Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Expression von exogenem Cytokin in Patient-abgeleiteten Xenotransplantaten über Injektion mit einer Cytokin-transduzierten Stromzelllinie

8.9K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/55384

⸱

10. Mai 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Human Anatomy, Loma Linda University, 2Department of Basic Sciences, Loma Linda University, 3Department of Medicine, Loma Linda University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschrieben ist eine Methode zur Herstellung von exogenem Cytokin in Patienten-abgeleiteten Xenotransplantat (PDX) -Mäusen über eine wöchentliche intraperitoneale Injektion einer Cytokin-transduzierten Stromazellenlinie. Diese Methode erweitert den Nutzen von PDX und bietet die Möglichkeit für transiente oder nachhaltige exogene Cytokin-Zustellung in einer Vielzahl von PDX-Modellen.

Zusammenfassung

Patient-abgeleitete Xenotransplantat (PDX) -Mäuse werden durch Transplantation von menschlichen Zellen in immundefiziente Mäuse produziert. Diese Modelle sind ein wichtiges Instrument für das Studium der Mechanismen der normalen und malignen Hämatopoese und sind der Goldstandard für die Identifizierung effektiver Chemotherapien für viele Malignome. PDX-Modelle sind möglich, weil viele der Maus-Zytokine auch auf menschliche Zellen wirken. Allerdings ist dies nicht der Fall für alle Zytokine, darunter viele, die für das Studium der normalen und malignen Hämatopoese in menschlichen Zellen kritisch sind. Techniken, die Mäuse zur Herstellung von menschlichen Zytokinen (transgene und knock-in Modelle) erfordern, erfordern erhebliche Kosten, bevor die Nützlichkeit des Modells nachgewiesen wurde. Andere Techniken sind arbeitsintensiv (Injektion von rekombinantem Cytokin oder Lentivirus) und erfordern in manchen Fällen ein hohes Maß an technischem Fachwissen (hydrodynamische Injektion von DNA). Dieser Bericht beschreibt eine einfache Methode zur Erzeugung von PDX-Mäusen, die exogenes menschliches Cy habenTokine (TSLP, thymic stromal lymphopoietin) über wöchentliche intraperitoneale Injektion von Stroma, die transduziert wurden, um dieses Zytokin zu überexprimieren. Die Verwendung dieser Methode liefert eine in vivo Quelle der kontinuierlichen Zytokinproduktion, die physiologische Konzentrationen von zirkulierendem menschlichem Zytokin in der Maus erreicht. Die Plasmaspiegel des menschlichen Zytokins können auf der Grundlage der Anzahl der injizierten Stromazellen variiert werden, und die Zytokinproduktion kann an jedem Punkt des Experiments initiiert werden. Diese Methode umfasst auch Cytokin-negative Kontrollmäuse, die in ähnlicher Weise produziert werden, aber durch intraperitoneale Injektion von Stroma, die mit einem Kontrollvektor transduziert wird. Wir haben zuvor gezeigt, dass Leukämiezellen, die aus TSLP-exprimierendem PDX gewonnen wurden, im Vergleich zu Kontroll-PDX ein Genexpressionsmuster mehr wie die ursprüngliche Patientenprobe aufweisen. Gemeinsam bilden die durch diese Methode hergestellten Cytokin-produzierenden und zytokin-negativen PDX-Mäuse ein Modellsystem, das wir erfolgreich eingesetzt habenRolle der TSLP bei normaler und malignen Hämatopoese.

Einleitung

Patient-abgeleitete Xenotransplantate (PDX) sind ein leistungsfähiges In-vivo- Modell für das Studium der Produktion von normalen und malignen hämatopoetischen Zellen in einer "nativen" Säugetierumgebung. Am häufigsten werden PDX durch Injektion oder Verpflanzung menschlicher Zellen in immundefiziente Mäuse produziert. Die Produktion von PDX mit normalen menschlichen hämatopoetischen Stammzellen ermöglicht in vivo Studien über normales menschliches Blut und Immunzellenentwicklung. PDX, hergestellt aus Leukämie oder anderen Krebszellen, ermöglicht es, onkogene Mechanismen zu untersuchen und wirksame Therapien im Kontext der genetischen Landschaften und Mutationen, die in der menschlichen Bevölkerung vorhanden sind, zu identifizieren. 1 Infolgedessen sind PDX der gegenwärtige Goldstandard für die Translationsbiomedizinforschung, um wirkungsvolle Therapien zu identifizieren und ein wichtiges Werkzeug für das Verständnis der Mechanismen des Krebsfortschritts zu sein. PDX-Modelle sind ein wichtiges Instrument zur Unterstützung der Erforschung von gesundheitlichen Disparitäten Krankheiten aufgrund spezifischer Genetische Läsionen oder jede Krankheit, bei der die Variationen der genetischen Landschaft eines Patienten wesentlich zum Onkogenese- und Behandlungsergebnis beitragen können.

Maus-menschliche PDX-Modelle sind möglich, weil viele Maus-Zytokine adäquat ihre menschlichen Analoga bei der Aktivierung der Zytokin-Rezeptoren von menschlichen Zellen imitieren, während sie in der Maus sind. Beispielsweise liefert Interleukin-7 (IL-7) ein kritisches Signal für die menschliche B-Zell-Entwicklung. 2 In diesem Fall hat Maus IL-7 eine ausreichende Homologie mit humanem IL-7, dass das Maus-Zytokin Signalwege in menschlichen B-Zell-Vorläufern stimuliert. 2 , 3 , 4 Allerdings ist dies bei Thymus-Stromaz-Lymphopoetin (TSLP), 5 , 6 nicht der Fall , der unter anderen Zytokinen (IL-3, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF), Stammzellfaktor (SCF) ,Ref "> 7 ist wichtig für die Produktion von normalen und bösartigen menschlichen hämatopoetischen Zellen.Wenn Maus und menschliche Zytokine zeigen eine niedrige Homologie die Maus-Zytokine nicht aktivieren ihre jeweiligen Rezeptoren auf menschlichen Zellen.Um dieses Hindernis zu überwinden, wurden eine Reihe von Strategien verwendet Um die Expression von humanen Zytokinen in PDX-Mäusen zu entwickeln, darunter die Injektion von rekombinanten humanen Zytokinen, die hydrodynamische Injektion von DNA, die lentivirale Expression, die transgene Expression und den Knockin-Gen-Ersatz. 7 Dieser Bericht beschreibt eine Methode zur Herstellung von PDX zur Herstellung von menschlichem Cytokin über Stroma-vermittelte Zytokinabgabe ( Abbildung 1 ).

In der hier vorgestellten Methode werden PDX-Mäuse entwickelt, um das menschliche Zytokin, TSLP, zu exprimieren oder als Zytokin-Negativkontrollen zu dienen. TSLP-exprimierende PDX werden durch wöchentliche intraperitoneale Injektionen von Stromazellen erreicht, die transduziert wurden, um ein hohes Maß an menschlichem TSLP zu exprimieren.Cytokin-negative PDX-Kontroll-Mäuse sind ähnlich konstruiert; Obwohl Kontrollstroma mit einem Kontrollvektor transduziert werden. Diese Methode erreicht normale physiologische Werte von humanem TSLP in PDX-Mäusen, die mit dem TSLP + Stroma injiziert wurden. Bei PDX-Mäusen, die das Cytokin-negative Stroma erhalten, wird kein nachweisbares TSLP beobachtet. Wir haben die menschliche Stromzelllinie HS-27A für unsere Studien ausgewählt, weil sie in der Kultur robust wächst und eine sehr geringe Zytokinproduktion zeigt, die die Proliferation von isolierten Vorläuferzellen in Kokulturen nicht unterstützt. 8 Für die menschliche TSLP-Expression wurden Stroma mit einem fortgeschrittenen, selbstinaktivierenden lentiviralen Vektor transduziert, der aus einem zuvor beschriebenen Rückgrat 9 gewonnen wurde, und umfasst das cPPT / cts-Element und das Woodchuck-Hepatitis-posttranskriptionelle regulatorische Element (WPRE), um die Transgenexpression zu erhöhen. Das menschliche TSLP-Gen wurde unter der Kontrolle des Elongationsfaktors-1 in diesen Vektor konstruiert(EF-1) alpha-Promotor, um eine robuste, konstitutive und langfristige Expression zu erreichen.

Die Technik dieses menschlich-zytokinverstärkten PDX-Modells besteht aus 4 Hauptschritten. Zuerst werden transduziertes Stroma in vitro expandiert und durch enzymgebundenen Immunosorbens-Assay (ELISA) für eine stabile, hochgradige Zytokinproduktion bewertet. Zweitens wird die Aktivität der menschlichen Zytokine, die durch die transduzierten Stromazellen (und der Mangel an Zytokinaktivität aus Kontrollstroma) erzeugt wird, unter Verwendung von Phospho-Flow-Zytometrie verifiziert. Zelllinien, von denen bekannt ist, dass sie auf Cytokin von Interesse (in diesem Fall TSLP) reagieren, werden mit dem stromalen Zellüberstand inkubiert und auf Zytokin-induzierte Phosphorylierung untersucht. Drittens werden Mäuse mit transduziertem menschlichem Stroma injiziert und dann wird das Mausplasma durch den ELISA auf der Ebene des menschlichen Zytokins auf wöchentlicher Basis beurteilt. Viertens werden menschliche hämatopoetische Zellen transplantiert und die in vivo funktionellen Effekte des menschlichen Zytokins werden auf einem bekannten Ziel ( Z.B. Zellpopulation).

figure-introduction-1
Abbildung 1: PDX-Modell entwickelt, um exogenes menschliches Cytokin in Mäusen zu produzieren. ( 1A ) Design-Experiment und erhalten transduzierte menschliche Stromazellen ( 1B ) Erhalten menschliche Zellen (hämatopoetische Stammzellen, Leukämie-Zellen, etc. ), um PDX (Patient-abgeleitete Xenotransplantat) Mäuse zu erzeugen. ( 2A ) Injizieren Sie konstruiertes Stroma und ( 2B ) transplantieren menschliche Zellen in immune defiziente Mäuse nach experimentellen Zeitplan. ( 3A-B ) Überwachen Sie die Zytokinkonzentrationen im Stroma-Überstand und das Maus-Plasma durch ELISA. ( 4 ) Ernten Sie menschliche Zellen und beurteilen Sie die in vivo funktionellen Effekte des im PDX vorhandenen menschlichen Zytokins. Klicken Sie bitte hierUm eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die Zufuhr von humanem Cytokin über Stromazellen bietet sowohl Vor- als auch Nachteile im Vergleich zu anderen Methoden der Bereitstellung / Herstellung von menschlichen Zytokinen in PDX-Mäusen. 7 Im Vergleich zur Injektion von rekombinantem humanem Cytokin ist die Stroma-vermittelte Verabreichung im Allgemeinen weniger teuer (die Kosten der Stromazinkultur sind weniger als die Kosten des rekombinanten Cytokins) und weniger arbeitsintensiv (eine Injektion pro Woche gegenüber mehreren Injektionen pro Woche). Die Frage der kurzen Zytokin-Halbwertszeit wird ebenfalls gemildert, da Stroma kontinuierlich das exogene Cytokin produziert. Die Verabreichung von Zytokin über die hydrodynamische Injektion von DNA kann weniger teuer sein als die Lieferung über Stroma. Allerdings ist es ähnlich vorübergehend und kann mehr technische Fähigkeiten erfordern als die einfache wöchentliche intraperitoneale Injektion, die für die Stroma-vermittelte Lieferung erforderlich ist. Die lentivirale Genexpression in der Maus kann wenigerNsient Methode der Zytokin-Lieferung; In unseren händen wurden jedoch physiologische TSLP-Werte nicht erreicht. Darüber hinaus ist diese Methode arbeitsintensiv und erfordert eine kontinuierliche Produktion von lentiviralen Vektor. Transgene oder knock-in Mäuse bieten eine stabile Langzeit-Expression von Zytokin und können für die gewebespezifische Expression entwickelt werden, was ein Vorteil sein kann. Auf der anderen Seite erfordert die transgene Expression des menschlichen Zytokin-Gens auf dem immune defizienten Maushintergrund, der für PDX-Mäuse erforderlich ist, eine immense Investition von Ressourcen, bevor der Wert des Modells hergestellt wurde. Darüber hinaus erlauben transgene Modelle im Allgemeinen nicht die Möglichkeit, den Zeitpunkt der Zytokininitiierung oder des Grades der in vivo- Zytokinproduktion zu variieren. Diese können mit der Stroma-vermittelten Verabreichung durch einfaches Ändern des Zeitpunkts für die Initiation der Stromazelleninjektion oder der Dosis der injizierten Stromazellen erreicht werden.

Die stromalzellvermittelte Cytokin-Abgabe methOd hier wurde verwendet, um PDX für die Bewertung der Rolle von TSLP in der normalen menschlichen B-Zell-Entwicklung 4 , 6 und hoher Risiko B-Zell-akuten lymphoblastischen Leukämie zu entwickeln. 6 Diese Methode stellt eine alternative Cytokin-Verabreichungsmethode zur Verwendung bei der Erzeugung von ähnlichen Modellen mit menschlichen Zytokinen außer TSLP zur Verfügung. Dieses Modell kann auch nützlich sein, um vorläufige Daten zu erzeugen, die helfen können, festzustellen, ob der Wert eines Zytokin-transgenen oder zytokinischen Klopf-in-PDX-Modells der erheblichen Zeit- und Geldinvestition würdig wäre.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Studien wurden in Übereinstimmung mit Loma Linda University's Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) und Institutional Review Board (IRB) genehmigt Protokolle und nach allen Bundesrichtlinien durchgeführt.

ACHTUNG: PDX und menschliches Gewebe sollten nach Sicherheitsverfahren behandelt werden, um die Übertragung von Blut übertragenen Krankheitserregern zu verhindern.

1. Kultur und Erweiterung von Cytokin-transduzierten Stromzellen

ANMERKUNG: Jedes Mal, wenn Stroma passagiert sind, ernten Sie den Kulturüberstand (1 ml Aliquot) und lag bei -80 ° C für die zukünftige Quantifizierung des Zytokinspiegels über den ELISA-Test.

  1. Bereiten Sie R10-Kulturmedium und Gefriermedium, wie in der Tabelle der Materialien beschrieben, vor.
  2. Generieren Sie 10 , 11 oder erhalten Sie Kontrollstroma (transduziert mit leerem Vektor) und Zytokin-produzierenden (TSLP +) Stroma."> 6 In flüssigem Stickstoff (LN 2 ) bis zur Verwendung aufbewahren, wie beschrieben 12 auftauen und in 5 ml R10-Medium in getrennten T-25-Zellkulturkolben pipettieren. Kulturzellen in einem Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2 Dies ist nach der Tauwetter "Passage # 1".
  3. Sobald Stroma konfluent sind (24-48 h), Durchgangszellen durch Trypsinierung unter Verwendung von 1 × Trypsin-EDTA (0,25%) und Umplattieren in einem T-150 Kulturkolben. Dies ist nach der Tauwetter "Passage # 2".
  4. Wenn Stroma die Konfluenz in den T-150-Flaschen (3-4 Tage später) erreichen, durchlaufen die Zellen durch Trypsinisierung. Verwenden Sie diese Zellsuspension für experimentelle Bedürfnisse.
    1. Zellexpansion zu Mehrkolben
      1. Die geernteten Zellen zwischen drei T-150 Flaschen und Kultur bis zur Konfluenz aufteilen. Wiederholen Sie diesen Schritt, wenn eine Stromverlängerung erforderlich ist. Typische menschliche stromale (HS-27A) Zellzahl am Zusammenfluss in einem T-150-Kolben ist ~ 5 x 10 6 .
    2. Zellensich aufregen
      1. Die geerntete Zellsuspension auf ein konisches Röhrchen überführen und 5 min bei 500 xg zentrifugieren, den Überstand dekantieren und die Zellen im Gefriermedium auffrischen. Gefrieren und lagern in LN 2 ~ 1,5 x 10 6 Zellen pro Durchstechflasche.
    3. Für intraperiotoneale Stroma-Injektionen in Mäuse geht es weiter mit Schritt 4.1.

2. ELISA-Assays zur Überwachung der In-vitro- Cytokin-Produktion aus transduziertem Stroma

  1. Kaufen Sie im Handel erhältliches ELISA-Assay-Kit, um das interessierende Cytokin zu erkennen.
  2. Tauen Sie den stromalen Zellüberstand von der Kontrolle und dem Zytokin produzierenden (TSLP +) Stroma, das in frühen, mittleren und späten Passagen geerntet wurde (Abbildung 2 ).
  3. Bestimmen Sie die TSLP-Konzentration in überstehenden Proben mit einem ELISA-Kit gemäß Herstelleranweisung. 13 Kompilieren Sie diese seriellen Daten, um die Stabilität der Zytokinproduktion während der Zellkultur zu überwachen E ( Fig. 2A-B ).
    1. Identifizieren und verwerfen von Zytokin-produzierendem Stroma mit reduzierter oder suboptimaler Zytokin-Expression sowie jeglichen entsprechenden Fläschchen in der Lagerung (Abbildung 2A-B ).
    2. Identifizieren und Aufrechterhalten von Zytokin-produzierenden Stroma, die stabile, hochgradige Zytokinkonzentrationen zeigen. Verwenden Sie diese Tauwetter für Experimente.
  4. Verwenden Sie das ELISA-Kit, um das Stroma während der gesamten Dauer der Zellkultur (mindestens 1 Mal während der frühen, mittleren und späten Nachtauung) routinemäßig zu überwachen, um eine stabile Cytokinproduktion oder im Falle von Kontrollstroma die Abwesenheit der Zytokinproduktion zu gewährleisten .

3. Phospho-Flow-Cytometrie-Assays zur Bewertung der Aktivität von Cytokin, hergestellt von Stroma

HINWEIS: Überprüfen Sie den Überstand vor dem ersten Experiment, um die relevante Bioaktivität des Stroma-erzeugten Zytokins für einzelne Experimente zu überprüfen.Ef "> 6 Sobald das konstruierte Stroma validiert ist, ist eine weitere Prüfung nicht notwendig, wenn kein Stroma eingeführt wird, das mit einem neuen Vektor hergestellt wurde.

  1. Erwerben Sie MUTZ5- und / oder MHH-CALL4-Leukämie-Zelllinien (TSLP-responsive), 14 rekombinantes humanes Cytokin und Antikörper, die für die Verwendung in Phospho-Flow-Zytometrie-Assays zugelassen sind, um geeignete nachgeschaltete Phosphorylierungsziele zu detektieren.
  2. Tau geernteten Überstand aus Kontrolle und Zytokin-exprimierenden Stroma.
  3. Tafeln Sie die Leukämie- Zelllinien in R20-Medium (siehe Tabelle der Materialien ) in einer Konzentration von 0,2 x 10 & sup6; Zellen pro Vertiefung in einer 96-Well-Gewebekulturplatte. Tafel 3 Vertiefungen pro Zustand, um dreifache Assays zu ermöglichen. Inkubieren für 2 h bei 37 ° C. Diese Zeit ermöglicht den Verlust einer Phosphorylierung, die während früherer Kulturbedingungen auftrat.
    ANMERKUNG: 12 Vertiefungen pro Zelllinie liefert dreifache Assays für jeden in Schritt 3.4 gezeigten experimentellen Zustand.
  4. Nach 2 h in Kultur die Zellen aus jeder Vertiefung zu trennen, um 4 ml Röhrchen zu trennen und bei 500 xg für 5 min bei 4 ° C zu zentrifugieren. Dekantieren den Überstand.
    1. Die Zellen in 200 μl für jede der folgenden experimentellen Bedingungen erneut suspendieren (Assays in dreifacher Ausfertigung durchführen): 1) nur negative Kontrollmedien, 2) positives Kontrollmedium mit rekombinantem Cytokin bei Sättigungskonzentration (s) (TSLP bei 15 ng / Ml, etc. ), 3) Kontrolle des Stroma-Überstandes aus Kontrollstroma und 4) Zytokin-Stroma-Überstand aus Zytokin-produzierendem Stroma.
  5. Inkubieren Sie die Zellen für die Dauer, die durch spezifische kommerzielle Phospho-Assay ( z. B. 30 min für Phospho-STAT5 in MUTZ5 oder MHH-CALL4 als Reaktion auf TSLP) angegeben ist.
  6. Bei 500 xg für 5 min bei 4 ° C zentrifugieren und den Überstand dekantieren.
  7. Durchführen von Phospho-Flow-Zytometrie-Färbung pro Hersteller-Protokoll und sammeln Durchflusszytometrie Daten. 15
  8. Analyse der Durchflusszytometrie Daten. 15
    1. Gate auf intakten Zellen basierend auf Vorwärts (FSC, zeigt Zellgröße) und Seite (SSC, zeigt Zellgranularität) Lichtstreuung.
    2. Bestimmen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der intakten Zellen in jeder Probe. Vergleichen Sie den durchschnittlichen MFI, der aus den dreifachen Werten des Stromazellenüberstandes gewonnen wird, zu dem der positiven und negativen Medienkontrollen.

4. Injektion von Cytokin-transduzierten Stroma in Mäuse

HINWEIS: Kultur HS-27A Stroma für mindestens 3 Nach-Tau-Passagen vor der Injektion sie in Mäuse, um gesunde Zellen und ausreichende Zytokin-Produktion zu gewährleisten.

  1. Vorbereitung von Stroma
    1. Die geerntete Stromaztensuspension auf ein konisches Röhrchen übertragen und 10 μl für die Hämocytometerzahl aliquotieren; Erhalten Sie die lebende Zellzahl mit Trypanblau. 16 Die restliche ce zentrifugierenLl Suspension bei 500 xg für 5 min.
    2. Ansaugen des Überstandes aus den pelletierten Zellen und sanftes Resuspendieren der Zellen in dem notwendigen Volumen der sterilen phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) für die Mausinjektion (abhängig von der Anzahl der zu injizierenden Mäuse).
      HINWEIS Typische stromale Zellkonzentration für die Mausinjektion: 0,5 x 10 6 -5 x 10 6 Zellen pro Maus in 200 μl PBS.
    3. Halten Sie die Stromzelle Suspension bei 4 ° C (oder auf Eis) bis unmittelbar vor der Injektion. Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension mindestens bei Raumtemperatur (RT) (~ 25 ° C) für Mäuseinjektion ist.
  2. Stromzelle Injektion
    1. Desinfizieren Sie die Bio-Schutzhaube, montieren Sie Materialien für Injektionen und legen Sie dann den Mauskäfig hinein.
    2. Die Zellsuspension vor der Inversion vor dem Aufziehen von 200 μl in eine Tuberkulinspritze vorsichtig mischen.
    3. Mit Standard-Intra-Peritoneal-Injektionstechniken, 17Die Maus zurückhalten und die 200 μL Zellsuspension in die Peritonealhöhle verabreichen. Details wurden bisher von Machholz et al. 18

5. Serielle Blutentnahme und Plasmaüberwachung für exogenes menschliches Cytokin bei Mäusen

  1. Blutsammlung über Schwanzschneider
    1. Desinfizieren Sie die Biosafety-Kapuze und montieren Sie den Mausrestrainer, die Scheren und andere Werkzeuge / Vorräte für das Verfahren.
    2. Legen Sie die Maus in einen Restrainer und sichern Sie die Tube, um die Mausbewegung zu minimieren.
    3. Desinfizieren Sie den Schwanz und die chirurgische Schere mit Isopropylalkohol. Tragen Sie topische Anästhesie Creme auf den Schwanz.
    4. Mit sehr scharfen chirurgischen Scheren schnippen Sie etwa 0,5 - 1 mm der Spitze des Schwanzes der Maus. Sammeln Sie etwa 80 μl peripheres Blut mit heparinisierten Kapillarröhrchen.
      HINWEIS: Wenn Blut mit dieser Methode mehr als sechs ti gesammelt wirdMes, Schwanz Entfernung sollte konservativ in Bezug auf die Menge an Schwanz entfernt werden. Als Snips den Schwanz fortschreiten, steigt der Durchmesser, er hemmt schneller und die Heilung dauert länger.
  2. Plasma-Trennung
    1. Übertragen Sie das Blut mit einer Glühbirnenspritze (um es aus den Kapillarrohren zu vertreiben) in ein markiertes K 2 EDTA Mikrotainerrohr; 20 mal umdrehen, um die Koagulation zu verhindern.
      HINWEIS: Normalerweise ist die Blutgerinnung aus dem Schwanzspalt schnell. Allerdings, wenn die Blutung länger als ~ 2 min besteht, verwenden Sie einen styptischen Bleistift / Pulver, um die Koagulation zu unterstützen.
    2. Zentrifugen von Blutentnahmeröhrchen nach Anweisung des Herstellers und aliquotieren das Plasma zur Lagerung (-20 ° C) bis zum ELISA-Test.
    3. Wenn Maus-Mensch-Zelle Chimärismus Daten aus dem Maus-Blut benötigt wird, dann behandeln die restlichen Pellets wie in Schritt 6.3.1 beschrieben. Andernfalls verwerfen Sie das Blutzellpellet.
  3. Modifizierter ELISA für Mikro-VolUmes von Mausplasma
    HINWEIS: Das ELISA-Verfahren des Herstellers wurde von dem empfohlenen 100 μl Probenvolumen auf ein Volumen von 40 & mgr; l modifiziert, um die von Mäusen gesammelten Mikrovolumina aufzunehmen. Es ist nicht möglich, die In-vivo- Maus-Plasmaproben in dreifacher Ausfertigung mit diesen begrenzten Volumina zu führen. Am Ende des Experiments werden 500 μl post-mortem Blut über Herzpunktion gesammelt. Cytokinkonzentrationen, die in 100 & mgr; l Euthanasieplasma bewertet wurden, werden verwendet, um die 40 & mgr; l in vivo Daten für jede Maus zu validieren.
    1. Tauen Sie gefrorene Mausplasmaproben auf.
    2. Seriell verdünnte ELISA-Standards verdünnen und in dreifacher Ausfertigung mit 40 μl pro Vertiefung pipettieren.
    3. Füge 40 μl jeder Maus-Plasmaprobe der ELISA-Platte zu.
      HINWEIS: Wenn eine Mausprobe weniger als 40 μl beträgt, dann bringen Sie das Volumen auf 40 μl mit ELISA-Puffer. Notieren Sie dieses Verdünnungsmittelvolumen und verwenden Sie es, um einen Verdünnungsfaktor für jede verdünnte Probe zu berechnen. WannDie Analyse der ELISA-Daten multipliziert die verdünnte Probenkonzentration mit dem Verdünnungsfaktor der Probe, um die tatsächliche Zytokinkonzentration in der ursprünglichen Probe zu bestimmen.
    4. Kompletter ELISA-Test nach Herstellerangaben.

6. Transplantation von Hämatopoetischen Zellen zu Mäusen

  1. Subletale Bestrahlung zur Bedingung des Knochenmarks für die Transplantation
    ANMERKUNG: Die Loma Linda Universität (LLU) verwendet eine Cobalt-60 Strahlungsquelle. Die Tiere werden in einen Kuchenrestrainer gelegt, der 80 cm von der Strahlungsquelle in einem 20 x 20 cm großen Feld und mit einer 0,5 cm langen Lexanschicht auf dem Rückhalter angeordnet ist. Die Belichtungszeit wird berechnet, um eine 225 cGy-Dosis basierend auf der jüngsten Kalibrierung der Quelle zu erreichen (derzeit 2-3 min für diese Quelle).
    1. Unter-letale Bestrahlung von Mäusen (Gesamtkörper-Bestrahlungsdosis von 225 cGy Maximum für immundefiziente Mäuse).
    2. Transplantation hämatopoetischen Zellen ~ 24 h später über </ Em> intravenöse Schwanzveneninjektion
  2. Intra-venöse hämatopoetische Zelltransplantation
    1. Bereiten Sie menschliche Zellsuspensionen für das Transplantat in einem Volumen von 200 μl sterilem PBS pro Maus vor: CD34 + hämatopoetische Stammzellen (HSC): 1 x 10 5 bis 5 x 10 5 Zellen pro Maus und Leukämiezelllinien / Patientenproben: 1 x 10 6 to 5 x 10 6 Zellen pro Maus.
    2. Halten Sie die Zellen bei 4 ° C (Transport auf Eis) bis unmittelbar vor der Transplantation. Stellen Sie sicher, dass die Zellen vor der Transplantation mindestens bei RT liegen.
    3. Desinfizieren Sie die Bio-Schutzhaube und bereiten Sie den Haubenbereich für Transplantatinjektionen vor.
    4. Legen Sie die Maus für mindestens 5 Minuten in den wärmenden Käfig, um eine Erweiterung der Schwanzvenen zu ermöglichen.
    5. Die Zellsuspension vorsichtig mischen und 200 μl in eine Tuberkulinspritze auftragen. Sicher die Nadel beiseite legen, wo es steril bleibt.
    6. Legen Sie die Maus in eine Zurückhaltung und desinfizieren Sie den Schwanz mit Isopropylalkohol.
    7. Mit Standard-intravenösen Injektionstechniken, 17 injizieren die menschliche Zelle Suspension in Maus Schwanz Vene.
      HINWEIS: Schwanzveneninjektionen können mehrere Versuche durchführen, vor allem für einen Anfänger Tierhandler. Kovacscics und Raper's JoVE Video 19 bietet detaillierte Demonstration dieser Tiertechnik.
    8. Überwachen Sie die Wiederherstellung der Maus für ~ 5 min. Aufzeichnen von unerwünschten Ereignissen während der Injektion ( z. B. verschüttete Zellen, große Blutung, übermäßiges Schwanztrauma).
  3. Analyse der menschlichen Zelle Chimärismus in Maus peripheres Blut
    1. Erhalten Sie das nach der Plasmaseparation verbleibende Blutzellpellet in der Mikrotiterröhre (Schritt 5.2.3).
    2. Für die rote Blutkörperchen (RBC) Lyse, resuspendieren die verbleibenden Blutpellets in einem Volumen von PBS gleich Plasma entfernt (um Plasma Volumen zu ersetzen) und gut mischen (Vortex / Pipette).
    3. Übertragen Sie jede wieder suspendierte Blutprobe auf ein markiertes 4-ml-RöhrchenUnd dann RBC-Lysepuffer zu jedem Röhrchen in einem 1: 9-Verhältnis (900 & mgr; l RBC-Lysepuffer für 100 & mgr; l re-suspendiertes Blut) hinzufügen. 5 min bei RT inkubieren. Zentrifuge (5 min, 500 xg) und dekantieren.
    4. Zweite RBC-Lysepuffer-Inkubation durchführen (5 min bei RT). Zentrifuge und dekantieren wie zuvor.
    5. Waschen Sie die restlichen Zellen in ~ 1 ml PBS. Zentrifuge und dekantieren wie zuvor.
    6. Resuspendieren des Pellets in einem PBS-Volumen, das für die Standard-Durchflusszytometrie-Färbung geeignet ist (dies variiert je nach Hersteller und individuellen Laborprotokollen). 20 Verwenden Sie immunphänotypisierende Antikörper, die für den Durchflusszytometer validiert wurden, um die Mauszellen (Maus CD45 +) und menschliche Zellen (humanes CD45 +) 6 , 21 zu identifizieren Sowie zusätzliche menschliche Leukozytenmarker, die für die Zelllinie von Interesse spezifisch sind.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, von jeder Mausprobe ein kleines Volumen (5 μL-20 μL) zu nehmen, um "gepoolte Proben"; Für ungefärbte, lebensfähige und isotypische Kontrollproben zu verwenden. Es ist die beste Praxis, ungefärbte und isotypische Kontrollen für jeden experimentellen Zustand zu haben.

7. Funktionelle Auswertung der In-vivo- Cytokin-Aktivität

  1. Maus-Euthanasie und Gewebeernte
    1. Euthanisieren Mäuse über CO 2 Erstickung zu bestimmten experimentellen Zeitpunkt.
    2. Ernte Blut über Herzpunktion und sammle Plasma wie in den Schritten 5.2.1-5.2.2.
      HINWEIS: Sammeln Sie das Blut vor anderen Geweben, weil es beginnt, sofort nach dem Tod zu koagulieren.
    3. Verarbeiten Sie das Mausblut, aliquotieren und speichern Sie Plasma wie in Schritt 5.2.2.
      1. Zu einem späteren Zeitpunkt die exogene Zytokinkonzentration im Plasma, die bei der Euthanasie über ELISA nach dem Protokoll des Herstellers erhalten wird, beurteilen. Auswertung und Vergleich exogener Zytokinkonzentrationen im Mausplasma aus der seriellen in vivoBlutentnahme und die Euthanasie-Plasmaproben (siehe Abschnitt 5.3).
    4. Füge PBS zur verbleibenden Blutprobe hinzu, um das Plasmavolumen zu ersetzen und wie in den Schritten 6.3.1 und 6.3.2 beschrieben zu verarbeiten. Durchführen von Durchflusszytometrie-Assays sofort oder resuspendieren Zellen im Gefriermedium für LN 2- Speicherung.
  2. Ernten Sie Knochenmark (BM) und Milz von PDX-Mäusen und bereiten Sie einzelne Zellsuspensionen wie zuvor beschrieben vor. 22
  3. Erhalten Sie Zellzählungen für jede PDX-Mausgewebeprobe unter Verwendung von 3% Essigsäure mit Methylenblau (Lyseszellmembranen und RBCs, die intakte Kerne von lebenden Zellen verlassen) in einer 1: 1-Verdünnung und zählen Sie Zellen mit einem Hämocytometer. Tabulieren Sie die Gesamtzellzahl für Knochenmark und Milzproben für jedes Tier.
  4. Zentrifuge (500 xg, 15 min) Zellsuspensionen und dekantieren den Überstand. Durchflusszytometrie-Assays von Knochenmark und / oder Milzzellen sofort durchführen oder im Gefriermedium für LN 2 Speicher.
    HINWEIS: Einfrieren von 10 BM-Aliquoten (für zukünftige biochemische Assays) und ~ 5 Milzaliquots (für zukünftige PDX-Transplantationen) pro Maus.
  5. Immunphänotypisierung zur Identifizierung von in vivo funktionellen Effekten
    1. Bereiten Sie einen Master-Mix (MM) von Durchflusszytometrie-Antikörpern gegen Immunophenotyp-hämatopoetische Population (en) in Reaktion auf das interessierende Cytokin und eine zweite MM von Isotyp-Kontroll-Antikörpern vor (Abbildung 5 und Tabelle der Materialien).
    2. Tau-PDX-Gewebealiquots (37 ° C Wulstbad), hergestellt in Schritt 7.4.
    3. Waschen Sie die aufgetauten Zellen, indem Sie sie auf ein konisches Röhrchen übertragen und das kleinste 3fache Volumen an PBS hinzufügen. Zentrifugieren (500 xg, 5 min) und dekantieren den Überstand.
    4. Wiederholen Sie den Waschschritt (7.5.3).
    5. Erstellen Sie gepoolte Aliquots, indem Sie ~ 10 μL-20 μL Zellen aus jeder PDX-Probe für die ungefärbte Kontrolle, die Lebensfähigkeitssteuerung und die Isotyp-Kontrollen (siehe Schritt 6.4.6 Note) aufnehmen. Färben Sie alle Proben, außer der uNfained Kontrolle, mit einem fixierbaren Lebensfähigkeit Farbstoff (tote Zell-Marker), inkubieren und waschen wie pro Hersteller-Protokoll.
    6. Färben Sie jede PDX-Zellprobe mit Phänotyping-MM gemäß Standard-Durchflusszytometrie-Färbung Protokoll; Ähnlich färben Sie die gepoolte Isotyp-Kontrollprobe (s) mit dem Isotyp-MM. Inkubieren Sie alle Proben, waschen Sie mit PBS und fixieren Sie Proben durch erneutes Suspendieren in 1% Paraformaldehyd.
    7. Sammeln Sie Durchflusszytometrie-Daten und analysieren Sie Daten unter Verwendung einer Gating-Strategie, die für die interessierende Zellpopulation (en) geeignet ist (Abbildung 5 ). Ein typisches Tor ist wie folgt:
      1. Definieren Sie intakte Zellen, indem Sie ein FSC- und SSC-Tor zeichnen, das Schutt ausschließt.
      2. Identifizieren Sie die lebende Zellpopulation, indem Sie auf Zellen treiben, die für den toten Zellmarker negativ sind (dies ist die "totale lebende Zellen").
      3. Verwenden Sie Sub-Gates innerhalb der "totalen lebenden Zellen", um die Zellpopultionen mit dem gewünschten Immunophenotyp zu definieren (siehe Abbildung 5).
      4. Erhalten Sie dieHäufigkeit der Teilmengenzellpopulationen innerhalb der gesamten lebenden Zellzahl aus der Durchflusszytometrieanalyse. 6 , 21
    8. Berechnen Sie die Anzahl der Zielzellen in jedem Gewebe durch Multiplikation der Häufigkeit der B-Zell-Untermenge innerhalb der gesamten lebenden Zellen (erhalten in Schritt 7.5.6.4) durch die gesamte lebende Zellzahl pro Gewebe, erhalten in Schritt 7.3 (% B-Zell-Teilmenge x " Hämocytometer-Zellzahl ", siehe Tabelle 1 )
    9. Vergleichen Sie die Zellzahlen von Zielzellpopulationen zwischen Kontroll-PDX-Mäusen und Cytokin-exprimierenden (TSLP +) PDX-Mäusen, um in vivo funktionelle Effekte des exogenen menschlichen Zytokins zu bestimmen ( Tabelle 1 ).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Eine Übersicht über das Modell ist in Abbildung 1 dargestellt . Sobald Cytokin-produzierende (TSLP + Stroma) und Kontrollstroma erhalten wurden, werden sie in Kultur expandiert. Vor der Stroma-Injektion in Mäuse wird der stromale Zellüberstand durch ELISA zur Überprüfung der Zytokinproduktion (Abbildung 2 ) und der Phospho-Flow-Zytometrie (Protokoll Nr. 3) beurteilt, um die Aktivität des durch das Stroma erzeugten Zytokins zu verifizieren. Der Überstand ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Dieses Manuskript beschreibt eine einfache, schnelle und relativ kostengünstige Methode zur Herstellung von PDX, um exogenes menschliches Zytokin auszudrücken. Die hier beschriebene Strategie basiert auf wöchentlichen intraperitonealen Injektionen einer Stromazelle, die transduziert wurden, um das menschliche Cytokin, TSLP, zu exprimieren. Vor der Durchführung der hier beschriebenen Verfahren wurden Stroma entwickelt, um hohe Konzentrationen des Cytokins von Interesse (TSLP) und ähnlich entwickelten Kontrollstroma zu ex...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH R21CA162259, NIH R01CA209829, NIH P20 MD006988, NIH 2R25 GM060507, einem Hyundai Hope on Wheels Scholar Hope Grant Grant, dem Department of Pathology and Human Anatomy, dem Department of Basic Sciences und dem Center for Health Disparities and Molecular Medicine an der Loma Linda University School of Medicine und durch ein Stipendium zur Förderung kollaborativer und translationaler Forschung von der Loma Linda University (KJP). Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der NIH wieder.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Nasslaborreagenzien 
T-25 Nunc Mit Zellkulturen behandelte EasYFlaskas, 7 mL Fassungsvermögen,   25 cm² KulturbereichThermo Scientific / Fisher156367
T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL Kapazität, 75 cm² Kulturbereich & belüfteteKappe Corning Inc. / Fisher353136
T-150 Falcon Kolben mit Gewebekultur, 600 mL Fassungsvermögen, 150 cm² Kulturbereich & belüftete KappeCorning Inc. / Fisher355001 10 mL
serologische PipettenFalcon357551
15 mL konische Röhrchen aus PolypropylenFisher05-539-12
5 mL konische Polystyrolröhrchen mit rundem BodenFalcon352054
konische Röhrchen aus Polypropylen 50 mLFalcon352098
2,0 mL Kryoröhrchen, AußengewindeCorning Inc. / Fisher4230659
1 mL PipettenspitzenFisher2707509
200 μ L Pipettenspitzen Denville ScientificP3020-CPS
10 μ L PipettenspitzenDenville ScientificP-1096-CP
Sterile Einweg-Filtereinheiten mit SFCA-Membran, Nalgene Rapid-FlowFisher09-740-28D
2 NH2SO4  BioLegend423001
Dulbecco" s phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Calicium und Magnesium, 1-fach;Corning cellgro/ Mediatech21-031-CV
Human TSLP ELISA Max Deluxe SetBioLegend434204
3% Essigsäure mit MethylenblauStemcell Technologies7060
Trypan BlueCorning25-900-Cl
"Trypsin" 1x 0,25 % Trypsin 2,21 mM EDTA in HBSSThermoFisher25-053
TWEEN 20 BioXtraSigma-AldrichP-7949
" R10" Zellkulturmedium, % des Gesamtvolumens (ergibt 565 mL)--Lab Recipe
RPMI, 88,5% (500 mL) Mediatech10-040-CV   
FBS, 9,9% (56 mL) Mediatech35-011-CV
L-Glutamin, 0,99% (5,6 mL)Mediatech25-005-Cl
Penicillin-Streptomycin, 0,50% (2,8 mL)Mediatech30-002-Cl
2-Mercaptoethanol, 0,10% (560 & Mikro; L) MP190242
" R20" Zellkulturmedium, % des Gesamtvolumens (ergibt 195 ml)--Laborrezept
        RPMI, 76,84% (150  mL)siehe obensiehe oben
        FBS, 20,49% (40 mL)siehe obensiehe oben
        2 mM L-Glutamin, 1,02% (2 mL)siehe obensiehe oben
        1 mM Na Pyruvat, 1,02% (2 mL )siehe obensiehe oben
        Penicillin-Streptomycin,  0,51% (1 ml)siehe obensiehe oben
        2-Mercaptoethanol, 0,10 % (0,1 M),  0,10% (200 &Mikro; L)siehe obensiehe oben
" Gefriermedium", % des Gesamtvolumens-Lab Rezept
" R10" mittel, 45%siehe "R10"Rezept-FBS
, 20%siehe oben35-011-CV
DMSO, 10%Corning25-950-CQC
D(-)(+)-Trehalose-Dihydrat, 5%Fisher ScientificBP2687-100
NameCompany>Catolog Number Kommentare
Biologics 
"HS-27" HS-27A humane StromalinieATCCCRL-2496
"CALL-4" MHH-CALL-4 Zelllinie, humane B-Zell-Vorstufe LeukämieDSMZACC 337
" NSG-Mäuse" NICKEN. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, männlich oder weiblich, 6 Jahre – 8 WochenJAX Mäuse # 005557
MUTZ-5-Zelllinie, humane B-Zell-Vorläufer-LeukämieDSMZACC 490
Rekombinantes humanes TSLP-ProteinR& D Systems1398-TS-010
Name<>CompanyCatolog NumberComments
Flow Cytomery Antikörper (Klon)*
Anti-Maus CD45 FITC (30F11)Miltenyi Biotec130-102-778
CD127 PE (MB15-18C9) (alternativer Name ist IL-7Rα)Miltenyi Biotec130-098-094
CD34 APC (8G12)BD Biosciences340667
CD45 PE-Cy7  (HI30)eBioscience25-0459
"FVD" Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff  eFluor 780 eBioscience65-0865
Ig & Kappa; Leichtmetallkette FITC  (G20-193)BD Pharmingen555791
Ig & Lambda Leichtkette FITC (JDC-12)BD Pharmingen561379
IgD PE (IA6-2)BioLegend348203
IgM PE-Cy5 (G20-127)BD Biosciences551079
pSTAT5 PE,  Maus Anti-STAT5 (pY694)BD PhosphoFlow612567
Name CompanyCatolog Number<strong>Comments
Sonstige Materialien & Ausrüstung 
Implantierbarer NanoTransponder mit KanüleTrovan ID-100B(1.25)
EMLA Lidocain-Anästhesiecreme (durch Rezept über eine Tierpflegeeinrichtung erhalten)VerschreibungBD
½ cc LO-DOSE U-100 Insulinspritze 28G½  BD#329461
BD Microtainer-Röhrchen mit K2EDTABD #365974
ZentrifugeBeckman CoulterAlegra X-15R 
FisherBrand Kapillarröhrchen (heparinisiert)Fisher Scientific22-260-950
HämozytometerFisher02-671-6
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi Biotec130-096-343
Maus-Pie-KäfigBraintree Scientific, Inc.MPC-1
Mausschwanz-Illuminator HalterungBraintree Scientific, Inc.MTI STD
Pistolengriff ImplanterTrovan IM-300(1.25)
&Mikro; Quant Bio-Tek Instruments Inc.MQX200
FlowJo Durchflusszytometrie-AnalysesoftwareFlowJo, LLCVersion 10
*Alle Antikörper sind, sofern nicht anders angegeben, gegen den Menschen.
, , -

Referenzen

  1. Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia. J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).
  2. Parrish, Y. K., et al. IL-7 Dependence in human B lymphopoiesis increases during progression of ontogeny from cord blood to bone marrow. J Immunol. 182 (7), 4255-4266 (2009).
  3. Johnson, S. E., Shah, N., Panoskaltsis-Mortari, A., LeBien, T. W. Murine and human IL-7 activate STAT5 and induce proliferation of normal human pro-B cells. J Immunol. 175 (11), 7325-7331 (2005).
  4. Milford, T. A., et al. TSLP or IL-7 provide an IL-7Ralpha signal that is critical for human B lymphopoiesis. Eur J Immunol. 46 (9), 2155-2161 (2016).
  5. Reche, P. A., et al. Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells. J Immunol. 167 (1), 336-343 (2001).
  6. Francis, O. L., et al. A novel xenograft model to study the role of TSLP-induced CRLF2 signals in normal and malignant human B lymphopoiesis. Haematologica. 101 (4), 417-426 (2016).
  7. Willinger, T., Rongvaux, A., Strowig, T., Manz, M. G., Flavell, R. A. Improving human hemato-lymphoid-system mice by cytokine knock-in gene replacement. Trends Immunol. 32 (7), 321-327 (2011).
  8. Graf, L., Iwata, M., Torok-Storb, B. Gene expression profiling of the functionally distinct human bone marrow stromal cell lines HS-5 and HS-27a. Blood. 100 (4), 1509-1511 (2002).
  9. Follenzi, A., Ailles, L. E., Bakovic, S., Geuna, M., Naldini, L. Gene transfer by lentiviral vectors is limited by nuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences. Nat Genet. 25 (2), 217-222 (2000).
  10. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031(2012).
  11. Cockrell, A. S., Kafri, T. Gene delivery by lentivirus vectors. Mol Biotechnol. 36 (3), 184-204 (2007).
  12. Ricardo, R., Phelan, K. Freezing, thawing, and packaging cells for transport. J Vis Exp. (17), (2008).
  13. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5061 (2016).
  14. Tasian, S. K., et al. Aberrant STAT5 and PI3K/mTOR pathway signaling occurs in human CRLF2-rearranged B-precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 120 (4), 833-842 (2012).
  15. Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), (2008).
  16. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5048 (2016).
  17. JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Introducing Experimental Agents into the Mouse. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5161 (2016).
  18. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
  19. Kovacsics, D., Raper, J. Transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice. J Vis Exp. (87), (2014).
  20. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  21. Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Chapter 15, Creation of "humanized" mice to study human immunity. Curr Protoc Immunol. , (2008).
  22. Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. J Vis Exp. (17), (2008).
  23. Scheeren, F. A., et al. Thymic stromal lymphopoietin induces early human B-cell proliferation and differentiation. Eur J Immunol. 40 (4), 955-965 (2010).
  24. Lee, E. B., et al. Increased serum thymic stromal lymphopoietin in children with atopic dermatitis. Pediatr Allergy Immunol. 21 (2 Pt 2), e457-e460 (2010).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Zytokinexpressionstromale ZellinjektionTSLP-Transduktionperitoneale InjektionDurchflusszytometrieELISA-Analysehämatopoetische ZelltransplantationPlasma-Zytokinspiegelstromale Zellkultur
Expression von exogenem Cytokin in Patient-abgeleiteten Xenotransplantaten über Injektion mit einer Cytokin-transduzierten Stromzelllinie
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.