Die gleichzeitige Auswertung der zerebralen Hämodynamik und Lichtstreuungseigenschaften der In Vivo Rattenhirn Mit Multispektral Diffuse Reflectance Imaging

Summary

Die gleichzeitige Auswertung von zerebralen Hämodynamik und den Lichtstreuungseigenschaften der in vivo Rattenhirngeweben wird ein herkömmliches multispektraler diffuses Reflexions - Bildgebungssystem unter Verwendung demonstriert.

Abstract

Die gleichzeitige Bewertung der zerebralen Hämodynamik und der Lichtstreueigenschaften von in vivo Rattenhirngewebe wird mit einem konventionellen multispektralen diffusen Reflexionsbildgebungssystem demonstriert. Dieses System besteht aus einer breitbandigen Weißlichtquelle, einem motorisierten Filterrad mit einem Satz schmalbandiger Interferenzfilter, einem Lichtleiter, einer Sammellinse, einem Videozoomobjektiv und einer monochromatischen CCD-Kamera (Charged-Coupled Device). Ein ellipsoides Schädelfenster wird in den Schädelknochen einer Ratte unter Isofluran-Anästhesie hergestellt, um in vivo multispektrale diffuse Reflexionsbilder der kortikalen Oberfläche aufzunehmen. Die Regulierung des Anteils des eingeatmeten Sauerstoffs mit Hilfe eines Gasgemischgeräts ermöglicht die Induktion verschiedener Atmungszustände wie Normoxie, Hyperoxie und Anoxie. Anschließend wird eine Monte-Carlo-Simulations-basierte multiple Regressionsanalyse für die gemessenen multispektralen diffusen Reflexionsbilder bei neun Wellenlängen (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730 und 760 nm) durchgeführt, um die zweidimensionalen Karten der Hämodynamik und die Lichtstreueigenschaften des in vivo Rattengehirns zu visualisieren.

Introduction

Multispektraler diffuse Reflektanz-Bildgebung ist die am weitesten verbreitete Technik für eine räumliche Karte der intrinsischen optischen Signale (ioss) in kortikale Gewebe zu erhalten. Ioss beobachtete in dem in - vivo - Gehirn wird hauptsächlich in drei Phänomene zurückzuführen: Variationen in der Lichtabsorption und Streueigenschaften aufgrund kortikaler Hämodynamik, Variation in der Absorption auf der Reduktion oder Oxidation von Cytochromen in Mitochondrien abhängig, und Änderungen in den Lichtstreuungseigenschaften durch morphologische Veränderungen induzierten ^1.

Licht im sichtbaren (VIS) bis zum nahen Infrarot (NIR) Spektralbereich absorbiert und wird wirksam durch biologisches Gewebe verstreut. Das diffuse Reflexionsspektrum des in - vivo - Gehirns wird durch Absorption und Streuung Spektren charakterisiert. Die reduzierten Streukoeffizienten us 'von Hirngewebe im VIS-to-NIR - Wellenlängenbereich in Folge einer monotonen Streuspektrum Exhibiting kleinere Größen bei längeren Wellenlängen. Der reduzierte Streukoeffizient μ Spektrum _S '(λ) angenähert werden kann in der Form der Potenzfunktion ^{2, 3} zu sein , wie μ _s' (λ) = a × λ ^-B. Die Streukraft b wird in lebendem Gewebe ^{2, 3} auf die Größe des biologischen Streuers verwendet. Morphologische Veränderungen des Gewebes und die Verringerung der Lebensfähigkeit von lebendem Gewebe kortikalen können die Größe der biologischen Streuer beeinflussen ^{4, 5, 6, 7, 8, 9.}

Ein optisches System zur multispektralen Abbildungs ​​diffusen Reflektanz kann leicht von einer Glühlampe Li konstruiert werdenght Quelle, einfache optische Komponenten und eine monochromatische ladungsgekoppelten Vorrichtung (CCD). Daher wurden verschiedene Algorithmen und optische Systeme für multispektraler diffuse Reflektanz Bildgebung verwendet , um kortikalen Hämodynamik und / oder Gewebemorphologie ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18} auszuwerten.

Das Verfahren in diesem Artikel beschrieben wird , verwendet , um sowohl die Hämodynamik und Lichtstreuungseigenschaften von Rattenhirngeweben in vivo sichtbar zu machen ein herkömmliches multispektraler diffusen Reflexions - Bildgebungssystem verwendet wird . Die Vorteile dieses Verfahrens gegenüber alternativen Techniken sind die Fähigkeit, Raum-Zeit-Änderungen sowohl zerebrale Hämodynamik und Rindengewebe zu bewertenMorphologie sowie ihre Anwendbarkeit auf verschiedene Funktionsstörungen des Gehirns Tiermodellen. Daher wird das Verfahren zur Untersuchung von traumatischen Hirnverletzungen, epileptischen Anfall, Schlaganfall und Ischämie geeignet sein.

Protocol

Tierpflege, Vorbereitung und experimentelle Protokolle wurden von der Animal Research Committee der Tokyo University of Agriculture and Technology genehmigt. Für diese Methode wird die Ratte in einer kontrollierten Umgebung (24 ° C, 12 h Licht / Dunkel - Zyklus), mit Futter und Wasser ad libitum untergebracht.

1. Aufbau eines herkömmlichen Multispektrale Diffuse Reflectance Imaging System

1. Halterung neun schmalbandigen optische Interferenzfilter mit Mittenwellenlängen von 500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730 und 760 nm zu den Filterlöchern der motorisierten Filterrad.
2. Konstrukt ein multispektrale Bilderzeugungssystemes einer Breitband-Weißlichtquelle verwendet wird, ein motorisiertes Filterrad mit dem obigen Satz von schmalbandigen Interferenzfilter, ein Lichtleiter, eine Sammellinse, ein Video-Zoom-Objektiv und einer monochromatische CCD-Kamera. Das Layout der optischen Komponenten, in Figur 2 gezeigt, kann für th bezeichnet werdenIst Bauverfahren.
   HINWEIS: Der Beleuchtungswinkel beträgt etwa 45 ° zur Probenoberfläche.
3. Schalten Sie die Halogenlampe ein, um die Oberfläche der Probe über einen Interferenzfilter, den Lichtleiter und die Sammellinse zu beleuchten.
4. Öffnen Sie die Bediensoftware der CCD-Kamera.

2. Tiervorbereitung

HINWEIS: In diesem Protokoll wurde die Ratte nicht für die zukünftigen Experimente verwendet und es wurde unmittelbar nach den Messungen von multispektralen Bildern geopfert.

1. Verbinden Sie die Einlassöffnung einer Induktionskammer mit dem Auslassanschluss einer Anästhesiemaschine mit einem Rohr. Verbinden Sie die Auslassöffnung der Induktionskammer mit dem Einlassanschluss der Anästhesiemaschine mit einem zweiten Rohr.
2. Legen Sie die Ratte in die Induktionskammer und induzieren Anästhesie mit 5,0% Isofluran. Bewahren Sie die Anästhesie in einer Tiefe, so dass die Ratte nicht auf Zehenstöpsel reagiert. Lower bis 2,0% Isofluran unter Verwendung eines Drehknopfes auf dem Anästhesiegerät.
3. Befestigen Sie die Ratte Kopf in einem stereotaktischen Rahmen. Bringen Sie ein Mundstück für Anästhesie an den Stereotaxierahmen.
4. Verbinden der Einlassöffnung des Mundstückes mit dem Auslassanschluss der Anästhesiemaschine mit einem Rohr. Verbinden der Auslassöffnung des Mundstückes an die Einlassöffnung der Anästhesiemaschine mit einem Rohr.
5. Shave den Kopfbereich über den prospektiven Inzisionsstelle mit Haarschneidemaschinen, bis die Hautoberfläche erscheint.
6. Führe einen Längsschnitt in etwa 20 mm lang entlang der Mittellinie des Kopfes , ein chirurgisches Skalpell (Abbildung 1 (a)) und setzt das subkutane Bindegewebe (Abbildung 1 (b)).
7. Entfernen des subkutane Bindegewebes eines scharfen Kürette oder eine Zange verwendet , und ziehe es zu beiden Seiten des Kopfes der Schädelknochen (Abbildung 1 (c)) zu belichten.
8. Dig einen ellipsenförmigen Graben auf dem Schädelknochen innerhalb der Schädel SuturES (Kranznaht, Sutura sagittalis und Lambdanaht) eine Hochgeschwindigkeits - Bohrmaschine (Abbildung 1 (d)) verwendet wird .
9. Langsam und homogen raben der Schädelknochen in den Graben, die Hochgeschwindigkeitsbohrer.
10. Drücken leicht auf der Oberfläche des gedünnten Schädels mit der Spitze der Zange die Knochendicke und Festigkeit nach einer zerebralen Blutgefß erscheint abzuschätzen. Wenn die ausgedünnten Schädel Region leicht herunterdrückt, beendet die Reduktion des Schädelknochens mit dem High-Speed-Bohrer.
11. Schneiden Sie die ellipsenförmigen Grenzlinie des ausgedünnten Schädel Stück für Stück die Spitze der Zange oder kleine chirurgische Schere.
12. Entfernen Sie den ausgedünnten Schädel von der Hirnoberfläche langsam und vorsichtig die Zange verwenden.
13. badet sanft die kranialen Fenster mit physiologischer Kochsalzlösung und ihn mit einer transparenten Glasplatte ungefähr 0,1 mm dick.

3. Die Regulierung der Fraktion des eingeatmeten Sauerstoffs

HINWEIS: Die Atmungs condition kann durch Regulierung der Anteil des eingeatmeten Sauerstoffs (FiO ₂₎ geändert werden.

1. Verwendung eines Rohres, verbinden den ersten Anschluss eines Y-förmigen Rohrverbinder (Stecker 1) mit dem ersten Port eines anderen Y-förmigen Rohrverbinder (Stecker 2).
2. Verbinden der Einlassöffnung des Mundstücks mit dem zweiten Anschluss des Rohrverbinders 1.
3. Verwendung eines Rohres, verbinden den dritten Anschluss von Rohrverbinder 1 an ein Sauerstoffkonzentrationsüberwachungsvorrichtung.
4. Mit einem Rohr, verbinden den zweiten Anschluss der Rohrverbinder 2 an den Auslaßanschluß einer Anästhesiemaschine.
5. Verwendung eines Rohres, verbinden den dritten Anschluss von Rohranschluss 2 zu dem Auslassanschluss eines Gasgemisches Vorrichtung.
6. Verbinden eine Einlassöffnung des Gasgemisch Geräts mit einem Hochdruck - 95% O _{2 bis 5%} CO ₂ Gasflasche eines Rohr verwendet wird .
7. Die andere Einlaßöffnung des Gasgemisch Geräts mit einer Hochdruck - 95% N _{2 bis 5%} CO ₂ Gasflasche eines Rohr verwendet wird .
8. Ändern Sie die Gasflussraten oF O ₂ und N ₂ unter Verwendung der Drehknöpfe auf der Gasgemischvorrichtung.
9. Überprüfen und regeln Sie den FiO ₂ mit dem Sauerstoffkonzentrationsmonitor.

4. Erfassung der multispektralen Diffuse Reflectance Images

1. Erfassung von Referenzbildern
   HINWEIS: Die in diesem Experiment verwendeten optischen Komponenten wie die Lichtquelle, die Lichtleitfaser und die Detektoren haben ihre eigenen spektralen Eigenschaften. Daher sollte die Lichtintensität, die durch diese Komponenten hindurchgeht, als Referenzbild aufgezeichnet werden. Das Referenzbild ist ein Bild, das mit einem handelsüblichen weißen Diffusor aufgenommen wurde, der mit dem Licht der Lichtquelle beleuchtet ist.
   1. Setzen Sie den Standard-Weißdiffusor waagerecht auf die Bühne.
   2. Fokussiere das Kameralinse auf die Oberfläche des weißen Diffusors, indem du den Zoomring auf dem Fass drehst.
   3. Passen Sie die Integrationszeit der Kamera an, indem Sie den entsprechenden Wert aus derDropdown-Liste der Integrationszeiten in der Betriebssoftware der Kamera, so dass die größte Menge an Licht ein Signal erzeugt, das etwa 75% der maximalen Zählungen beträgt. Während Sie das Histogramm der Pixelwerte beobachten, stellen Sie die Integrationszeit ein, bis der Signalintensitätspegel etwa 75% der maximalen Zählungen beträgt.
   4. Wählen Sie den Befehl "Speichern" aus dem Dateimenü, um ein Bild in einer Datei zu speichern.
   5. Ändern Sie die Filterposition durch Drehen des Filterrades.
   6. Speichern Sie ein Bild bei den anderen Wellenlängen gemäß dem oben beschriebenen Verfahren. Der Dateiname sollte das Sample und die verwendete Wellenlänge identifizieren ( zB W500, W520, W540 ... W760).
2. Erfassung von Musterbildern
   Anmerkung: Bilder von diffus reflektierter Lichtintensität des exponierten Rattenhirns bei neun Wellenlängen werden erfasst und auf der Festplatte eines Personalcomputers unter Verwendung der gleichen Erfassungsbedingungen gespeichert.
   1. Legen Sie die rbei auf der Bühne und langsam einstellen Bühnenniveau, so dass die Kamera auf der Oberfläche des Rattenhirns konzentrieren kann.
   2. Wählen Sie den Befehl „Speichern“ aus dem Dateimenü ein Bild in einer Datei zu speichern.
   3. Ändern der Filter Lage durch das Filterrad rotieren.
   4. Speichern eines Bildes mit den anderen Wellenlängen gemäß dem oben beschriebenen Verfahren. Der Dateiname soll die Probe und die Wellenlänge (zB R500, R520, R540 ... R760) identifizieren.
3. Erwerb von dunklen Bildern
   HINWEIS: Die CCD-Kamera eine Lichtstärke in Reaktion auf ein elektrisches Signal erzeugen kann. Allerdings gibt es einige kleinere Ausgabe aufgrund von Rauschen in den elektrischen Schaltungen und Detektoren, auch wenn kein Licht auf den Detektor gelangt; dies Dunkelstromrauschen bezeichnet. Um genau die spektrale Intensität des Lichts zu messen, sollte die Dunkelstromkomponente als ein dunkles Bild aufgenommen wird und dann aus dem gemessenen Signal subtrahiert wird. Das dunkele Bild ist ein Bild nehmenn mit dem Lichtweg blockiert.
   1. Schalten Sie die Halogenlampe als Lichtquelle aus.
   2. Blockieren den Lichtpfad zur CCD-Kamerasystem unter Verwendung einer Abschirmplatte.
   3. Wählen Sie den Befehl „Speichern“ aus dem Dateimenü ein Bild in einer Datei zu speichern. Der Dateiname soll die Probe (zB Licht) identifizieren.

5. Visualisierung der Hämoglobingehalt und die Light Scattering Parameter

HINWEIS: Eine Reihe von multispektralen diffusen Reflexions Bilder auf der Festplatte eines Personalcomputers gespeichert und analysiert offline. Eine multiple Regressionsanalyse durch eine Simulation Carlo Monte Aided ¹⁹ der Multispektral diffusen Reflexionsbilder an neun Wellenlängen (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730 und 760 nm) wird dann durchgeführt , um die zweidimensionale zu Visualisierung Karten von oxygeniertem Hämoglobin-Konzentration, von Sauerstoff befreitem Hämoglobin-Konzentration, Gesamt-Hämoglobin-Konzentration, regionalen zerebralen Sauerstoffsättigung und scatTering Macht. Der detaillierte Algorithmus wird in der Literatur ^{17, 18} veröffentlicht.

1. Subtrahierte das dunkele Bild von sowohl das Referenzbild und das Probenbild bei jeder Wellenlänge.
2. Normalisieren der Probenbild von dem Referenzbild bei jeder Wellenlänge λ. Behandle die normalisierte Bild als die diffuse Reflexionsbild R.
3. Berechnen die Extinktion (oder optische Dichte) Bild A durch den Logarithmus der reziproken der diffusen Reflexionsbild R bei jeder Wellenlänge λ unter:
   (1)
4. Generieren eine dreidimensionale Matrix durch die Absorption Bilder in der Reihenfolge ihrer Stapelung Wellenlängen, wobei die x - y - Ebene um die strukturelle Information zeigt , für die Hirnoberfläche erhalten , und die z - Achse zeigt die spektrale Information.
5. Perform eine multiple Regressionsanalyse für das Absorptionsspektrum A (λ) an jedem XY - Koordinate.
6. Verwenden Sie das Absorptionsspektrum A (λ) als abhängige Variable und der molare Extinktionskoeffizient Spektren von oxygeniertem Hämoglobin ε _HbO (λ) und von Sauerstoff befreitem Hämoglobin ε _HBr (λ) als unabhängige Variablen für Schritt 5.5 (veröffentlichte Werte für ε _HbO (λ) und ε _HBr (λ) ist in Tabelle 1) zur Verfügung gestellt.
7. Schauen Sie sich die zweidimensionalen Karten (Bilder) der drei multiple Regressionskoeffizienten a _HbO, eine _HBr und ein _0.
8. Generieren einer dreidimensionalen Matrix , die durch die Bilder der mehreren Regressionskoeffizienten in der Reihenfolge A _HbO Stapelung eine _HBr, und eine _0, wo die y - Ebene zeigt die Strukturinformationen für die Hirnoberfläche erhalten , und die z - Achse zeigt die multiple Regressionskoeffizienten.
9. Berechnen Sie die oxygenierten Hämoglobins Konzentration C _HbO, desoxygenierten Hämoglobinkonzentration C _HBr und das Streuvermögen b aus dem Satz von multiplen Regressionskoeffizienten a _HbO, eine _HBr, und eine ₀ an jedem xy unter Verwendung der folgenden empirischen Formeln Koordinate (er Werte von β _{HbO, i,} β _{HBr, i} und β _{0, i} (i = 0,1,2,3) sind in Tabelle 2):
   (2)
   (3)
   (4)
10. Überprüfen Sie die zweidimensionalen Abbildungen (Bilder) des oxygenierten Hämoglobins _HbO Konzentration C, der Sauerstoff befreitem Hämoglobin - Konzentration C _HBr und das Streuvermögen b.
11. Berechnen eine zweidimensionale Karte der Gesamthämoglobinkonzentration C _HbT durch Summieren C _HbO und C _HBr bei jedem x - y - Koordinate.
12. Berechnen eine zweidimensionale Karte der regionalen zerebralen Sauerstoffsättigung rSO ₂ durch die oxygenierten Hämoglobins _HbO Konzentration C durch die Gesamthämoglobinkonzentration C _HbT an jedem x Dividieren - y - Koordinate.

Results

Repräsentative Spektralbilder von diffusen Reflexionsvermögen von in - vivo - Rattenhirnen gewonnen sind in Abbildung 3 Die Abbildungen gezeigt bei 500, 520, 540, 560, 570 und 580 nm deutlich , ein dichtes Netz von Blutgefäßen in der Hirnrinde visualisieren. Die Verschlechterung des Kontrastes zwischen Blutgefßen und den umgebenden in den Bildern beobachteten Gewebe bei 600, 730 und 760 nm reflektiert die geringere Absorption von Licht durch Hämoglobin ...

Discussion

Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist die Entfernung der ausgedünnten Schädel Region, um den Schädel Fenster zu machen; dies sollte sorgfältig durchgeführt werden, um unerwartete Blutungen zu vermeiden. Dieser Schritt ist wichtig für den Erhalt hochwertige multispektraler Reflexionsbilder mit hohen Genauigkeit diffundieren. Die Verwendung eines Stereomikroskops ist für den chirurgischen Eingriff, wenn möglich empfohlen. Kleine Stücke von Gelatineschwamm sind nützlich für die Hämostase.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
150 W Halogenlampen-Lichtquelle	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokio, Japan	LA-150SAE
Lichtleiter	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokio, Japan	LGC1-5L1000
Sammellinse	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokio, Japan	SH-F16
Interferenzfilter l@ 500 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokio, Japan	#65088
Interferenzfilter l@ 520 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#65093
Interferenzfilter l@ 540 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#65096
Interferenzfilter l@ 560 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#67766
Interferenzfilter l@ 570 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#67767
Interferenzfilter l@ 580 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#65646
Interferenzfilter l@ 600 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#65102
Interferenzfilter l@ 730 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#65115
Interferenzfilter l@ 760 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#67777
Motorisiertes Filterrad	Andover Corporation, NH, USA	FW-MOT-12.5
8-Bit-monochrome CCD-Kamera	THE IMAGINGSOURCE, Deutschland	DMK21BU618. H
Videozoomobjektiv	Edmund Optics Japan Ltd, Tokio, Japan	VZMTM300i
Spectralon weiß Standard mit 99% diffusem Reflexionsgrad	Labsphere Incorporated, North Sutton, NH, USA	SRS-99-020