Method Article

Verbesserte Sample Multiplexing von Gewebe mit Combined Precursor Isotopenmarkierung und Isobaric Tagging (cPILOT)

DOI:

10.3791/55406

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May 1st, 2017

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1Department of Chemistry, University of Pittsburgh, 2SGS North America Inc., 3Large Molecule Analytical Development, Pharmaceutical Development & Manufacturing Science, Janssen Research and Development

In This Article

Summary

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Kombinierte Vorläufer Isotopenmarkierung und isobar Tagging (cPILOT) ist eine quantitative Proteomik-Strategie, die Probe Multiplexierungsfähigkeiten von isobar-Tags verbessert. Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung von cPILOT an Gewebe von einer Krankheit Mausmodell und Wildtyp-Kontrollen der Alzheimer.

Abstract

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Es gibt eine steigende Nachfrage viele biologischen Proben für die Krankheit Verständnis und zur Entdeckung von Biomarkern zu analysieren. Quantitative Proteomik-Strategien, die gleichzeitige Messung mehrerer Proben ermöglichen haben sie weit verbreitet und stark experimentell Kosten und -zeiten reduzieren. Unser Labor entwickelt eine Technik namens kombiniert Vorläufer Isotopenmarkierung und isobar Tagging (cPILOT), die Ansätze Probe Multiplexen der traditionellen Isotopenmarkierung oder isobar Tagging verbessert. Globale cPILOT können auf Proben angewendet werden, die von Zellen stammen, Gewebe, Körperflüssigkeiten oder ganze Organismen und gibt Informationen über relative Proteinhäufigkeiten in verschiedenen Probenbedingungen. cPILOT arbeitet durch 1) Puffer mit niedrigeren pH Bedingungen unter Verwendung von Bedingungen , um selektiv dimethylate Peptid N-Termini und 2) mit hohem pH - Puffer mit im Handel erhältlichen Reagenzien isobaren primäre Amine der Lysinreste zu kennzeichnen (siehe Tabelle der Materialien / Reagenzien). Der Grad derProbe Multiplexen verfügbar ist abhängig von der Anzahl von Vorläufern Etikett verwendet, und das isobare Markierungsreagens. Hier stellen wir eine 12-Plex-Analyse unter Verwendung von leichten und schweren Dimethylierung kombiniert mit sechs-plex isobaren Reagenzien 12 Proben von Geweben der Maus in einer einzigen Analyse zu analysieren. Verbessern Multiplexen ist hilfreich zur Reduzierung experimentelle Zeit und Kosten, und was noch wichtiger ist, so dass in vielen Vergleichsprobenbedingungen (biologische Replikaten, Krankheitsstadium, medikamentöse Behandlung, Genotypen oder longitudinale Zeitpunkt) mit weniger experimentellen Bias und Irrtum. In dieser Arbeit wird der globale cPILOT Ansatz zur Analyse Gehirn, Herzen und Lebergewebe durch biologische Replikate von einer Alzheimer-Krankheit Mausmodell und Wildtyp-Kontrollen. Globale cPILOT können andere biologische Prozesse angewandt werden, studieren und angepasst Probe Multiplexen von mehr als 20 Proben zu erhöhen.

Introduction

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Proteomik beinhaltet oft die Analyse vielen Proben verwendet, um einen besseren Krankheitsprozess, Enzymkinetik, post-translationale Modifikationen, Reaktion auf Umweltreize, als Reaktion auf therapeutische Behandlungen, die Entdeckung neuer Biomarker oder Drogen Mechanismen zu verstehen. Quantitative Methoden können relative Unterschiede in Proteinspiegeln über die Proben zu messen, können verwendet werden, und markierungsfreie oder beinhalten Isotopenmarkierung (metabolic, chemische oder enzymatisch) werden. Stabilisotopenmarkierungsverfahren haben in der Popularität gewachsen, weil sie viele Proben erlauben gleichzeitig analysiert werden und eignen sich für Proben....

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Protocol

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Ethik-Statement: Die Mäuse wurden an der Universität von Pittsburgh von einer unabhängigen, gemeinnützigen Einrichtung der biomedizinischen Forschung und beherbergten in der Abteilung für Labortier Ressourcen erworben hat. Alle Tierprotokolle wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der University of Pittsburgh genehmigt.

1. Proteinextraktion und Erzeugung von Peptiden für Chemisch-Tagging

  1. Extraktprotein aus Geweben, Zellen oder Körperflüssigkeiten.
    1. Homogenisiert 60-90 mg Gewebe (zB Gehirn, Herz und Leber) in Phosphatpuffer - Salzlösung (1x PBS) mit 8 M Harnstoff (500 & mg....

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Results

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cPILOT verwendet Aminbasis Chemie zu Label-Peptide am N-Terminus chemisch und Lysinreste und verbessert Probe Multiplexing-Funktionen. Abbildung 2 zeigt repräsentative MS - Daten , die von einem 12-plex cPILOT Analyse von Gehirn, Herz, Leber und Geweben von einer Alzheimer-Krankheit - Maus - Modell und Wildtyp - Kontrollen erhalten wird. Wie in Tabelle 1 gezeigt, zwei biologische Replikate für die Alzheimer-Krankheit und Wildtyp - Mäuse werden in dieser .......

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Discussion

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cPILOT ermöglicht die gleichzeitige Messung von mehr als 12 einzigartigen Proben. Um bei erfolgreichen Tagging, um sicherzustellen, sowohl des N-Terminus und Lysinresten von Peptiden, ist es zwingend notwendig, den richtigen pH-Wert für jeden Satz von Reaktionen zu haben und die Dimethylierung Reaktion zunächst für die Peptidmarkierung durchzuführen. Selective Dimethylierung am N-Terminus wird durch einen pH-Wert bei etwa 2,5 (± 0,2) durchgeführt. Dies wird durch Ausnutzung der Unterschiede der pKa der Aminogruppen auf .......

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Disclosures

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Acknowledgements

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Die Autoren erkennen an der University of Pittsburgh-Startfonds und NIH, NIGMS R01 Zuschuss (GM 117191-01) zu RASR.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Wasser - MS GradeFisher ScientificW6-44 L Menge ist nicht erforderlich
Acetonitril - MS GradeFisher ScientificA955-44 L Menge ist nicht erforderlich
EssigsäureJ.T. Baker9508-01
Ammoniumhydroxidlösung (28 - 30%)Sigma Aldrich320145-500ML
AmmoniumformiatAcros Organics208-753-9
AmeisensäureFluka Analytical94318-250ML-F
BCA Protein-Assay-KitPierce Thermo Fisher Scientific23227
HarnstoffBiorad161-0731
TrisBiorad161-0716
Dithiothreiotol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Iodacetamid (IAM)Acros Organics144-48-9
L-CysteinSigma Aldrich, Chemie168149-25G
L-1-Tosylamido-2-phenylethylcholormethylketon (TPCK)-behandeltes Trypsin aus der Bauchspeicheldrüse des RindersSigma Aldrich, Life ScienceT1426-100MG
Formaldehyd (CH2O)-Lösung; 36,5 - 38 % in H2OSigma Aldrich, Life ScienceF8775-25ML
Formaldehyd (13CD2O)-Lösung; 20 Gew.-% in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13CSigma Aldrich, Chemie596388-1G
Natriumcyanoborohydrid; Reagenzqualität, 95%Sigma Aldrich156159-10G
Natriumcyanoborodeuterid; 96 Atom % D, 98% CPSigma Aldrich, Chemie190020-1G
Spin Tips Strong Cation Exchange (SCX) ProbenvorbereitungskitProtea BioSciencesSP-155-24kit
Triethylammoniumbicarbonat (TEAB) PufferSigma Aldrich, Life ScienceT7408-100ML
Isobares Markierungskit (TMT 6 plex) - 6 Reaktionen (1 x 0,8 mg)Thermo Fisher Scientific90061
HydroxylaminhydrochloridSigma Aldrich, Chemie255580-100G
Standard Vortex-MischerFisher Scientific2215365jeder Mischer verwendet werden kann
Oasis HLB 1 cc (10 mg) ExtraktionskartuschenWasser186000383Dies sind C18 Kartuschen
Visiprep SPE Vakuumverteiler, DL (Einweg-Liner), 24-Port-ModellSigma Aldrich57265Ein Modell mit 12 Anschlüssen ist ebenfalls ausreichend
Speed-vacThermo ScientificSPD1010jede Marke von Speed-Vac ist ausreichend
Wasserbad-KammerThermo Scientific2825/2826Jede Marke einer Wasserbad-Kammer mit kontrollierten Temperaturen ist ausreichend.
Mechanischer Homogenisator (i.e. FastPrep-24 5G)MP Biomedicals116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 AutosamplerSciex-DiesesModell ist nicht mehr verfügbar. Jedes Nano-LC mit einem Autosampler ist ausreichend.
LTQ Orbitrap Velos MassenspektrometerThermo Scientific-DiesesModell ist nicht mehr verfügbar. Andere hochauflösende Instrumente (z.B. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion oder Orbitrap Fusion Lumos) können verwendet werden.
Protein-Software (z.B. Proteome Discoverer)Thermo ScientificIQLAAEGABSFAKJMAUH 
AnalysenwaageMettler ToledoAL54
RührplatteVWR12365-382Marken von Rührplatten sind ausreichend
pH-Meter (Tris-kompatibel)Fisher Scientific (Accumet)13-620-183Alle Marken eines pH-Messgeräts sind ausreichend
pH 10 PufferFisher Scientific06-664-261Marke von pH-Puffer 10 ist ausreichend
pH 7 Puffer Fisher Scientific06-664-260 pH-Puffer7 jeder Marke ist ausreichend
1,5 mL Eppendorf Röhrchen, 500 pkFisher Scientific05-408-129Jede Marke von 1,5 mL Eppendorf Röhrchen ist ausreichend
0,6 mL Eppendorf Röhrchen, 500 pkFisher Scientific04-408-120Jede Marke von 0,6 mL Eppendorf Röhrchen ist ausreichend
0,65 & Mikro; m Ultrafree MC DV ZentrifugalfiltereinheitenEMD MilliporeUFC30DV00
2 mL Mikrozentrifugenröhrchen, 72 EinheitenThermo Scientific69720
C18 Packungsmaterial (5  &Mikro; m, 100 Å)BrukerPM5/61100/000Dieser Artikel ist bei Bruker nicht mehr verfügbar. Alternatives Verpackungsmaterial mit den aufgeführten Spezifikationen ist ausreichend
C18 Verpackungsmaterial (5  &Mikro; m, 200 Å)BrukerPM5/61200/000Dieser Artikel ist bei Bruker nicht mehr verfügbar. Alternatives Verpackungsmaterial mit den aufgeführten Spezifikationen ist ausreichend
Alle Jede

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  2. Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B.

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cPILOTIsobaric TaggingDimethylation LabelingSample MultiplexingProteomics AnalysisTissue HomogenizationStrong Cation ExchangeMass SpectrometryAlzheimer Disease ModelBiological Replicates

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