Ein Protokoll zur Charakterisierung der morphologischen Veränderungen von Clostridium difficile In Antwort auf Antibiotika-Behandlung

Summary

Die Wirksamkeit von Antibiotika wird am häufigsten durch die Durchführung von kinetischen Abtötungsstudien und die Messung von koloniebildenden Einheiten (KBE) bestimmt. Durch die Integration der Rasterelektronenmikroskopie (REM) in diese Standardmethoden können wir die pharmakologischen Wirkungen der Behandlung zwischen verschiedenen Antibiotika unterscheiden.

Abstract

Die Beurteilung von Antibiotika-Maßnahmen mit neuer Arzneimittelentwicklung, die auf anaerobe Bakterien gerichtet ist, ist schwierig und technisch anspruchsvoll. Um einen Einblick in mögliche MOA zu erhalten, können morphologische Veränderungen, die mit der Antibiotika-Exposition verbunden sind, mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM) sichtbar gemacht werden. Die Integration von SEM-Imaging mit traditionellen Kill-Kurven kann unsere Einsicht in die Drogen-Aktion verbessern und den Drogenentwicklungsprozess vorantreiben. Um diese Prämisse zu testen, wurden Killkurven und SEM-Studien unter Verwendung von Arzneimitteln mit bekannten, aber unterschiedlichen MOA (Vancomycin und Metronidazol) durchgeführt. C. difficile Zellen (R20291) wurden mit oder ohne Anwesenheit von Antibiotika bis zu 48 h gezüchtet. Während des 48-Stunden-Intervalls wurden die Zellen zu mehreren Zeitpunkten gesammelt, um die antibiotische Wirksamkeit und die Bildgebung auf dem SEM zu bestimmen. In Übereinstimmung mit früheren Berichten hatten Vancomycin und Metronidazol eine signifikante bakterizide Aktivität nach 24 h Behandlung, gemessen durch eine koloniebildende Einheit (CFU)Ting Mit SEM-Bildgebung haben wir festgestellt, dass Metronidazol signifikante Auswirkungen auf die Zelllänge hatte (> 50% Reduktion der Zelllänge für jedes Antibiotikum, P <0,05) im Vergleich zu Kontrollen und Vancomycin. Während die phänotypische Reaktion auf die medikamentöse Behandlung bisher nicht auf diese Weise dokumentiert wurde, stimmen sie mit dem MOA des Arzneimittels überein, das die Vielseitigkeit und Zuverlässigkeit der Bildgebung und Messungen und die Anwendung dieser Technik für andere experimentelle Verbindungen zeigt.

Introduction

Clostridium difficile ist ein gram-positives, sporenbildendes Bakterium, das jährlich etwa 500.000 Infektionen in den USA verursacht und als Bedrohungsstufe für die Disease Control and Prevention (CDC), das höchste Risiko, als Bedrohungsniveau angesehen wird. ¹ Das vergangene Jahrzehnt hat eine beträchtliche Arzneimittelentwicklung in antimikrobiellen Mitteln mit Aktivität gegen C. difficile beobachtet . ^{2 , 3} In-vitro- Studien sind ein notwendiger Bestandteil des Arzneimittelentwicklungsprozesses. ⁴ Herkömmlicherweise werden in vi....

Protocol

1. Trennung von C. difficile aus verschiedenen Umwelt- oder klinischen Quellen

1. Umgebungsisolate: Mit einer vorsterilisierten Baumwolllehre (leicht benetzt mit 0,85% NaCl), die Oberfläche eines beliebigen Bereichs (Boden, Tür, Griff, Regal usw. ) abtupfen. ⁸ Achten Sie darauf, sterile Handschuhe zu tragen und legen Sie den Tupfer in ein sterilisiertes Rohr nach abgeschlossen.
2. Klinische Isolate (Stuhl): 10 bis 100 mg klinische Stuhlproben auf Cefoxitin-Cycloserin-Fructose-Agar (CCFA) unter Verwendung einer Impfschleife plattieren und unter strengen anaeroben Bedingungen für 48 - 72 h inkubieren. Lagern Sie ....

Results

Clostridium difficile ist ein sporenbildendes Bakterium und daher ist es wichtig, die Morphologieunterschiede zwischen vegetativen und Sporenzellen vor einer funktionellen Analyse zu bestimmen. Abbildung 1 zeigt repräsentative Bilder von vegetativen Zellen, die während der exponentiellen Phase der Wachstumskurve und Sporenzellen eingefangen wurden. Wie dargestellt, sind vegetative Zellen lange, glatte, stabförmige Strukturen, während Sporen kleine, ovale Struktu.......

Discussion

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, eine Hochdurchsatzmethode zur Isolierung von C. difficile und zur Untersuchung von Antibiotika-Suszeptibilität mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM) als Mittel zur gründlicheren Charakterisierung der pharmakologischen Wirkung des Antibiotikums zu schaffen. Mit den hier skizzierten Protokollen haben wir gezeigt, dass die bildgebung der phänotypischen Antwort der Zelle auf die antibiotische Behandlung einen Einblick in die pharmakologische Wirkung des Arzneimittels zei.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Baumwollgaze	Caring	PRM21408C
NaCl	Macron	7532
50 mL Röhrchen	Falcon	352098
Gehirn Herzinfusion (BHI)	Kriterium	C5141
L-Cystein	Alfa Aesar	A10389
Hefeextrakt	Kriterium	C741
Natriumtaurocholat	Alfa Aesar	A18346
anaerobe Kammer	Coy		Vinyl anaerobe Kammer
Cycloserinecefoxitin Fructose-Agar (CCFA) Platten	Anaerobe systems	AS-213
Blut-Agar-Platten	Hardy Diagnostics	A-10
Latex-Agglutinationsreagenz	Oxoid	DR1107A	C. diff Testkit
Mikrozentrifugenröhrchen	Eppendorf	222363204
PBS	Gibco	10010-031
4% Paraformaldehyd	Fisher Scientific	50-259-98
Objektträger	J. Melvin freed brand	7525M	75 x 25mm
Durchflusshaube	Labconco	Klasse II Typ A2	Biosicherheitswerkbank
Tisch-Sputtermaschine	Denton Vacuum Desk	II
Klebeband	Kunststoffkern	05072-AB	SPI Doppelseitiges Klebeband Kohleband
gold	Denton Vacuum	TAR001-0158	2.375" Durchmesser x .002" Dickes Rasterelektronenmikroskop aus Goldfolie
	FEI	XL-30