit traditionellen Kill-Kurven kann unsere Einsicht in die Drogen-Aktion verbessern und den Drogenentwicklungsprozess vorantreiben. Um diese Prämisse zu testen, wurden Killkurven und SEM-Studien unter Verwendung von Arzneimitteln mit bekannten, aber unterschiedlichen MOA (Vancomycin und Metronidazol) durchgeführt. C. difficile Zellen (R20291) wurden mit oder ohne Anwesenheit von Antibiotika bis zu 48 h gezüchtet. Während des 48-Stunden-Intervalls wurden die Zellen zu mehreren Zeitpunkten gesammelt, um die antibiotische Wirksamkeit und die Bildgebung auf dem SEM zu bestimmen. In Übereinstimmung mit früheren Berichten hatten Vancomycin und Metronidazol eine signifikante bakterizide Aktivität nach 24 h Behandlung, gemessen durch eine koloniebildende Einheit (CFU)Ting Mit SEM-Bildgebung haben wir festgestellt, dass Metronidazol signifikante Auswirkungen auf die Zelllänge hatte (> 50% Reduktion der Zelllänge für jedes Antibiotikum, P <0,05) im Vergleich zu Kontrollen und Vancomycin. Während die phänotypische Reaktion auf die medikamentöse Behandlung bisher nicht auf diese Weise dokumentiert wurde, stimmen sie mit dem MOA des Arzneimittels überein, das die Vielseitigkeit und Zuverlässigkeit der Bildgebung und Messungen und die Anwendung dieser Technik für andere experimentelle Verbindungen zeigt.

Introduction

Clostridium difficile ist ein gram-positives, sporenbildendes Bakterium, das jährlich etwa 500.000 Infektionen in den USA verursacht und als Bedrohungsstufe für die Disease Control and Prevention (CDC), das höchste Risiko, als Bedrohungsniveau angesehen wird. ¹ Das vergangene Jahrzehnt hat eine beträchtliche Arzneimittelentwicklung in antimikrobiellen Mitteln mit Aktivität gegen C. difficile beobachtet . ^{2 , 3} In-vitro- Studien sind ein notwendiger Bestandteil des Arzneimittelentwicklungsprozesses. ⁴ Herkömmlicherweise werden in vitro- Anfälligkeit und Zeit - Tötungsstudien verwendet, um zukünftige Tier- und andere in vivo- Studien zu validieren.

Während diese Methoden eine wichtige Rolle bei der Bewertung von Tötungsaktionen spielen, erfassen sie nicht die phänotypische Reaktion der Zellen auf die pharmakologische Behandlung. Durch die Einbeziehung der Rasterelektronenmikroskopie (SEM) mit StandarD töten kinetische Studien, eine gründlichere Charakterisierung der antibiotischen direkten Effekte ist möglich. ^{5 , 6 , 7} Hier stellen wir ein Verfahren vor, bei dem SEM als Mittel zur Profilierung der Wirksamkeit der Antibiotika-Behandlung verwendet wird.

Protocol

1. Trennung von C. difficile aus verschiedenen Umwelt- oder klinischen Quellen

1. Umgebungsisolate: Mit einer vorsterilisierten Baumwolllehre (leicht benetzt mit 0,85% NaCl), die Oberfläche eines beliebigen Bereichs (Boden, Tür, Griff, Regal usw. ) abtupfen. ⁸ Achten Sie darauf, sterile Handschuhe zu tragen und legen Sie den Tupfer in ein sterilisiertes Rohr nach abgeschlossen.
2. Klinische Isolate (Stuhl): 10 bis 100 mg klinische Stuhlproben auf Cefoxitin-Cycloserin-Fructose-Agar (CCFA) unter Verwendung einer Impfschleife plattieren und unter strengen anaeroben Bedingungen für 48 - 72 h inkubieren. Lagern Sie isolierte Kolonien von C. difficile Lager in Kryovials bei -80 ° C für weitere Analysen. ^{7 , 9 , 10}
3. Anreichern Sie die Umwelt-Tupferproben in Hirnherz-Infusion (BHI) -brühe mit 0,05% Natriumtaurocholat und legen Sie sie in eine anaerobe Kammer bei 37 ° CFür 5 Tage. 1 ml der Kultur bei 10.000 xg zentrifugieren und das Pellet in 100 ul Ethanol resuspendieren.
4. Die resuspendierten Zellen (50 & mgr; l) auf Cycloserinecefoxitin-Fructose-Agar (CCFA) -Platten pipettieren und in einer anaeroben Kammer bei 37 ° C für 40-48 h inkubieren. Lagern Sie isolierte Kolonien von C. difficile Lager in Kryovials bei -80 ° C für weitere Analysen.
5. Testen Sie vermutete C. difficile Kolonien unter Verwendung des Latexagglutinationsreagenzes oder der PCR.

2. Kultivierung C. difficile und Killing Kinetic Procedures

1. Wachsen Sie gereinigte umwelt- oder klinische C. difficile- Stämme auf Blut-Agar-Platten in einer anaeroben Kammer bei 37 ° C für 48 h.
2. Nehmen Sie eine isolierte Kolonie mit einer Impfschleife, überführen sie in 5 ml BHI-Medium in einem 15-ml-Röhrchen und wachsen für 24 h in einer anaeroben Kammer bei 37 ° C.
3. Verdünnen Sie die Vorkulturen 1: 100 bis ca. 10 ⁶ Kolonie bildende EinheitS (CFU) / ml in frischem, vorreduziertem BHIS (BHI plus 5 g / l Hefeextrakt und 1% L-Cystein), ergänzt mit 0,1% Natriumtaurocholat und der entsprechenden Konzentration an Antibiotika (T0).
4. Sammeln Sie bei jeder Zeitspanne (T0, T6, T24, T48) eine 1-ml-Probe mit einer Pipette und verteilen Sie ein kleines Aliquot (100 μl in seriellen Verdünnungen) auf eine Blut-Agar-Platte. Die Zellen wachsen auf der Blut-Agar-Platte für 48 h in einer anaeroben Kammer bei 37 ° C und zählen die resultierende Anzahl von Kolonien, um CFU zu bestimmen.

3. Proben für die Rasterelektronenmikroskopie vorbereiten

1. 1 ml Zellen aus jedem Zeitpunkt in Mikrozentrifugenröhrchen sammeln und 10 min bei 10.000 xg zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und Zellen in PBS waschen.
2. Die Proben bei 10.000 xg für 10 min erneut zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Zellen in 1 ml 4% Paraformaldehyd erneut verdünnen und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
3. Zentrifugen Sie die Proben erneut für 10 min bei 10,000 xg und verwerfen den Überstand. Zellen zweimal mit destilliertem Wasser waschen und in 100 μl destilliertem Wasser umspülen. Lautstärke einstellen abhängig von der Trübung der Lösung.
   HINWEIS: Das Erstellen mehrerer serieller Verdünnungen ist eine gute Idee.
4. Etikettendeckel und 40 μl der Probe darauf geben. 15 Minuten lang in einer Durchflusshaube inkubieren, um die Flüssigkeit zu verdampfen und den Zellen zu erlauben, an dem Deckglas zu haften. Wenn Flüssigkeit noch vorhanden ist, verwenden Sie ein Gebläse, um die Flüssigkeit zu entfernen.
5. Legen Sie markierte Deckgläser mit Zellen in einem Schreibtisch Sputter-Maschine und Klebeband nach unten. Sichern Sie reines Gold in der Sputtermaschine. Maschine einschalten und bei niedrigem Druck (50 mTorr) mit Sputtern beginnen. Coat Zellen für 30 s bei 80 mA, was auf 20 nm Goldbeschichtung übersetzt.
6. Übertragen Sie beschichtete Zellen auf das Rasterelektronenmikroskop.

4. Imaging C. difficile Zellen auf einem Rasterelektronenmikroskop

1. Entlüftung des Rasterelektronenmikroskops (SEM) durch prDie Entlüftungsknopf auf der Computer-Software.
2. Mit Kohleband befestigen Sie die beschichteten Deckgläser auf die Metallstufe. Sobald die SEM belüftet ist, sollte sich die Tür leicht öffnen. Verriegeln Sie die Metallstufe in die SEM-Kammer, indem Sie sie einschrauben.
3. Klicken Sie auf die PUMP-Taste auf der Computersoftware. Der SEM wird nutzbar sein, wenn das System "Vac OK" liest.
4. Klicken Sie auf den SE-Detektor unter der Registerkarte Detektoren. Schalten Sie den Strahl ein, indem Sie auf die Schaltfläche klicken, die die Spannung anzeigt. Starten Sie die Bildgebung bei einer niedrigeren Spannung (5 kV), bevor Sie die Spannung erhöhen (bis zu 15 kV). Nach dem Einschalten des Strahls erscheint ein Bild.
5. Mit der Tracking-Funktion finden Sie einen Bereich auf den beschichteten Deckgläschen zum Bild. Untersuche die Region und findet stabförmige Strukturen. Diese sind clostridium difficile .
6. Vergrößern und fokussieren Sie das Bild, um das System zu kalibrieren. Dies sollte bei mehreren Arbeitsabständen erfolgen: 15, 9 und 5 mm. Bild bei einem Arbeitsabstand von 5 mm.
7. Schalte die u einLtra hochauflösenden Imaging-Modus und beginnen zu konzentrieren und optimieren Astigmatismus.
8. Beginne bei hoher Vergrößerung. Verwenden Sie dazu den Grob- und Feinfokus. Passen Sie auch Astigmatismus an, um ein klareres Bild zu erhalten.
   1. Den Astigmatismus bei hoher Vergrößerung anpassen. Um dies zu tun, passen Sie die Astigmatismus-Toggles (sie sehen ähnlich wie die feinen / groben Fokus schaltet) und überprüfen Sie das Bild für Klarheit durch digitales Zoomen auf der Computer-Software.
9. Se die langsame Scan-Funktion, um ein qualitativ hochwertiges Bild zu sammeln. Speichern Sie das gesammelte Bild als .TIFF-Datei, die für die Analyse verwendet wird. Vergewissern Sie sich, dass die Datenleiste ausgewählt ist, wenn während der Analyse Messungen vorgenommen werden.
10. Sammeln Sie Bilder in verschiedenen Winkeln (bis zu 52 ° durch manuelles Drehen des Winkels direkt auf dem SEM. Abgewinkelte Bilder neigen dazu, mehr Tiefeninformationen zu enthüllen.
11. Wechseln Sie die Strahlspannung abhängig von den abgebildeten Zellen. Halten Sie dies vor allem zwischen 5 - 15 kV für alle Experimente. Nachdem die Bildgebung abgeschlossen ist, schalten Sie den Strahl aus und erhöhen den Arbeitsabstand auf 20 mm. Die Kammer kann dann entlüftet und die Bühne entfernt werden. Kopiere alle Bilder auf ein Laufwerk zur weiteren Analyse.

5. Bildverarbeitung und -analyse

1. Laden und installieren Sie die frei verfügbare Software, FIJI (http://fiji.sc), auf den Computer.
2. Öffnen Sie die Bilddatei in FIJI.
3. Verwenden Sie die Linienfunktion, um die Waage genau zu verfolgen.
4. Klicken Sie auf die Registerkarte Analysieren im FIJI-Programm und wählen Sie die Select Scale-Funktion aus. Es erscheint ein Fenster, das die Einstellung der bekannten Distanz auf der Skala benötigt. Ändern Sie die Längeneinheit und klicken Sie auf OK.
5. Nun, da das Programm für die Entfernung kalibriert ist, verwenden Sie die Linienfunktion, um die Zelllänge zu messen. Um die Länge zu erhalten, benutze die Linienfunktion, um die Zelle in ihrer Gesamtheit zu verfolgen. Wählen Sie erneut die Registerkarte Analysieren und klicken Sie dann auf Messen. Die Länge sollte appOhr in den zuvor genannten Einheiten.

Results

Clostridium difficile ist ein sporenbildendes Bakterium und daher ist es wichtig, die Morphologieunterschiede zwischen vegetativen und Sporenzellen vor einer funktionellen Analyse zu bestimmen. Abbildung 1 zeigt repräsentative Bilder von vegetativen Zellen, die während der exponentiellen Phase der Wachstumskurve und Sporenzellen eingefangen wurden. Wie dargestellt, sind vegetative Zellen lange, glatte, stabförmige Strukturen, während Sporen kleine, ovale Struktu...

Discussion

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, eine Hochdurchsatzmethode zur Isolierung von C. difficile und zur Untersuchung von Antibiotika-Suszeptibilität mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM) als Mittel zur gründlicheren Charakterisierung der pharmakologischen Wirkung des Antibiotikums zu schaffen. Mit den hier skizzierten Protokollen haben wir gezeigt, dass die bildgebung der phänotypischen Antwort der Zelle auf die antibiotische Behandlung einen Einblick in die pharmakologische Wirkung des Arzneimittels zei...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Baumwollgaze	Caring	PRM21408C
NaCl	Macron	7532
50 mL Röhrchen	Falcon	352098
Gehirn Herzinfusion (BHI)	Kriterium	C5141
L-Cystein	Alfa Aesar	A10389
Hefeextrakt	Kriterium	C741
Natriumtaurocholat	Alfa Aesar	A18346
anaerobe Kammer	Coy		Vinyl anaerobe Kammer
Cycloserinecefoxitin Fructose-Agar (CCFA) Platten	Anaerobe systems	AS-213
Blut-Agar-Platten	Hardy Diagnostics	A-10
Latex-Agglutinationsreagenz	Oxoid	DR1107A	C. diff Testkit
Mikrozentrifugenröhrchen	Eppendorf	222363204
PBS	Gibco	10010-031
4% Paraformaldehyd	Fisher Scientific	50-259-98
Objektträger	J. Melvin freed brand	7525M	75 x 25mm
Durchflusshaube	Labconco	Klasse II Typ A2	Biosicherheitswerkbank
Tisch-Sputtermaschine	Denton Vacuum Desk	II
Klebeband	Kunststoffkern	05072-AB	SPI Doppelseitiges Klebeband Kohleband
gold	Denton Vacuum	TAR001-0158	2.375" Durchmesser x .002" Dickes Rasterelektronenmikroskop aus Goldfolie
	FEI	XL-30