Es wird ein Referenzmessverfahren für die absolute Quantifizierung von Aβ1-42 in humanem Liquor beschrieben, das auf Festphasenextraktion und Flüssigkeitschromatographie und Tandem-Massenspektrometrie basiert.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist die häufigste neurodegenerative Erkrankung bei älteren Menschen und macht 60-80% aller Demenzfälle aus. Derzeit basiert die Diagnose von AD auf kognitiven Tests und Untersuchungen des mentalen Zustands, aber das Peptid Amyloid-beta (Aβ) in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) wird zunehmend in klinischen Studien und Umgebungen verwendet. Wie bei den meisten Protein- und Peptid-Biomarkern erfolgt die Quantifizierung mit antikörperbasierten Techniken, wie z. B. dem Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA). Die Variabilität innerhalb und zwischen den Laboratorien dieser Assays erschwert jedoch die Verwendung als diagnostischer Marker in der klinischen Routine.
Es wurde ein Antikörper-unabhängiges Referenzmessverfahren (RMP) entwickelt, das auf der Festphasenextraktion (SPE) und der Flüssigchromatographie (LC)-Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) basiert, bei der stabile, isotopenmarkierte Aβ-Peptide als interne Standards verwendet wurden, die eine absolute Quantifizierung ermöglichen. Für die Messungen wurde ein hochauflösendes Quadrupol-Orbitrap-Hybridinstrument verwendet. Die Methode ermöglicht die Quantifizierung von Liquor Aβ1-42 zwischen 150-4.000 pg/ml.
Einleitung
Alzheimer-Krankheit (AD) ist die häufigste Form der Demenz und betrifft etwa 35 Millionen Menschen weltweit 1. Die neuropathologischen Kennzeichen der Krankheit weit verbreitet in den Mittelpunkt der AD Pathogenese zu liegen glaubte , sind intrazelluläre Neurofibrillen von hyperphosphorylated Tau - Protein 2 und extrazellulären Plaques , bestehend aus aggregierten Amyloid-beta (Aß) Peptide 3. Im Einklang mit dieser Situation hat die Beurteilung der Plaque Pathologie in vivo durch Biomarker vor kurzem in den Forschungs diagnostischen Kriterien für AD 4 aufgenommen.....
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Protokoll
Hinweis: Dieses Protokoll erfordert Aliquots von mindestens 50 & mgr; l, mit einer Konzentration von 50 ug / ml für jedes Aß-Peptid, als Ausgangsmaterial. Die Aß-Peptide sollten in 20% Acetonitril (ACN) und 4% konzentrierter Ammoniaklösung in entionisiertem Wasser (v / v) und gelagert bei 80 ° C aufgelöst werden.
Achtung: Siehe Tabelle 1 für Sicherheitshinweise.
1. Herstellung der Lösungen
- Herstellung von 100 ml 20% ACN und 4% konzentrierter Ammoniaklösung in entionisiertem Wasser (v / v) mit 20 ml ACN verdünnt und 4 ml konzentrierter Ammoniak (~ 25%) in deionisiertem Wasser. Stelle....
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Ergebnisse
Die Platte Setup in Abbildung 1 für eine volle Platte der Proben verwendet. Wenn weniger unbekannte Proben zu analysieren, sollte der zweite Kalibrator, RF, und QC-Sets nach der ersten Hälfte der unbekannten Proben platziert werden.
Wie in Figur 2 zu sehen ist , sind die Kalibratoren nahe der Regressionslinie mit geringen Standardabweichungen. Diese Methode hat einen geringeren Grad an Quantif.......
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Diskussion
Für das Verfahren beschrieben, stattdessen eine Ersatzmatrix zu verwenden, haben wir den Surrogat - Analyt - Ansatz 13, 14, 15, 16, die Kalibrierung im menschlichen CSF ermöglicht. Der Ersatz Analyt Ansatz beinhaltet zwei verschiedene isotopenmarkierten Standards. Eine (15 NAβ 142) wird verwendet , um die Kalibrierungskurve in menschlichen CSF zu erzeugen, während eine an.......
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Offenlegungen
JP und EP berichten keine Offenlegungen. HZ war Mitglied des Beirats von Roche Diagnostics, Eli Lilly und Pharmasum Therapeutics. KB war als Berater oder Mitglied des Beirats von Fujirebio Europe, IBL International und Roche Diagnostics tätig. HZ und KB sind Mitbegründer von Brain Biomarker Solutions in Göteborg AB, einem auf GU Venture basierenden Plattformunternehmen an der Universität Göteborg.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde im Auftrag der International Federation of Clinical Chemistry Working Group on CSF Proteins durchgeführt, die folgende Zusammensetzung hat: Kaj Blennow (Vorsitzender) und Henrik Zetterberg, Universität Göteborg, Schweden; Les Shaw und Magdalena Korecka, Universität Philadelphia, PA, USA; Ingrid Zegers, Institut für Referenzmaterialien und -messungen, Geel, Belgien; Piotr Lewczuk, Universitätsklinikum Erlangen, Deutschland; und Rand Jenkins, PPD Bioanalytical Laboratory, Richmond, VA, USA; Randall Bateman, Washington University, MO, USA; und H Vanderstichele, Innogenetics NV, Gent, Belgien. Diese Arbeit war auch Teil der Global Consortium for Biomark....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Eppendorf Protein LoBind Mikrozentrifugenröhrchen, 0,5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind Mikrozentrifugenröhrchen, 1,5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind Mikrozentrifugenröhrchen, 2 mL | Eppendorf | 022431102 | |
| Eppendorf Protein LoBind Mikrozentrifugenröhrchen, 5 mL | Eppendorf | 0030 108.310 | |
| Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96 | Eppendorf | 951032905 | |
| Micronic 0,75 mL Polypropylen-Röhrchen, V-Bottom | Micronic | MPW32071BC3 | Röhrchen werden zum Sammeln von SPE-Eluat verwendet, aber es können auch andere Sammelvorrichtungen verwendet werden, wie z. B. 96-Well-Platten. |
| Micronic Split TPE Capcluster für 96 Ind. Röhrchen | Micronic | MP53026 | Kappen für Micronic Röhrchen. |
| Micronic Loborack-96 weiß mit hoher Abdeckung mit Strichcode | Micronic | MPW51015BC3 | Halterung für Micronic Röhren. |
| Biohit Optifit Spitzen 1,2 mL | Sartorius | 791210 | Wird verwendet, um bis zum Boden der LoBind Deepwell-Platten (96-Well) zu reichen. Andere schmale Tipps könnten auch funktionieren. |
| Waters Oasis MCX 96-Brunnen & Mikro; Elutionsplatte | Wasser | 186001830BA | |
| Waters Plate Verteiler Reservoirwanne | Wässer | WAT058942 | |
| Wässer Extraktionsplatte Verteiler für Oasis 96-Well Platten | Wässer | 186001831 | |
| Ammoniumhydroxidlösung, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 Basis | Sigma-Aldrich | 30501-1L-D | |
| Acetonitril, Fern-UV HPLC Gradient Grade, 2,5 L | Fisher Scientific | A/0627/17X | |
| ortho-Phosphorsäure 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur | Merck Millipore | 1005731000 | |
| Guanidinhydrochlorid, 500 g | Thermo Scientific | 24110 | |
| Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupol Orbitrap Massenspektrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | Mit mitgeliefertem Dionex Ultimate 3000 LC & Autosampler. |
| Dionex ProSwift RP-4H Monolith-Säule (1,0 x 250 mm) | Dionex | 066640 | |
| Rinderserumalbumin, lyophilisiertes Pulver, geeignet für (für die Molekularbiologie), nicht acetyliertes | Sigma-Aldrich | B6917 | |
| Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA | rPeptid | A-1002-2 | |
| 15N Beta-Amyloid (1-42), einheitlich markiertes | rPeptid | A-1102-2 | |
| 13C Beta-Amyloid (1-42), | markiertes rPeptid | A-1106-2 | |
| Mikrotiterplattenschüttler, TiMix 2 | Edmund Bü HLER | 6110 000 |
Referenzen
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's disease. N Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- Braak, H., Braak, E. Evolution of the neuropathology of Alzheimer's disease. Acta Neurol Scand Suppl. 165, 3-12 (1996).
- Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer's disease. L....
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Nachdrucke und Genehmigungen
