Methodenartikel

Herstellung von nichtmenschlichen Primaten Hirngewebe für die Pre-Einbettung Immunhistochemie und Elektronenmikroskopie

DOI:

10.3791/55397

⸱

3. April 2017

 , 
1Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec, Department of Psychiatry and Neuroscience, Université Laval, 2Centre de recherche du CHU Sainte-Justine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier bieten wir eine einfache, kostengünstige und zeitsparendes Protokoll zu chemisch fixieren Primaten Hirngewebe mit Acrolein Fixiermittel, so dass für die Langzeitarchivierung, die kompatibel mit vorge Einbettung Immunhistochemie für die Transmissionselektronenmikroskopie.

Zusammenfassung

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Trotz aller technologischen Fortschritte bei der Lichtmikroskopie Niveau bleibt Elektronenmikroskopie das einzige Werkzeug in den Neurowissenschaften zu untersuchen und zu charakterisieren, ultrastrukturelle und morphologische Details von Neuronen, wie synaptische Kontakte. Gute Erhaltung von Hirngewebe für die Elektronenmikroskopie kann durch strenge Kryo-Fixierung Verfahren erhalten werden, aber diese Techniken sind ziemlich teuer und begrenzen die Verwendung von Immunmarkierung, die von entscheidender Bedeutung ist, um die Konnektivität von identifizierten neuronalen Systemen zu verstehen. Gefriersubstitution Verfahren wurden die Verbindung von Kryo-Fixierung mit Immunmarkierung zu ermöglichen, entwickelt. Allerdings stützt sich die Reproduzierbarkeit dieser methodischen Ansätze in der Regel auf teure Gefriergeräte. Darüber hinaus wird mit dieser Technik zuverlässige Ergebnisse zu erzielen ist sehr zeitraubend und Geschick schwer. Somit bleibt das traditionelle chemisch fixierte Gehirn, insbesondere Acrolein Fixiermittel, eine zeiteffiziente und kostengünstige Methode Elektron zu kombinierenMikroskopie mit Immunhistochemie. Hier bieten wir ein zuverlässiges experimentelles Protokoll unter Verwendung von chemischen Acrolein Fixierung, die zur Erhaltung der Primaten Hirngewebe führt und ist kompatibel mit Pre-Einbettung Immunhistochemie und Transmissions-Elektronen-mikroskopische Untersuchung.

Einleitung

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Lichtmikroskopie, einschließlich konfokale und Zwei-Photonen - Mikroskopie, hat sich als ein wirksames Instrument zur in vivo neuronalen Prozesse zu studieren, unter anderem 1, 2. Obwohl die typische räumliche Auflösung bei der Lichtmikroskopische (LM) Ebene ungefähr 200 nm, die jüngsten technologische Fortschritte sind verschiedene Lichtquellen, wie beispielsweise extremer Ultraviolett- und weiche Röntgenmikroskopie, hat insbesondere diese Auflösung auf eine fast 10 nm räumlichen Auflösung erhöht 3 , 4, 5. Weitere technologische Fortschritte in der bildgebenden Magnetresonanz - Bildgebung umfassen mit der Histologie kombiniert und bieten ein neues Verfahren zur in vivo , die Dicke der Myelinscheide Messen eines Parameters, der traditionell meßbaren nur an der Elektronenmikroskopische (EM) Stufe 6, 7 war. Although diese Fortschritte bei der LM-Ebene ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Untersuchung lebende Prozesse liefern, um eine Detailansicht und Charakterisierung von Strukturen, wie synaptische Kontakte kann nur mit EM erreicht werden, die eine Auflösung bietet, die 0,5 nm erreichen kann. Allerdings Beobachtung bei der EM-Ebene erfordert die Proben in gewisser Weise tot und verändert zu werden, mit chemischen Fixateure und Entwässerungsverfahren, um die Zytoarchitektur zu bewahren. Somit können biologische Proben bei hoher Auflösung der Prüfung herausfordernd aufgrund von Strahlungsschäden des Elektronenstrahls, geringem Kontrast, strukturelle Abweichungen von Membranen oder auch das Vorhandensein von Artefakten , die nach der Dehydratisierung und epoxy auftreten können Einbettung 8, 9, 10.

Die Erhaltung Proben in ihrer nativen Form für die Strukturanalyse kann mit „Cryo EM verglastem Sections“ oder CEMOVIS, mit schneidendem Ansatz erreicht werden, dassbeinhaltet schnell einfrieren und die Probe in Eis glasiger Einbettungs und die Abschnitte unter der EM bei einer kryogenen Temperatur 11, 12 zu untersuchen. Dieses Verfahren ermöglicht die Untersuchung von Proben , während sie noch fester und vollhydratisierte sind, so dass Artefakte , die durch Austrocknung Beseitigung verarbeitet 13. Jedoch beinhaltet dieses Verfahren zusätzliche Vorrichtungen für Kryo-Ultramikrotomie, sowie zusätzliche Geräte auf dem Standard-EM, um diese Beobachtung bei sehr niedrigen Temperaturen zu ermöglichen, was erhebliche Mehrkosten erzeugen. Darüber hinaus schließt die CEMOVIS Ansatz die Verwendung von Techniken Immunmarkierung, da Antikörper in der Regel bei RT inkubiert werden müssen. Alternativ ist es möglich, ultrastrukturelle Analyse mit immunhistochemischen Verfahren zu kombinieren, indem eine Gefriert Substitution Ansatz, bei dem Kryo-fixierten Proben langsam aufgetaut werden, während in Cryo-Schutzchemikalien immerged und sind then in Spezialharze eingebettet, wie Lowicryls. Post-Einbettung Immunmarkierung kann dann auf einem solchen Material 12 durchgeführt werden. Allerdings Gefriersubstitution und Kryo-Fixierung Techniken sind zeitaufwendig. Sie erfordern die Installation zusätzlicher Ausrüstung und erfordern noch Proben zu organischem Lösungsmittel und chemische Fixiermittel ausgesetzt werden, die die Zytoarchitektur verändern können, trotz der Verwendung einer niedrigen Temperatur 14, 15. Daher trotz aller technologischen Fortschritte sowohl bei dem LM und EM - Ebene, chemische Fixierung von Hirngeweben, insbesondere Acrolein, bleibt eine kostengünstige und zeitsparende Methode zu kombinieren Immunhistochemie mit EM 16.

In den letzten Jahrzehnten wurden viele Versuche unternommen, eine Mischung von Aldehyden zu finden, das die beste Gewebeerhaltung bieten. Vor den 1960er Jahren die einzige Fixiermittel Chemikalie, die akzeptable Ergebnisse für EM gab, war Osmiumtetroxid. Allerdings ist Osmiumtetroxid sehr giftig und teuer, ihre Verwendung durch das Gefäßsystem ausschließen Organe wie das Gehirn zu fixieren. Acrolein wurde in den späten 1950er Jahren als ein zuverlässiges Verfahren für die Tiergewebekonservierung geeignet für EM Beobachtung von Zellstrukturen 17 eingeführt. Es durchdringt die tiefen Gewebe und reagiert schneller als anderer Aldehyde , wenn zur Fixierung durch Eintauchen verwendet , und ermöglicht eine gute Konservierung zytoplasmatischer Komponenten mit minimaler Schrumpfung des Gewebes 17. Ein solches Merkmal ergibt Fixierung acrolein einen klaren Vorteil gegenüber anderen Aldehyden in frischem Gewebe bei der Verwendung, durch eine genauere Lokalisierung von lebenden molekulare Verbindungen ermöglichen, wie Enzyme und andere Proteine , 18. Tatsächlich hat es sich als einfache, effiziente und kostengünstige Methode der Fixierung für Visualisierung an der EM-Ebene in vielen Arten, darunter Amphibien und Nagetiere, wie sie effizient stabili im Laufe der Jahre validiertZES Peptide und Proteine, behalten Antigenität und liefern relativ intakt Ultrastruktur , wenn 16 in Kombination mit einem anderen Aldehyd Fixativ verwendet, 18, 19, 20, 21. Protokolle für Acrolein Fixation in Nagetieren seitdem wurden umfassend, vor allem durch die Pickel - Gruppe, zur Umsetzung dual Immunomarkierung für EM 16, 22 standardisiert und verwendet. Einige Gruppen haben Acrolein Fixation in nicht-menschlichen Primaten - Hirngewebe 23 verwendet. Jedoch unser Wissen gibt es nur ein veröffentlichtes Protokoll effizient chemische Fixierung mit Acrolein in nicht-menschlichen Primaten beschreibt , die kompatibel sind mit EM Immunmarkierung 24.

In diesem Artikel stellen wir eine einfache und zuverlässige Methode effizient chemisch nicht-hum zu behebenein Primaten Gehirne mit Acrolein, so dass für eine potentiell langfristige Konservierung sowie vor Einbettungs Immunomarkierung und Übertragung EM Prüfung.

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Protokoll

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Ethik-Statement: Alle Protokolle Tiere beteiligt sind, wurden durch die Comité de Protection des Animaux de l'Université Laval genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren (Ed. 2) hergestellt. Das hier beschriebene Protokoll wurde von ca. 800 g für ausgewachsene Tiere optimiert. Die Volumina des Fixiermittel sollte nach dem Tiergröße angepasst werden.

1. Herstellung von Lösungen für die transkardiale Perfusion

  1. Herstellung von 1 l eines 50 mM Natriumphosphat-gepufferte Saline (PBS) -Lösung, entsprechend den folgenden Schritten. Bereiten Sie die Lösung höchstens 24 Stunden vor der Perfusion und Halten bei 4 ° C bis zur Verwendung.
    1. Messung 800 ml destilliertem Wasser in einem 1 L Becherglas. Hinzufügen 5,87 g wasserfreies zweibasisches Natriumphosphat (Na 2 HPO 4), 1,20 g monobasisches Natriumphosphat - Monohydrat (NaH 2 PO 4 · H 2 O) und 9 gNatriumchlorid (NaCl). Stir aufzulösen.
    2. Den pH-Wert auf 7,4 durch die schrittweise Zugabe von 5 N NaOH. In destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1 l zu erreichen
      ACHTUNG: NaOH ist eine ätzende chemische Verbindung. Tragen Sie die erforderliche Schutzausrüstung (PSA;. Laborkittel, Handschuhe, Schutzbrille, etc.).
  2. 2 l 4% Paraformaldehyd (PFA) gemäß den folgenden Schritten. Diese Lösung soll bis zur Verwendung bei höchstens 24 Stunden vor der Operation und bei 4 ° C hergestellt werden.
    1. Messen 1,5 l destilliertem Wasser in einem 2-l-Becherglas. Hinzufügen 23,48 g wasserfreies zweibasisches Natriumphosphat (Na 2 HPO 4) und 4,80 g monobasisches Natriumphosphat - Monohydrat (NaH 2 PO 4 · H 2 O). Stir aufzulösen. In destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 2 L. zu erreichen
    2. Die Lösung wird unter einer Entlüftungshaube, bis die Temperatur etwa 45 erreicht - 55 ° C. Erhitzen Sie nicht auf über 60 ° C.
    3. Allmählich 80 g PFA zu der Lösung hinzu und rührt bis zur vollständigen Auflösung (ca. 30 bis 60 min). Halten Sie die Temperaturüberwachung zu halten, unter 60 ° C.
      ACHTUNG: PFA ist sehr volatil in seiner Pulverform. Es ist sehr giftig, wenn in Kontakt mit den Augen oder der Haut und ist bei Einatmen oder Verschlucken gefährlich. Tragen Sie PPE und mit Vorsicht unter einer Entlüftungshaube verwenden.
    4. Die Lösung wird auf 4 ° C und Filter nach unten. Lagerung bei 4 ° C.
  3. Bereiten 1 l 3% Acrolein in 0,1 M Phosphatpuffer (PB) gemäß den folgenden Schritten. Die PB-Lösung sollte höchstens 24 Stunden vor der Perfusion hergestellt werden.
    ACHTUNG: Acrolein ist sehr giftig beim Einatmen und unmittelbaren Schaden erzeugen. Es ist auch korrosive und hochgiftig, wenn durch die Haut absorbiert. Es ist krebserregend und erbgutverändernd. Tragen Sie die geeignete PSA und Einsatz unter einem Entlüftungshaube.
    1. Messen Sie 800 ml destilliertem Wasser. Hinzufügen 8,66 g wasserfreies zweibasisches Natriumphosphat (Na & sub2 ; HPO 4) und 5,38 g monobasisches Natriumphosphat - Monohydrat (NaH 2 PO 4 · H 2 O). Rühren, bis alle Salze aufzulösen. Destilliertes Wasser, um ein Gesamtvolumen von 1 l Die Lösung wird bei 4 ° C zu erreichen.
    2. Vor der Operation überträgt 900 ml der PB-Lösung in einen 1-L-Glasbehälter und fügen 30.94 ml 97% Acrolein Lösung unter einem Entlüftungshaube. In PB Lösung ein Gesamtvolumen von 1 l und umrühren zu erreichen. Filtriere die Lösung und halten sie auf 4 ° C.

2. transkardiale Perfusion und Gehirnsezierung

  1. Halten Sie Lösungen auf Eis während des gesamten chirurgischen Eingriffs. Vorbereiten der Pumpe durch das Rohr in der ersten Lösung verwendet werden, zu platzieren (PBS; 50 mM) und Drehen der Pumpe, bis keine Luft verbleibt im Schlauch. Für die transkardiale Perfusion eines Makaken-Affen, verwendet, um eine 21 G-Nadel und stellen am Ausfluss etwa 80 ml / min.
  2. Betäubt das Tier mit einer intramuskulären Injektion einer Mischungture von Ketamin (20 mg / kg), Xylazin (4 mg / kg) und Acepromazin (0,5 mg / kg). Pflegen das Tier unter Isofluran (3%) Sedierung.
  3. Bringen Sie die Gliedmaßen des Tieres an einen Entlüftungstisch.
  4. Mit einem Skalpell, entfernen Sie die Haut mit den Achseln. Schneiden Sie die Bauchmuskeln. Verwenden Sie schwere chirurgische Schere, die Rippen zu schneiden seitlich durch sorgfältig die lebenswichtigen Organe zu vermeiden.
  5. Schneiden Sie die Membran mit chirurgischen Schere und heben Sie den Brustkorb, das Herz zu belichten. Sobald die Membran geschnitten wird, gehen Sie schnell, da wird das Herz innerhalb von wenigen Minuten zu schlagen stoppen.
  6. Entfernen Sie die Perikard mit einer Skalpellklinge und die Nadel in die linke Ventrikel. Mit einem Skalpell, machen vorsichtig eine kleine Entfernung in den rechten Vorhof. Schnell die Pumpe bei 72 ml / min gestartet und die Nadel in Position halten. Wenn möglich, kippen Sie das Tier, um auf einem niedrigeren Niveau den Kopf zu haben, als das Herz.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht die Scheidewand zu durchdringen, wenn die Nadel eingeführt wird.
    1. Rinse das Blut mit etwa 300 ml PBS, bis die Lungen sind weiß und kein Blut kommt aus dem rechten Vorhof.
  7. Stoppen der Pumpe übertragen schnell den Schlauch / Rohr auf das 3% Acrolein-Lösung und wieder starten die Pumpe. Erhöhen Sie die Pumpgeschwindigkeit auf 80 ml / min, wenn das Herz zu schlagen aufgehört hat. Perfundieren etwa 500 ml der Acroleinlösung.
  8. Stoppen Sie die Pumpe, schnell den Schlauch an die 4% PFA-Lösung übertragen, und die Pumpe erneut starten. Dieser Schritt erfordert etwa 1 l PFA.
    HINWEIS: Die Fixierung abgeschlossen ist, wenn die vorderen Gliedmaßen steif starr und der Hals sind.
  9. Schneiden Sie den Kopf und seziert vorsichtig das Gehirn aus dem Schädel. Achten Sie darauf, nicht mit den chirurgischen Instrumenten, das Gehirn zu beschädigen. Die Perfusion ist optimal , wenn das Gehirn ist blass (keine Spur von Blut) und starre (1A).
  10. Tauchen intaktes Gehirn in 4% PFA für 1 h bei 4 ° C.
  11. schneiden seriell das Gehirn mit einem Kühl Vibratom (4 ° C)in der gewünschten Ebene in 50 & mgr; m dicke Abschnitte und sammeln sie in PBS (0,1 M) (1B).
    Hinweis: dieser Schritt in vielerlei Hinsicht kann nach durchgeführt zu dem gewünschten Protokoll. Hemisphären kann vor dem Vibratom Schneiden getrennt werden, oder ganzen gehalten. Wenn das Gehirn für die Vibratom Plattform zu groß ist, kann es in kleinere Blöcke geschnitten werden. Nach diesem Schritt können Abschnitte für einen langen Zeitraum bei -30 ° C in einer Gefrierschutzlösung aus 40% PB (50 mM), 30% Glycerin und 30% Ethylenglykol gelagert werden.

3. Pre-Einbettungs Immunhistochemie (1C)

  1. Bereiten eine 4 l Stammlösung von Tris-gepufferter Saline (TBS, 50 mM, pH 7,6) wie folgt.
    1. Messung 2 l destilliertem Wasser in einem 4 l Becherglas, fügt 24,23 g Trihydroxymethyl aminomethan (THAM; C 4 H 11 NO 3), und umrühren aufzulösen.
    2. Den pH-Wert auf 7,6 mit etwa 148 ml 1 N HCl. Die Säure sollte mit cauti hinzugefügt werdenauf zu vermeiden, einen pH-Wert unter 7,6 zu erreichen. Das Gesamtvolumen sollte 4 L. sein
      ACHTUNG: HCl ist stark ätzend. Tragen Sie die geeignete PSA.
  2. Wählen Abschnitte (aus Schritt 2.11), um die Region von Interesse enthalten, für EM Immunhistochemie verarbeitet werden.
  3. Waschen Sie die freischwebenden Teile 3x in PBS (0,1 M, pH 7,4) für 5 min bei RT die Gefrierschutzlösung zu spülen.
  4. Vorbereiten einer 0,5% igen Lösung von NaBH 4 in PBS verdünnt.
    1. Man wiegt 0,05 g NaBH 4 , und verdünnte sie in 10 ml PBS. Nicht abdecken. Bereiten Sie diese Lösung unmittelbar vor Gebrauch.
  5. Inkubieren Sie die Abschnitte in der frisch hergestellten NaBH4 - Lösung für 30 min bei RT. Rock sanft. Nicht abdecken.
  6. Wasch 3x in PBS für 10 min bei RT, bleibt, bis keiner des Reaktionsgases kräftig schaukeln.
  7. Bereiten eine Blockierungslösung für EM mit 2% entsprechendem Normalserum und 0,5% Gelatine in kaltem PBS Fisch verdünnt.
    HINWEIS: Die Menge shoulzu haben, ausreichend für die folgenden drei Schritte d berechnet werden, um. Verwenden, um ein Serum aus der gleichen Tierspezies aus dem sekundären Antikörper hostet. Vermeiden die Verwendung von Antigen-Retrieval-Verfahren oder Zugabe von geringen Mengen von Triton (das Eindringen von Antikörpern zu erhöhen), wie diese Verfahren erheblich die Qualität des Gewebes beeinträchtigt wird.
  8. Inkubieren Sie die Abschnitte in der Blockierungslösung für 1 h bei RT. Rock sanft.
  9. Bereiten primäre Antikörperlösung in der Blockierungslösung verdünnt.
    HINWEIS: Die Konzentration des primären Antikörpers ist in der Regel der gleiche wie für LM Immunhistochemie, aber vorher mit verschiedenen Antikörperkonzentrationen der Durchführung von Tests betrachten, da einige primären Antikörper mit Acrolein können nicht funktionieren. Wenn ja, ist es möglich, eine Mischung aus Glutaraldehyd zu verwenden (0,1-2%) und 4% PFA für transkardiale Perfusion und ähnliche Ergebnisse zu erzielen. Optimierung der Inkubationszeit und -temperatur sowie.
  10. Inkubieren der Schnitte in primären Antikörperlösungüber Nacht bei RT unter leichtem Schütteln. Verwenden einer zuvor getesteten Inkubationszeit und Temperatur.
  11. Waschen Sie die Abschnitte 3x in PBS für 5 min bei RT unter leichtem Schütteln.
  12. Bereiten einer 1: 1000 Lösung von biotinyliertem sekundärem Antikörper in der Blockierungslösung verdünnt.
    HINWEIS: Der sekundäre Antikörper muss gegen die Wirtsart angehoben werden verwendet, um die primären Antikörper zu erzeugen.
  13. Inkubieren der Schnitte in sekundären Antikörperlösung für 1,5 h bei RT. Rock sanft.
  14. Bereiten eine Avidin-Biotin-Peroxidase (ABC) Lösung, die mindestens 60 min vor dem Ende der sekundären Antikörper inkubiert.
    1. Verwenden einer kalibrierten Pipette 8,80 ul / ml der Lösungen A und B und verdünnte sie in PBS zu messen.
    2. Rock mild für mindestens 60 min bei RT der komplett zu ermöglichen Bindung zwischen Avidin und Biotin-Molekülen.
  15. Nach der Inkubation in sekundärer Antikörperlösung, Waschen 3x in PBS für 10 min bei RT.
  16. Inkubieren Sie die Abschnitte in dem ABC solution für 1 h bei RT. Rock sanft.
  17. Waschen Sie einmal in PBS und zweimal in TBS für 10 min bei RT unter leichtem Schütteln.
  18. Eine frische Lösung von 0,05% 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) mit 0,005% H 2 O 2 in TBS verdünnt.
    1. Man wiegt 12,5 mg DAB und verdünnt es in 25 ml kaltem TBS. Vor Licht schützen.
      ACHTUNG: Das DAB-Pulver ist sehr volatil und gesundheitsschädlich beim Einatmen. Es ist karzinogen und teratogen. So Frauen schwanger sind oder stillen, sollten dieses Produkt nicht manipulieren, auch wenn verdünnt. Verwenden Sie eine N95-Maske, wenn die Manipulation und PSA tragen.
    2. Filtriere die Lösung und füge 4,5 ul 30% H 2 O 2 kurz vor der Verwendung.
  19. Inkubieren Abschnitte in der DAB-Lösung für 3 bis 7 min bei RT. Rock sanft.
    HINWEIS: Der braune Niederschlag nicht zu dunkel sein sollte, um ein hohes Maß an Hintergrundfärbung zu vermeiden. Die Inkubationszeit sollte entsprechend optimiert werden.
  20. Die Reaktion durch schnell zweimal Waschenin kaltem TBS und dann zweimal für 10 Minuten in kaltem TBS bei RT, gefolgt von zweimal 10 min in PB, mit mildem Rocking.
    HINWEIS: Die Verwendung von PB (und nicht PBS) ist von entscheidender Bedeutung, um alle Spuren von NaCl zu beseitigen, wie es mit Osmium und bilden Kristalle reagieren würde.

4. Osmification and Embedding für Elektronenmikroskopische Beobachtung

  1. Es wird eine Lösung von 1% Osmiumtetroxid (OsO 4) , verdünnt in PB. Vor Licht schützen.
    ACHTUNG: Osmium ist sehr giftig und soll in Kontakt mit der Haut, Augen nicht kommen, oder dem Mund und nicht inhaliert werden soll. Es kann zum Tod führen, wenn sie verschluckt. Es sollte nur unter einer Entlüftungshaube und mit geeigneten PSA verwendet werden.
  2. Inkubieren der Schnitte in OsO 4 -Lösung für 30 min bei RT unter der Entlüftungshaube (ohne Rühren) und sie mit Aluminiumfolie sie vor Licht zu schützen. Abflachen vollständig die Abschnitte vor der OsO 4 -Lösung hinzugefügt.
    Hinweis: Die Abschnitte werden sehr dunkel und rigid und sollte mit Sorgfalt nach diesem Schritt manipuliert werden.
  3. Bereiten wasserabweisenden Epoxidharz während des osmification.
    1. Fügen geeignete Mengen jeder Komponente der Epoxidharzes Mischung (20 g Epoxidharz 20 g Härter, 0,6 g Beschleuniger und 0,4 g Weichmacher) zu einem großen Kunststoffbecher. Rührt mit einem Holzstab oder Plastikpipette, bis eine homogene braune Farbe erhalten wird.
      HINWEIS: Es ist wichtig, den genauen Anteil der einzelnen Komponenten zu verwenden.
    2. Übertragen Sie gleiche Mengen an Aluminiumbecher geeigneter Größen, abhängig von der Anzahl der Abschnitte verarbeitet werden. Lassen Sie es ruhen.
  4. Waschen Sie die osmificated Abschnitte für 10 min bei RT mit Low-Speed-rocking in PB 3x.
  5. Dehydrieren, die Abschnitte in der folgenden Reihe von abgestuften Ethanol für 2 min je 2 mal in 35% Ethanol; 1-mal jeweils in 50, 70, 80, 90 und 95% Ethanol; und 3x in 100% Ethanol.
  6. Übertragen Sie die Abschnitte zu Glasfläschchen, die dehydrati zu vervollständigenauf das Verfahren durch die Abschnitte 3 mal für 2 min in propylenoxid inkubierte.
    ACHTUNG: Propylenoxid ist eine sehr volatil und toxischen organischen Lösungsmittel. Es kann zu schweren Schäden in den Augen verursachen oder die Haut bei Berührung oder Einatmen oder Verschlucken. Es wurde als Grad 2 krebserregende Substanz eingestuft. Es sollte nur unter einer Entlüftungshaube und mit PPE verwendet werden. Es ist auch sehr leicht entflammbar und soll weg von jeder Wärmequelle gehalten werden.
    HINWEIS: Vor diesem Schritt sollten sorgfältig Abschnitte in Glasphiolen übertragen werden, da Propylenoxid ist ein organisches Lösungsmittel und ist nicht kompatibel mit Kunststoff. An diesem Punkt Abschnitte sind sehr empfindlich und sollten mit Vorsicht gehandhabt werden. Abschnitte können alternativ an Glasphiolen vor übertragen werden 4,5 Schritt.
  7. Transferabschnitte sorgfältig, eins nach dem anderen, in den Aluminiumbecher und vermeiden Kontakt mit Luft so viel wie möglich. Flach einzubetten, die Abschnitte in vorher gemischten wasserabweisenden Epoxidharz und inkubieren sie über Nacht unter dem Venting Haube bei RT.
    HINWEIS: Bei diesem Schritt sind die Abschnitte vollständig entwässert und sehr zerbrechlich und sollte mit Vorsicht gehandhabt werden.
  8. Verwendung von Mineralöl, Fett herzustellen beschichtete Glasobjektträger zusammen mit gefetteten Kunststoff-Deckgläschen.
  9. Erweichen des Harzes durch Aluminiumbecher bei 60 ° C für 12-15 min höchstens inkubierte. abflachen bitte die Abschnitte auf der Seite des gefetteten Glasträgers. Legen Sie das gefettete Deckglas und vorsichtig herausschieben verbliebene Luft.
  10. Inkubieren der Objektträger bei 60 ° C für 48 h.
    HINWEIS: Es ist wichtig, nicht 48 Stunden Inkubationszeit überschreiten, da das Harz zu hart werden wird.
  11. Entfernen Sie das Plastikdeck.

5. Probenvorbereitung für die Ultradünnes Sectioning und Beobachtung ein Transmissionselektronenmikroskop

  1. Verwenden Sie ein Fernglas in die Region von Interesse zu finden und ein kleines viereckiges Stück von etwa 1 mm 2 mit einem Skalpell geschnitten.
  2. Datei, die die Spitze eines Harzblock und kleben die quadrangular Stück auf sie (Figur 1C). Lassen Sie den Kleber für mindestens 1 h oder über Nacht vor dem Schneiden trocknen.
  3. Unter Verwendung eines Ultramikrotoms, schneiden die viereckiges Stück in 80 & mgr; m dicke Abschnitte (1D).
    1. Platzieren Sie den Harzblock in einem Ultramikrotom Deck in der vertikalen Position und eine scharfe Rasierklinge geschnitten allmählich auf jede Seite des Harzblockes zu einem Trapez mit glatten Seiten zu bilden.
    2. Legen Sie das Deck in seiner horizontalen Position und dreht, um den Block, bis die längste Seite des Trapezes nach unten weist.
    3. Verwenden eines Diamantschneidwerkzeug oder ein Glas Messer der Oberfläche des viereckigen Stück zu trimmen. Stellen Sie die Ultramikrotom geschnitten 300 & mgr; m dicke Schnitte bei 1 mm / s. Justieren des Messers auf das viereckige Stück zu sein, vertikal parallel und einen sehr kleinen horizontalen Winkel von etwa 1 ° bis anzuzeigen.
      HINWEIS: Dieser Winkel der Benutzer das Gewebe ermöglicht, fast zu nähern, um die Oberfläche des b parallelsperren, wo immunomarkiert Elemente eher zu finden sind. Wenn diese Parameter mit dem Diamantschneidwerkzeug verwendet wird, zeigt das Harz eine glänzende weiße Farbe. Wenn das Gewebe geschnitten wird, ändert es zu einer violetten oder grünlicher Farbe.
    4. Verwenden ein ultra 45 ° Diamantmesser mit einem Boot mit destilliertem Wasser gefüllt ausgestattet 80 um dicke Schnitte geschnitten, glätten Abschnitte durch mit einem Stück über sie verläuft Papier absorbiert in Xylol gekippt, und sammelt Serienschnitt auf Formvar-beschichtete Nickelschlitzgittern oder bare 150 mesh - Kupfergitter (Figur 1E).
  4. Platzieren Sie die Gitter in einem Raster Aufbewahrungsbox.
  5. Beflecken die Gitter mit Bleizitrat.
    1. Verwenden, um eine 5-ml-Spritze und ein 0,2 & mgr; m-Spritzenfilter eine 1 vorzubereiten: 1-Lösung von gefiltertem Bleicitrat Stammlösung filtriert und destilliertes Wasser. Schützen Sie es vor Licht.
      HINWEIS: Die Stammlösung von Bleizitrat sollte jeden Monat frisch gemacht werden, um die Bildung von festen Depos zu vermeidenseine. Sehen Sie sich das Materialdatenblatt für die Aktien Rezept. wenn viele Reihe von Gittern zu färbenden müssen, ändern Sie die verdünnte Lösung Zusätzlich wird, wenn es milchig wird.
    2. Platzieren jedes Gitter auf einen Tropfen der verdünnten Lösung, mit dem Abschnitt in Kontakt mit der Lösung. Inkubieren für 3 min.
    3. Verwenden kleine Pinzette das Raster zu halten, und es gründlich in zwei Becher spülen destilliertes Wasser enthielt.
    4. Entfernen Sie überschüssiges Wasser durch vorsichtige absorbierendes Papier. Speichern der Gitter in einer Gitterbox. Warte 30 min vor dem Abschnitt durch Transmissions - Elektronenmikroskopie untersucht (TEM; 1F).

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Ergebnisse

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In diesem Abschnitt präsentieren wir repräsentative Ergebnisse, die nach der Beobachtung erhalten wurden, bei der Übertragung EM-Ebene, von immunhistochemisch primate Hirngewebe chemisch mit einem Gemisch aus 3% Acrolein und 4% PFA fixiert. Wir erzielen gute Konservierung der Ultrastruktur, wie durch die relativ intakte Myelinscheide und der reinen Visualisierung von Doppelmembranen (2A) angedeutet ist . Synaptische Kontakte zusammen mit neuronaler Elemente aus der Mikro...

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Diskussion

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In diesem Artikel präsentieren wir ein zuverlässiges Protokoll für transkardiale Perfusion von nicht-menschlichen Primaten und Pre-Embedding Immunhistochemie geeignet für EM Probenprüfung. Obwohl typische Kryo-EM, wie CEMOVIS, eine gute Erhaltung des Gehirns Ultra bietet, schränkt sie auch die Verwendung von Immunhistochemie 12. Andere Techniken, einschließlich Kryo-Substitution und Tokuyaso Technik erlauben post-Einbettungs Immunhistochemie, aber diese Techniken sind teuer aufgrund zusätzlicher ...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde von den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada (NSERC, 401848-2011 zu MP) unterstützt. MP erhielt eine Karriere Auszeichnung vom Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S). LE war der Empfänger einer Promotionsstipendium aus dem FRQ-S (FRQ-S 14D 29441). Wir danken Marie-Josée Wallman für technische Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Dibasisches wasserfreies Natriumphosphat (Na2HPO4)Fisher scientificS374-500
Monobasisches Monohydrat-Natriumphosphat (NaH2PO4· H2O)EM ScienceSX0710-1
Natriumchlorid (NaCl)Fisher scientificS271-3
Hydroxymethylaminomethan (THAM)Fisher scientificT370-500
HCl EMDHX0603-31 N Verdünnung. Das Produkt ist ätzend. Mit entsprechendem Schutz verwenden.
NaOHEMDSX0590-15 N Verdünnung. Das Produkt ist ätzend. Mit entsprechendem Schutz verwenden.
Paraformaldehyd (PFA)SigmaP61484% Verdünnung. Das Produkt ist in Pulverform leicht flüchtig und hochgiftig. Mit Vorsicht unter einer Entlüftungshaube mit entsprechendem Schutz verwenden.
Acrolein (90%)Sigma1102213% Verdünnung. Das Produkt ist hochgiftig. Unter einer Entlüftungshaube mit entsprechendem Schutz verwenden.
Beatmungstisch für AutopsieMopecCE400
Elektronische Perfusionspumpecole parmermasterflex L/S 7523-90
Nadel (Perfusion)terumo NN-1838R18 G 11/2
Nadelterumo NN-2713R21 g 1/2
Ketamin20 mg/kg
Xylazin4 mg/kg
Acepromazin0,5 mg/kg
Skalpell
SkalpellklingenFedern                   Lanze201011                    J9913Nr.22 für die Chirurgie und Nr. 11 für EM
Chirurgische Schere
Rongeurs
VibratomeLeicaVT 1200SKalibrieren Sie die Klinge vor jedem Gebrauch, wenn das Gerät es zulässt
Vibratome RasierklingeGilletteGIN 642107
GlycerolFisher scientificG33-430% Verdünnung
EthylenglykolFisher scientificE178-430% Verdünnung
Natriumborhydrid (NaBH4)SigmaS-9125
Normales Pferdeserum (NHS)Jackson immunoResearch Laboratories008-000-1212% Verdünnung
KaltfischgelatineAurion900.0330,5% Verdünnung. Das Originalprodukt ist konzentriert bei 40 %
Primärer Antikörper, SERTSanta Cruz BiotechnologieSC-14581/500 Verdünnung
Primärer Antikörper, ChATChemicon (Millipore)AB144P1/25 Verdünnung
Primärer Antikörper, THImmunoStar229411/1.000 Verdünnung
Biotinylierter Sekundärantikörper, ZiegeVector LaboratoriesBA-95001/1.000 Verdünnung
Biotinylierter Sekundärantikörper, MausVector LaboratoriesBA-20001/1.000 Verdünnung
Vectastain Elite ABC KitVector LaboratoriesPK61008.8 µ L/ml von A und B je
3,3'-Diaminobenzidin (DAB)SigmaD56370,05 % Verdünnung. Das Produkt ist in Pulverform leicht flüchtig und giftig. Werfen Sie keinen Abfall in die Spüle.
Peroxid (H2O2) 30%Fisher scientificH-3230,005% Verdünnung
Osmiumtetroxid (OsO4)Elektronenmikroskopische Wissenschaft2% 19152
4% 19150
Ursprüngliche Lösung kann entweder 2 oder 4% sein. Achten Sie darauf, welche zur Berechnung der endgültigen Verdünnung von 1 % verwendet wird. Das Produkt ist sehr lichtempfindlich. Osmium ist hochgiftig. Nur unter einer Entlüftungshaube mit entsprechendem Schutz verwenden.
Durcupan wasserabweisendes EpoxidharzSigmaA: M Epoxidharz (44611)
B: Härter 964 (44612)
C: Beschleuniger 960 (DY 060) (44613)
D: Weichmacher (44614) 		Polymerisation 48 h bei 58 μg; C vor dem Einwerfen von Müll.
AlaunbecherElektronenmikroskopische Wissenschaft70048-01
Ethanolkommerzielle Alkohole1019CIn destilliertem Wasser mit geeigneter Konzentration verdünnen
PropylenoxidElektronenmikroskopische Wissenschaft20401Organisches Lösungsmittel. Leicht flüchtig und giftig. Unter einer Entlüftungshaube verwenden.
Unbeschichtete mittlere ObjektträgerHirnforschungslaboratorien3875-FRFettoberfläche mit Mineralöl
Kunststofffolie (Aclar Einbettfolie)Elektronenmikroskopische Wissenschaft50425-25Fettoberfläche mit Mineralöl
UltramikrotomLeica UC7EM UC7
Diamant-Trimmwerkzeug (Ultratrim)Kiesele UT 1081Kann alternativ ein Glasmesser Ultra
45 ° verwenden; Kieselalge DiamantmesserKiesele MC13437mit einem Boot ausgestattet
XyloleFisher scientificX5SK-4
150-Mesh-KupfergitterElektronenmikroskopische WissenschaftG150-cu
GitterboxElektronenmikroskopische Wissenschaft71138Kann bis zu 100 Gitter speichern
NatriumcitratAnachämie81983
BleinitratSigmaL-6258Stellen Sie eine Stammlösung aus Bleicitrat her, die aus 1,33  g Bleinitrat und 1,76 μm g Natriumcitrat verdünnt in 42 μ ml vorgekochtes und abgekühltes destilliertes Wasser, zu dem 8  mL von 1  N NaOH werden zugegeben, nachdem die Umwandlung von Bleinitrat in Bleicitrat abgeschlossen ist. Der pH-Wert sollte etwa 12 betragen. Bewahren Sie die Lösung in einer hermetischen Plastikflasche auf und schützen Sie sie vor Licht.
Spritzeterumo SS-05L5 mL
SpritzenvorsatzfilterCorning4312220,2 & Mikro; m
Absorbierendes Papier (bibulöses Papier)Elektronenmikroskopische Wissenschaft70086-1
ParafilmLaborfilmPM-999
MineralölSigmaM5904

Referenzen

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