Methodenartikel

Enzym-basierte Biosensoren Mit Tonic und Phasic Glutamate in der Alzheimer-Maus-Modellen zu messen

DOI:

10.3791/55418

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3. Mai 2017

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1Department of Psychology, West Virginia University, 2Department of Drug Discovery & Development, Auburn University, 3Department of Neuroscience, University of Kentucky Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier beschreiben wir die Setup - Software Navigation, und die Datenanalyse für eine räumlich und zeitlich genaue Methode der tonischen und phasische extrazellulären Glutamat Veränderungen in vivo Messung unter Verwendung von enzymgekoppelten Mikroelektrodenarrays (MEA).

Zusammenfassung

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Neurotransmitters Störung ist oft ein wichtiger Bestandteil von Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS), eine Rolle in der Pathologie spielen Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Depression und Angst zu Grunde liegen. Traditionell wurde, Mikrodialyse die häufigste (gelobt) -Technik Neurotransmitter Veränderungen zu untersuchen, die bei diesen Erkrankungen auftreten. Aber weil die Mikrodialyse die Fähigkeit hat, langsam 1-20 Minuten Änderungen über große Bereiche des Gewebes zu messen, hat es den Nachteil, Invasivität, potentiell zerstörte intrinsische Verbindungen im Gehirn und eine langsame Sampling-Fähigkeit. Eine relativ neuere Technik, die Mikroelektroden-Anordnung (MEA), hat zahlreiche Vorteile für die in diskreten Gehirnbereichen spezifische Neurotransmitterveränderungen messen, wie sie auftreten, so dass für eine räumlich und zeitlich präzise Annäherung. Zusätzlich MEAs unter Verwendung minimal - invasiver ist, so dass zur Messung von Veränderungen Neurotransmitter in vivo. In unserem Labor ha wirve speziell interessiert an Veränderungen des Neurotransmitters Glutamat, im Zusammenhang mit der Alzheimer-Krankheit Pathologie gewesen. Als solches hier beschriebene Verfahren wurde verwendet, um in Glutamat in einem transgenen Mausmodell der Alzheimer-Krankheit mögliche Hippocampus-Störungen zu beurteilen. Kurz gesagt, verwendet das Verfahren mit einem Enzym, einem Multi-Site-Mikroelektrode beinhaltet das Beschichten sehr selektiv für den Neurotransmitter von Interesse und unter Verwendung von sich selbst verweisende Seiten Hintergrundrauschen und Interferenten zu subtrahieren. Nach der Plattierung und die Kalibrierung kann die MEA mit einer Mikropipette ausgebildet sein und abgesenkt in die Hirnregion von Interesse einer stereotaxische Vorrichtung. Hier beschriebene Verfahren RTG (TauP301L) 4510-Mäuse anästhesiert und beinhaltet eine stereotaxische Vorrichtung unter Verwendung genau Subregionen (DG, CA1 und CA3) des Hippocampus zielen.

Einleitung

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Mess Neurotransmitter Veränderungen im Gehirn ist ein wichtiges Instrument für Neurowissenschaftler Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS), die oft gekennzeichnet durch Neurotransmitter Dysregulation studieren. Obwohl die Mikrodialyse in Verbindung mit Hochdruck - Flüssigkeitschromatographie (HPLC / EC) die am weitesten verbreitete Methode zur Messung der Veränderungen in der extrazellulären Neurotransmitter Stufen 1, 2 war, 3, 4, kann die räumliche und zeitliche Auflösung von Mikrodialysesonden nicht ideal für Neurotransmitter , wie Glutamat, die 6 in dem extrazellulären Raum 5, streng reguliert werden. Aufgrund der jüngsten Fortschritte in der Genetik und Bildgebung, gibt es weitere Verfahren , die verwendet werden können , Glutamat in vivo abzubilden. Verwendung von genetisch kodierten Glutamat fluoreszierende Reporter (iGluSnFR) eind Zwei-Photonen - Bildgebung, die Forscher in der Lage , Glutamat - Freisetzung sowohl von Neuronen und Astrocyten in vitro zu visualisieren und in vivo 7, 8, 9. Bemerkenswert ist, ermöglicht dies aus einem größeren Sichtfeld der Aufnahme und nicht die inneren Verbindungen des Gehirns stören. Während diese neuen optischen Techniken zur Visualisierung von Glutamat Kinetik und Messung von sensorisch evozierte Reaktionen und neuronale Aktivität ermöglichen, fehlt ihnen die Fähigkeit, die Menge an Glutamat in den extrazellulären Raum in diskreten Gehirnregionen zu quantifizieren.

Ein alternatives Verfahren ist die Enzym-gebundenen Mikroelektroden-Anordnung (MEA), die selektiv extrazellulärem Neurotransmitter Ebene, wie Glutamat, durch die Verwendung eines selbst referenzierten Aufzeichnungsschemas messen kann. Die MEA-Technik wird verwendet, um Veränderungen in der extrazellulären Glutamat nach traumatischem Gehirn zu studieren10 Verletzungen, 11, 12, Alterung 13, 14, Stress 15, 16, Epilepsie 17, 18, Alzheimer-Krankheit 19, 20, und die Injektion eines viralen mimic 21 und stellen eine Verbesserung gegenüber den räumlichen und zeitlichen Beschränkungen , die in Mikrodialyse. Während Mikrodialyse die Fähigkeit , in der Nähe der Synapse zu messen einschränkt 22, 23, MEAs hat eine hohe räumliche Auflösung , die in der Nähe zum selektiven Maßnahmen der extrazellulären Glutamat - Spill - over ermöglicht 24 Synapsen, 25. Zweitens ist die geringe zeitliche Auflösung der Mikrodialyse (1 - 20 min) begrenzt die Fähigkeit, die untersuchenschnelle Dynamik der Glutamatfreisetzung und Clearance in Millisekunde 26 bis Sekunden - Bereich auftritt. Da Unterschiede in der Freisetzung oder Clearance von Glutamat nicht in Maßnahmen von Tonika, Ruheglutamatwert offensichtlich sein können, kann es wichtig sein, dass die Freisetzung von Glutamat und Clearance direkt gemessen werden. MEAs ermöglichen diese Maßnahmen aufgrund ihrer hohen zeitlichen Auflösung (2 Hz) und niedrigen Nachweisgrenzen (<1 uM). Drittens erlauben MEAs zur Untersuchung der subregionalen Variationen in Neurotransmittern innerhalb einer bestimmten Hirnregion, wie die Ratte oder Maus Hippocampus. Beispielsweise unter Verwendung von MEAs wir Gyrus dentatus separat ausrichten können (DG), Ammonshorn 3 (CA3) und Ammonshorn 1 (CA1) des Hippocampus, die über eine trisynaptic Schaltung 27 verbunden sind, um subregionalen Unterschiede in extrazellulären Glutamat zu untersuchen. Aufgrund der Größe der Mikrodialysesonden (1 - 4 mm Länge) und der durch Implantation verursachten Schadens 28 </ sup>, 29, sind subregionalen Unterschiede schwer zu adressieren. Außerdem werden nur die optischen Systeme Stimulation durch externe Reize, wie beispielsweise eine whisker Stimulation oder Lichtflimmern, ermöglichen die nicht subregionalen Stimulation 7 zulässt. Ein letzter Vorteil der MEAs gegenüber anderen Methoden ist die Fähigkeit , diese Subregionen in vivo zu studieren , ohne ihre äußeren und inneren Anschlüsse zu stören.

Hier beschreiben wir , wie ein Aufzeichnungssystem (beispielsweise FAST16mkIII) in Kombination mit MEAs, bestehend aus einer auf Keramik basierende Multi - Site - Mikroelektrode, kann differentiell auf den Aufzeichnungs Seiten beschichtet wird , um störende Mittel zu ermöglichen , erfaßt und von dem Analyten - Signal entfernt werden. Wir zeigen auch Diese Arrays können für Amperometrie-basierten Untersuchungen der in vivo Glutamat Vorschrift im DG, CA3 und CA1 Hippocampus - Subregionen von betäubtem RTG (TauP301L) 4510 - Mäuse, ein häufig verwendeter m verwendet werden ,ouse Modell der Alzheimer-Krankheit. Darüber hinaus stellen wir die Bestätigung der Empfindlichkeit des MEA - Systems auf der schnelle Dynamik der Glutamatfreisetzung und Freigabe durch die Mäuse , die mit Riluzol Behandlung, ein Medikament in vitro gezeigt Glutamatfreisetzung zu verringern und Glutamataufnahme 30, 31, 32, 33 zu erhöhen, und zeigt diese jeweiligen Veränderungen in vivo im Maus - Modell TauP301L.

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Protokoll

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1. Die Beschichtung der Mikroelektroden-Array mit Enzymen oder Matrixschicht

  1. Herstellung der Proteinmatrixlösung
    1. Abwiegen 10 mg Rinderserumalbumin (BSA) und Transfer in die 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    2. Hinzufügen 985 & mgr; l DI-Wasser zu dem Mikrozentrifugenröhrchen, enthaltend BSA. Mischen Sie die Lösung durch manuelles Rühren (re-Pipettieren unter Verwendung von 1,000 & mgr; l-Pipette ~ 3-mal, bis das BSA gelöst ist).
      HINWEIS: Verwenden Sie Wirbel nicht die Lösung zu mischen, wie tun kann Luft in die Lösung so vorstellen. Außerdem setzte die Pipette auf ein Volumen <1.000 & mgr; l (zB 700 & mgr; L) zu vermeiden , Luftblasen einzuführen. Die Lösung kann in einer Mikro bei Bedarf gestellt werden.
    3. Sobald die BSA-Lösung gelöst ist, werden 5 ul 25% Glutaraldehyd-Lösung. Mischen Sie die Lösung durch das geschlossene Rohr 3 Invertierung - 5 mal. Die resultierende Lösung wird mit 1% BSA 0,125% Glutaraldehyd.
    4. Beiseite die Proteinmatrix solution für 5 min. Die Lösung wird hellgelb in der Farbe erscheinen.
  2. Vorbereiten der gewünschten Enzymlösung (zB Glutamatoxidase)
    1. Bereiten Sie die Glutamatoxidase Lösung durch Zugabe von gefilterten DI - Wasser zu dem lyophilisierten, gereinigte Enzym (beispielsweise 50 & mgr; l DI - Wasser auf 25 Einheiten Glutamatoxidase hinzugefügt 0,5 U / & mgr; l zu ergeben).
      HINWEIS: Aliquot Stammlösung ( zum Beispiel 1 & mgr; l) und speichert die Aliquots in geeigneter Größe von Behältern (beispielsweise 500 & mgr; l - Mikrozentrifugenröhrchen) bei -20 ° C. Aliquots kann für bis zu 6 Monate unter diesen Bedingungen gelagert werden.
    2. Fügen 4 ul der BSA / Glutaraldehyd-Lösung in die Mikroröhre aliquotiert Glutamatoxidase enthält. Mischen Sie die Lösung durch manuelles Rühren (re-Pipettieren mit einer 10 ul-Pipette. Die Pipette sollte auf das Volumen eingestellt werden, <5 ul). Die resultierende Lösung wird 1% BSA, 0,125% Glutaraldehyd und 0,1 U / ul Glutamatoxidase.Verwenden Sie die Lösung für sofort Beschichtung.
      Hinweis: Glutamatoxidase Beschichtungslösung kann nur innerhalb von 15 Minuten verwendet werden. Obwohl mehrere MEAs mit einer vorbereiteten Lösung können beschichtet werden, wird empfohlen, nicht die nutzbaren Zeitfenster für die Glutamat-Oxidase zu überschreiten. Die Anzahl der Elektroden, die innerhalb von 15 min beschichtet werden können, variieren. Im Allgemeinen 4 bis 6 Elektroden können gleichzeitig beschichtet werden.
  3. Die Beschichtung der MEA
    1. Typischerweise wird Mantel ein Paar von Aufnahmestelle (n) auf einer MEA mit dem gewünschten Enzym (Glutamatoxidase) und einem anderen Paar von Aufnahmestelle (n) ( ‚Sentinel‘ Seite (n)) mit dem inaktiven Protein-Matrix beschichtet ist.
    2. Verwenden stumpfe Spitze Hamilton-Mikrospritzen (beispielsweise 10 & mgr; L) zu beschichten MEAs mit L-Glutamatoxidase oder inaktiven Protein - Matrix - Lösung (BSA + Glutaraldehyd). Die verwendeten Verfahren für Enzym oder inaktive Protein-Matrix-Beschichtungen sind die gleiche.
    3. Reinigen Sie die Spritzen vor und nach Gebrauch (3 Spülungen mitDI-Wasser, 3 Spülungen mit Methanol, 5 Spülungen mit entionisiertem Wasser).
      HINWEIS: Dedicated Spritzen werden zum Auftragen von Schichten von Enzyme (Glutamatoxidase) oder Protein-Matrix verwendet. Nicht die gleiche Spritze für eine andere Lösung verwenden. Es wird empfohlen, Protein-Matrix-Beschichtungen vor dem Enzyme Beschichtungen durchzuführen.
    4. Erarbeitung Glutamatoxidase oder Proteinmatrix unter Verwendung einer 10 ul Hamilton-Spritze. Drücken Sie vorsichtig den Kolben eine kleine Wulst Lösung an der Spritzenspitze zu verzichten (visualisiert ein Präpariermikroskop verwenden).
    5. Unter Verwendung den Präpariermikroskop der MEA Aufzeichnungs an Zielstellen, die Lösung auf die entsprechende Aufnahme Seiten anwenden, indem kurz die Aufnahmestellen mit dem Lösungströpfchen / Kügelchen in Kontakt, das eine Schicht darstellt. Drei Schichten sind ausreichend, um sowohl für die Protein-Matrix und das Enzym Mantel. Dicke Schichten können die Empfindlichkeit der MEA reduzieren.
    6. Erhöhen Sie die Lösungströpfchen gerade nach oben und aus den Aufnahmen Stellen (dh die syringe Spitze sollte über die MEA Oberfläche nicht kratzen).
    7. Stellen Sie einen Timer für 1 min. Dies ist die Mindestzeit, um zwischen Beschichtungsanwendungen auf die Aufzeichnungsstelle (n). Allow enzymbeschichtete MEAs für 5-7 Tage bei 4 ° C zu härten.
    8. Notieren Sie die Anzahl der Schichten aufgetragen, wie lange es die Beschichtungen aufzubringen hat, die Elektrodennummer und einen Namen und das Datum in einem Labor-Notebook.

2. Galvanotechnik mit m-Phenylendiamin für eine verbesserte Selektivität

  1. Vorbereiten von m-Phenylendiamin - dihydrochlorid (MPD) Lösung
    HINWEIS: Glutamat / H 2 O 2 gegenüber anderen potentiell interferierende Moleküle Platte der Ausschlussschicht, mPD, um die Oxidation von Dopamin und anderen großen, Interferenten Molekülen (zB Ascorbinsäure), wodurch die Selektivität des Sensors für die Verbesserung zu verhindern.
    1. Messung 50 ml 0,05 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einem Meßkolben übertragen und 50 ml 0,05M PBS auf eine größere (150 ml) Erlenmeyerkolben.
    2. Unter Verwendung des Schlauches an einen Stickstofftank verbunden ist (beispielsweise einen Druck Ejektor verbunden , um die Rohrleitung verwendet wird ), Befestigen eine Pipettenspitze (zB P200 Spitze) an das offenen Ende des Schlauchs. Platzieren Sie den Schlauch mit der daran befestigten Pipettenspitze in PBS-Lösung und deckt die Lösung lost mit einem Parafilm. Schalten Sie Stickstoff und sanft Blase Lösung für 20 min.
    3. Man wiegt 0,045 g MPD.
      Achtung: mPD ist eine potenziell krebserregende Substanz. Mit einem Gewicht von mPD sollte mit einer Skala in einem Abzug enthaltenen durchgeführt werden. Tragen Sie Handschuhe und Maske, wenn mPD verwenden. Sicherstellen, dass die Haube funktionsfähig ist und dass der Flügel wird in der entsprechenden Arbeitsebene gezogen. Sofort saubere Oberflächen, die mit mPD kontaminiert worden sein könnten dauerhafte Färbung zu vermeiden.
    4. Nach dem sprudelnden, überträgt die MPD der entgastem PBS-Lösung. Bedecken der Kolben Öffnung mit Parafilm und sanft Drall Lösung mPD in Lösung aufzulösen. vermeiden Sie agressive Mischen oder Verwendung eines Wirbels wie damit Gase in die Lösung einführen.
    5. Die Lösung wird in einen 50-ml-Becher. Ein Rührstab ist nicht erforderlich.
  2. Galvanisieren des Elektroden
    1. Erhalten, die eine Referenzelektrode. Verwenden Sie Referenzelektroden gewidmet mPD nur Plattierung. Verwenden eine andere Bezugselektrode für Kalibrierverfahren.
    2. Positionieren des Kunststoffarmes des Referenzelektrodenhalters über den Becher. Prüfen auf Luftblasen in der Glasbezugselektrode (nicht in der Lage sein, zu sehen). flick sanft das distale Ende der Referenzelektrode keine Luftblasen an der Spitze zu entfernen.
    3. Platzieren Sie die Referenzelektrode durch die Öffnung in dem Kunststoff Arm und die unteren in das Becherglas mit PBS. Stellen Sie sicher, dass die Referenzelektrode nicht den Boden des Bechers in Berührung kommt.
    4. Verbinden der Referenzelektrode mit dem heads (zB 2 pA / mV) und eine Verbindung (zB DIP - Anschluß) die MEA mPD Platte zu seind zum heads.
    5. Senken Sie die MEA in die Becher-Lösung, so dass nur die MEA Spitze in Lösung eingetaucht ist. Sie nicht die MEA-Tipps in Flüssigkeit über den schwarzen ‚Blase‘ (die schwarze Isolierung über der MEA Spitze befindet) unterzutauchen. Andernfalls kann die MEA beschädigen.
    6. Führen Sie eine ‚Test‘ Kalibrierung die Funktionalität der Elektrodenkanäle und die Verbindung zum heads zu verifizieren.
      Hinweis: Obwohl die Hardwareeinstellungen sollten die Geräte widerspiegeln verwendet wird, bezogen Details zu Analyt / interferent Typ und die Konzentration nicht bekannt für die ‚Test‘ Kalibrierung eingegeben werden. Die Umkodierung Modus sollte ‚Amperometrie‘ sein, und die ‚V-aufgetragen‘ sollte -0.7 V. Überprüfen typische Aufzeichnung für alle Kanäle sein.
    7. Abbrechen, indem Sie auf ‚Abbrechen‘, wenn die Verbindung aller Aufzeichnungs Websites überprüft wird. Es ist nicht notwendig, um die Kalibrierungsdaten zu speichern.
    8. Wählen Sie das „Galvanisieren“ -Symbol auf dem Desktop. Die Galvanisierungol Menü erscheint. Überprüfen Sie, ob die richtigen Einstellungen eingegeben werden:
      PP Amplitude: 0,25
      Offset: -0.5
      Frequenz: 0,05
      Dauer (min): 20
    9. Wählen Sie die ‚Pause‘ Taste Plattierung zu beginnen. Die verstrichene Zeit Feld sollte das Herunterzählen beginnen.
    10. Nach Abschluss (alle Zeit verstrichen ist), wählen Sie ‚eine andere MEA‘ im Menü tauchte beginnen mPD eine zusätzliche MEA Plattierung. Ersetzen Sie den plattierte MEA mit einer MEA wird mPD plattiert und wiederholen Sie die Galvanikverfahren des Galvanik-Werkzeug.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die vorbereitete mPD Lösung verwendet nicht mehr als 2 mal oder innerhalb von 1 h Zeitraum. Eine frische Lösung mehr als 2 MEAs vorzubereiten.
    11. Wählen Sie ‚Exit-Software‘ Galvanik zu beenden. Spülen mPD plattierten Elektrodenspitzen mit DI-Wasser (eine Salzrückstand zu vermeiden) und Speicher (24 h) vor dem Kalibrieren.
    12. Entfernen Sie die Referenzelektrode aus der Lösung und Spülen mit DI-Wasser, bevor es in die entsprechenden s platzierenAGERUNG Lösung (zB 3 M NaCl). Sicherstellen, dass die Bezugselektrodenspitze wird in Lösung eingetaucht ist. Langsam untere Glasbezugselektrode in die Lösung zu vermeiden, das Glas zu beschädigen.
    13. Entsorgen MPD-Lösung in einem entsprechend gefährlichen Abfallbehälter führen.

3. Kalibrieren des MEA für Glutamate Nachweis und Selektivität (Abbildung 1) 21

  1. Herstellung der Lösungen für die Kalibrierung erforderlich.
    HINWEIS: Siehe Tabelle 1.
  2. Durchführen der Kalibrierung unter konstantem Rühren (Magnetrührer batteriebetriebenes Rührwerk) bei 37 ° C. Schalten Sie das Heizkissen oder Wasserbad zirkuliert und einen kleinen Rührstab erhalten. Rühren Sie langsam, aber schnell genug, dass, wenn eine Zugabe gemacht wird (siehe unten), wird das neue Plateau schnell erreicht.
  3. Schließen Sie den heads (2 pA / mV) an das Aufnahmesteuersystem und legen Sie die MEA Spitze in 40 ml gerührtes 0,05 M PBS (mit einem 50-ml-Becherglas).
  4. Schließen Sie den reference Elektrode. Flick das Ende, um sicherzustellen, gibt es keine Luftblasen.
  5. Öffnen Sie das Aufnahmeprogramm und klicken Sie auf „Kalibrieren“. Stellen Sie sicher, dass die Einstellungen korrekt sind (prüfen, ob Sentinel Sites wie diese ausgewählt werden, können mit verschiedenen Elektroden ändern), wählen MEA Nummer und drücken Sie „Start“.
  6. Zulassen von 5 bis 10 min zur Equilibrierung; beginnen, sobald die Ausgangswerte (<0,004 nA / min ändern) stabilisiert hat.
  7. Wählen Sie „Baseline“ und fügen Sie 500 ul von 20 mM Ascorbinsäure (interferent; final [250 & mgr; M]) und wählen Sie „Störsubstanz“ (AA ist gedacht als Gehirn weites interferent), wenn der Strom ein neues, stabiles Plateau erreicht hat, wenn irgendein. Allow 0,5-1 min zwischen den Zugaben. Wenn die MEA richtig elektroplattiert, fast sollte keine Veränderung beobachtet werden.
  8. Werden 40 & mgr; l von 20 mM L-Glutamat (endgültige [20 uM]) und einmal der Strom hat einen neuen, stabilen Plateau, Mark 1. Zugabe „Analyt“ erreicht. Wiederholen Sie dreimal für insgesamt 3 glutamate Ergänzungen.
  9. In 40 ul DA. Wählen Sie nicht „Analyte“; wählen Sie „Testsubstanz“ - DA darf nur eine interferierende in Bereichen mit DA sein.
  10. In 40 ul Peroxide. Wählen Sie nicht „Analyte“; wählen Sie „Testsubstanz“.
  11. Klicken Sie auf die „Stopp“ -Taste, sobald die Kalibrierung abgeschlossen ist.
  12. Um die Funktionalität der MEA zu bestimmen, klicken Sie auf die Registerkarte Berechnen und notieren Sie die folgenden Parameter in einem Labor-Notebook.
    1. Für das MEA - Design (3000 & mgr; m 2) in diesen Kalibrierungen verwendet, eine MEA mit einer Neigung von ≥ 0,004 nA / uM verwenden , aber niedrigeren Steigungen können für bestimmte Experimente verwendet werden. Wenn es weniger als 10% Unterschied in der Steigung zwischen Enzyme beschichtete und unbeschichtete Seiten ist, dann diese MEAs für evozierte Freisetzung verwendet nur oder reinigen / die MEA verwerfen.
    2. Verwenden einer Nachweisgrenze (LOD) ≤ 1,5 uM. Wenn die LOD größer als 1,5 & mgr; M ist, dann diese MEAs für evozierte releas verwendene und Aufnahme nur. Verwenden Sie diese Elektroden nicht Tonikum Ebenen für die Aufnahme.
    3. Verwenden , um eine Selektivität für die gewünschten Analyten (dh, Glutamat) über die Interferenten von> 20 arbiträren Einheiten. Wenn Selektivität weniger als 20 ist, dann reinigen / entsorgen Sie die MEA.
    4. Verwenden , um eine Linearität (R 2) der Kalibrierungskurve von ≥ 0,90. Wenn Linearität kleiner als 0,90 ist, dann reinigen oder MEA verwerfen.
  13. Speichern Sie die Datei mit der # der MEA, das Datum und die Initialen der Person zu kalibrieren.

4. Bauen Sie die Mikropipette

HINWEIS: Mikropipetten (Kapillar-Glas) sollten mit einem Innendurchmesser von 10 eine Spitze aufweisen, - 15 um.

  1. Platzieren Sie die Mikropipette zentral zwischen allen vier Seiten und Platin Aufnahmehalterung 50-100 um über dem MEA unter Verwendung von Klebewachs und Modelliermasse.
  2. Um die Mikropipette geladen werden, verwenden, um eine 1-ml-Spritze gefüllt mit Glutamat oder KCl-Lösung, eine 0,22 & mgr; m steriler Spritzen filter und eine 97 mm lange, 28-Gauge-Pipettierhilfe, Verfüllung die Mikropipette. Das heißt, die Nadel an der Spitze der Mikropipette und füllt im unteren Bereich der Mikropipette (das Ende in Richtung auf die MEA), um sicherzustellen, gibt es keine Luftblasen.
  3. Befestigen der Mikropipette an die Druckausstoßsystem bei 2 - 20 psi für etwa 1 s.

5. Platte der Miniatur - Referenzelektrode für die Verwendung in vivo

  1. Bereiten Sie die Plattierungslösung (50 g NaCl / 90 ml 1 M HCl in einem 100 ml-Becherglas (Plattierungsbad)), und schneidet die Badelektrode (~ 10 cm Länge von Platin (Pt) Draht (~ 0,02" ) Durchmesser).
  2. Geschnitten, um ein 10 bis 15 cm langes Stück Teflon beschichteten Silberdraht (0,008" bare) und mit einer Rasierklinge verwenden abzukratzen ~ 1 cm von Teflonbeschichtung von jedem Ende des Ende des Silberdraht.
  3. Lot eine Goldstift an einem Ende und platzieren ein Ende des belichteten Silberdraht in das Plattierungsbad.
  4. Mit Hilfe eines DC-Adapter (verwenden Sie nur einen DC-Adapter mit einer Leistung von ~ 9 mit -. 15 VDC max),klemmt den „red“ (+) Draht an die hergestellten Silberdraht (Referenzelektrode) auf der Goldstiftseite. Klemmen Sie die „schwarz“ (-) Kabel an Pt Bad Kathode.
  5. Schließen Sie den DC-Adapter. Achten Sie auf das richtige Beschichtungsverfahren - Blasen an der Badelektrode erscheinen soll; Referenzelektrode dreht ein Silber / graue Farbe.
    ACHTUNG: Verwenden Sie die Leitungen nicht wechseln [Schwarz (-) vs Rot (+)] - Plattierungsbad ruiniert werden, wenn diese und frische Lösung Plattierung auftritt , wird gemacht werden müssen. Eine schlechte Lösung wird gelb in der Farbe: nicht benutzen!
    HINWEIS: Die Beschichtungsreaktion dauert 2-5 min im allgemeinen: Ag 0 + Cl - → AgCl + e -
  6. Testen der Referenzelektrode.
    1. Stellen Sie einen Multimeter auf die 100 bis 200 mV DC-Einstellung.
    2. Legen Sie eine Benchmark (das heißt, eine zuvor getesteten Elektrode bekannt zu arbeiten) Referenzelektrode in 3 M NaCl und Test gegen die neu ausplattiert Referenzelektrode.
      HINWEIS: Wenn Sie unseine neue Referenzelektrode ing, tränken es in 3 M NaCl vor der Verwendung (12 h empfohlen).
    3. Platzieren Sie die „red“ (+) führt auf dem Goldstift der Referenzelektrode getestet werden. Legen Sie die "black" (-) führen auf Benchmark - Elektrode. Ein akzeptabler Auslesebereich beträgt ± 10 mV. 0 mV ist über die Referenzelektroden 2 ideal.

6. Allgemeine Tierchirurgie für MEA Recordings

  1. Vorbereitung für die Chirurgie
    1. Legen Chirurgie Werkzeuge in Desinfektionsmitteln in der Nacht vor.
    2. Entfernen Sie die Werkzeuge aus dem Desinfektionsmittel und spülen Sie gründlich und legen Sie die Werkzeuge auf einem sterilen OP-Pad. Besorgen Sie sich ein Heizkissen.
    3. Kalibrieren zwei Elektroden und befestigen die Mikropipette wie in Verfahren 3 und 4 beschrieben.
    4. Macht die Referenzelektrode, wie in Abschnitt 5 beschrieben.
    5. Stellen 200 uM Glutamat und 70 mM KCl. Siehe Tabelle 1.
    6. Beziehen Sie das Tier und notieren Sie ihr Gewicht auf Chirurgie Blätter.
    7. Bereiten Sie die Anästhesie und schalten Sie das Heizkissen.
  2. Führen MEA Chirurgie
    1. Verwendung von Isofluran (4% in Sauerstoff Fluss), betäubt das Tier in einer Induktionskammer, bis die Atemfrequenz deutlich zurückgegangen ist und das Tier nicht reagiert bis Fuß oder Schwanz kneift. Record Atemfrequenz und die Körpertemperatur 15 min.
    2. Legen Sie das Tier in der stereotaktischen Gerät der Ohrstäbe mit dem Kopf zu stabilisieren. Achten Sie darauf, das Tier sicher ist und der Kopf bewegt sich nicht. Senken Sie den Isofluran Fluss zu 1,5-3% in Sauerstoff. Stellen Sie sicher, dass das Heizkissen richtig unter dem Tier und auf 37 ° C positioniert ist, zusätzliche Wärme zu liefern. Failure zusätzliche Wärme bereitzustellen, kann in tiefer Hypothermie und vorzeitigen Tod des Tieres führen.
    3. Anwenden Augensalbe mit einer sterilen Watte und notieren Sie die Atemfrequenz undKörpertemperatur. Mit Hilfe eines batteriebetriebenen Trimmer, rasieren die Oberseite des Kopfes. Verwenden Sie die kleine chirurgische Schere das Fell in der Nähe der Ohren zu entfernen.
    4. An diesem Punkt setzte auf den sterilen OP-Handschuhen. Bewerben Jod und dann Alkohol (dreimal) auf die Kopfhaut.
    5. Mit einem Skalpell einen Einschnitt machen gerade in der Mitte der Kopfhaut und die Ausbreitung der Haut mit Stierhunde Klammern. Nehmen Sie einen sterilen Baumwollspitze kein Blut aufzusaugen. Verwenden Wasserstoffperoxid das Auftreten von Bregma und Lambda zu erleichtern.
    6. Überprüfen, ob der Kopf korrekt durch Messung des D / V und M / L Koordinaten Bregma und Lambda positioniert ist. Koordinatenänderungen sollte Null sein, wenn der Kopf auf einer flachen Ebene ist. Stellen Sie die Kopf- und Ohrstäbe als notwendig, eine flache Ebene zu gewährleisten.
    7. Finden Bregma und Null die Koordinaten. Unter Verwendung der gewünschten Koordinaten Bewegen nach links und rechts und eine Markierung macht einen permanenten Marker. Mit Hilfe eines Ausbrenner / Marker, machen einen großen Platz rund um die Marke mit genügend Platz die erreichengewünschte Region.
    8. Mit einem sterilen Rotationswerkzeug, bohren um die quadratische Markierung. Aufsaugmittel Blut eine sterile Baumwolle auftragen. Gründlich desinfiziert die Bohrer vor jeder Verwendung.
    9. Bringen Sie die MEA auf den heads und Verfüllung die Pipette mit der ersten gewünschten Lösung. Achten Sie darauf, eine Lücke in der Pipette ohne Lösung lassen, so dass die Lösung untersucht werden ausgestoßen wird. Bringen Sie den Schlauch an der Glas-Mikropipette.
    10. Schalten Sie den Stickstofftank und dem Druck Auswerfer (psi = 5, Zeit = 0,6 s). Test (drückt manuelle rote Taste), um die Pipette, um sicherzustellen, wird nicht vor Beginn verstopft.
    11. Kalibrieren Sie die Mikropipette. Beginnen bei 0 auf der Maske und platzieren Sie ein Stück blauen Band auf der heads den Startpunkt anzuzeigen. Schalten Sie den digitalen Lesegerät und setzen Sie ihn auf Null. Nach unten gehen 1 mm (DV) und zähle die Anzahl der Ticks die Lösung auf dem Retikel bewegt hat. 10 Ticks sollten 1 mm (1 mm = 250 nL) gleich ist, so 1 tick = 25 nL.
    12. Platzieren Sie die Referenzelektrode in einerentfernte Stelle von der MEA, so dass es immer noch in flüssigem Kontakt mit dem Gehirn ist die Schaltung zu vervollständigen.
    13. Finden Bregmas mit der MEA angebracht und Null des digitalen Leser. Bewegen, um die MEA zu den gewünschten Koordinaten. Langsam die MEA senken, bis die Spitze des Gehirns berührt. Zero die DV-Koordinate und langsam die MEA in das Gehirn senken.
    14. Auf dem Aufnahmeprogramm, klicken Sie auf die kalibrierte Elektrode gewünscht und klicken Sie dann auf „Experiment durchführen.“ Das System beginnt dann Tonikum Ebene für die Analyten von Interesse Aufnahme, während das Tier betäubt wird.
    15. Zoom auf eine Achse, die bei der Beobachtung Baseline helfen und ermöglicht es, die Elektrode auf der Basislinie für 20 - 45 min.
    16. Nachdem der Ausgangswert stabil ist, den Druck auf 0,6 s Auswerfer und 5 psi und drücken Sie den roten Knopf auf der Druck Auswerfer auszuwerfen. Aufzeichnen der Zeit und Druck sowie Volumen / bewegt Zecken auf dem Injektionsblatt (Abbildung 2). Nehmen Sie alle Notizen , die notwendig sind (dh,größere Peaks, Verwässerungseffekte, verstopfte Pipette, lauter Baseline / o-scope).
    17. Für Glutamat Injektionen, warten 3 bis 5 min zwischen den Injektionen. Für KCl warten Injektionen von 1 bis 2 Minuten zwischen den Injektionen. Injiziert den gleichen Druck und die Zeit mindestens 3-mal verwendet wird. Ändern Sie Zeit und wiederholen. Versuchen Sie nicht, Druck zu ändern, es sei denn, die Mikropipette verstopft ist.
    18. Wenn die Mikropipette verstopft ist, erhöht den Druck auf 30 psi.
    19. Datensatz aus den Hirnregionen gewünscht, auf beiden Seiten des Gehirns sie wiederholende unterschiedliche Lösungen. Nehmen Sie eine Baseline in jeder neuen Region für 20 min.
    20. Nehmen Sie die MEA mit Mikropipette befestigt, Spülen mit DI Wasser einweichen und in PBS über Nacht, bis die gesamte Blut verschwunden ist.
    21. Euthanize das Tier und speichern das Gehirn in einem vormarkiert Rohr und lagern in der -80 ° C Gefrierschrank oder Halten einer Seite zur Fixierung. Um das Tier, Überdosierung mit Isofluran (Inhalation) einschläfern. Führen Enthauptung chirurgische Scheren und seziert aus den gewünschten Bereichen.

7. Reinigung Beschichtete MEAs nach Gebrauch

  1. Reinigen Sie nicht MEAs wenn sie nicht benutzt. Wenn es Flusen oder Staub auf der Oberfläche, sauber und mit Methanol und lassen Sie sich für 24 Stunden vor der Beschichtung trocken.
  2. Schalten Sie das Wasserbad (80 ° C) und tränken die Spitze der MEA 30 min. Sorgfältig wischt die Spitze der Elektrode mit einem Baumwoll-Applikator alle Ablagerungen entfernen gekippt, die auf der Elektrodenspitze gelassen werden können. Sie nicht den schwarzen „Isolationsbereich“ der MEA nass.
  3. Unter Verwendung von drei verschiedenen Beschaller, tränken die Spitze der MEA in (1) Citrisolv, einem handelsüblichen Lösungsmittel und Klärungsmittel (2) Isopropyl ist, und (3) DI-Wasser für 5 min. Sorgfältig wischt die Spitze der Elektrode mit Baumwoll-Applikator gekippt alle Ablagerungen zu entfernen, die auf der Elektrodenspitze gelassen werden können.
  4. Untersuchen Sie die Tipps unter einem Binokular, um sicherzustellen, die Schichten wurden erfolgreich entfernt worden ist.

8. Analyse

  1. Um die Daten zu analysieren,zuerst exportieren Sie das gewünschte Experiment durch das fertige Experiment doppelklicken und „Exportieren von Daten“ aus der Datei Dropdown-Menü auswählen.
  2. Speichern Sie diese Daten in die Datei gewünschten Stelle und öffnen Sie das Analyseprogramm. Klicken Sie auf „Öffnen“ in der Analyse-Programm und wählen Sie die zuletzt gespeicherte Datei.
  3. Geben Sie das Programm ein paar Momente die Datei und dann überprüfen Experiment unter der Ereignismarkierungen Registerkarte hochladen. Unter Ausgabe der Kontrollkästchen für die gewünschten Parameter. Zum Beispiel Baseline, Amplitude, Peakfläche (Fläche unter der Kurve), T Anstieg und T 80.
  4. Klicken Sie auf Refresh und dann analysieren die Daten in eine Tabelle zu exportieren (dies kann ein paar Minuten dauern). Das Programm gibt eine Aufforderung, die Datei an die gewünschte Stelle zu speichern. Einmal gespeichert, kann die Datei in einer Tabelle bearbeitet werden.

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Ergebnisse

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Während diese Technologie Änderungen in glutamatergen verwendet werden kann, signalisieren in vielen Arten von Tiermodellen zu messen, wie traumatische Hirnverletzung, Alter, Stress und Epilepsie, hier zeigen wir, wie die MEA-Technologie verwendet werden kann glutamatergen Veränderungen in transgenen Mausmodell zu untersuchen menschlicher Tauopathie 19, 20. Die RTG (TauP301L) 4510 Maus drückt die P301L Mutation in Tau mit frontot...

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Diskussion

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Die MEA - Technik ermöglicht die Messung von schnellen Kinetik der Freisetzung von Neurotransmittern und die Aufnahme in vitro und in vivo. Daher erzeugt die Technologie, um eine Vielzahl von Datenausgabe einschließlich tonisch Neurotransmitter Ebenen, evozierte Freisetzung von Neurotransmittern und Neurotransmitter-Clearance. Da jedoch die Verwendung von MEAs ein relativ komplexer Vorgang ist, gibt es zahlreiche Faktoren, die für den erfolgreichen Einsatz optimiert müssen werden. Beispielsweise währen...

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Offenlegungen

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GG ist der alleinige Inhaber von Quanteon, LLC, die das FAST-16-Aufzeichnungssystem für die Glutamat-Messungen in dieser Studie verwendete machen. JEQ ist ein bezahlter Berater für Quanteon.

Danksagungen

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(; U54GM104942 MNR), NIA (MNR; R15AG045812), Alzheimer-Gesellschaft Diese Arbeit wurde vom National Institute of General Medical Sciences unterstützt (MNR; NIRG-12-242187), WVU Fakultät Forschungs Senat Grant (MNR) und WVU PSCOR Grants (MNR).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
FAST-16mkIII-8-KanalQuanteon16mkIII
Mikroelektroden-ArraysCenMetW4 oder 8-TRK
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-AldrichA-305910 g (verfällt nach 1 Monat)
GlutaraldehydSigma-AldrichG-6257100 mL (verfällt nach 6 Monaten)
GlutamatoxidaseUS Biological oder Sigma AldrichG4001-01 oder 10064650 UI (läuft nach 6 Monaten ab)
Hamilton SpritzenHamilton#803832 Spritzen
MethanolBDHUN12304 L
m-Phenylendiamin-Dihydrochlorid (mPD)ACROS Organics133056025025 g
Referenzelektroden (RE-5B)BASMF-20793 Elektroden
Batteriebetrieben Magnetisch RührplatteCole-ParmerEW-04804-01Kann von verschiedenen Lieferanten gekauft
werden GlutamatSigma-AldrichG-1626100 g
AscorbinsäureTCI50-81-7500 g
DopaminhydrochloridAlfa Aesar62-31-75 g
PerchlorsäureVWRUN2920500 mL
PostassiumchloridVWR7447-40-71 kg
NatriumchloridVWR7647-40-71 kg
CalciumchloridMP153502100 g
NatriumhydroxidBDH1310732500 g
Druckabwurfpipetten aus GlasCenMet
Klebriges WachsKerrlab625Kann von einem anderen Lieferanten
gekauft werdenMikrospritzeWorld Precision InstrumentsMF28G-5
ModelliermasseWalMartKann von verschiedenen Lieferanten
gekauft werden Picospritzer IIIParker
SilberdrahtAM Systeme# 786500
SalzsäureBDH76470102,5 L
PlatindrahtAM Systems778000
LötpistoleLowes oder Home DepotKann von einem anderen Lieferanten gekauft
werden MultimeterWalMartKann von einem anderen Lieferanten kaufen
PhysioSuiteKent ScientificKann von einem anderen Lieferanten kaufen
SomnoSuiteKent ScientificKann von einem anderen Lieferanten kaufen
Stereotaktisches GerätStoeltingKann von verschiedenen Lieferanten gekauft
werden Digital Lab StandardStoeltingKann von verschiedenen Lieferanten kaufen
Meiji EMZ MikroskopMeijiEMZ-5
BohrerDremelMicro
MetricideMetrex102800
ScalpelVWRKann von verschiedenen Lieferanten kaufen
OP-SchereVWRKann von verschiedenen Lieferanten gekauft
werden Sterile WattestäbchenPuritan25806Kann von verschiedenen Lieferanten kaufen
AugensalbePuralube Vet SalbeVom Tierarzt beziehen
JodtupferVWRS48050Kann von verschiedenen Lieferanten kaufen
AlkoholtupferLokale DrogerieKann von einem anderen Lieferanten gekauft
Steriles OP-TuchDynarex4410Kann von einem anderen Lieferanten kaufen
Sterile KochsalzlösungTeknovaS5815Kann mit Filtern
Wasserstoffperoxid (3%)Lokale DrogerieKann von verschiedenen Lieferanten kaufen
HeizkissenWalMartKann von verschiedenen kaufen Lieferant
werden eigene Lösung herstellen

Referenzen

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GlutamatmessungMikroelektroden Arraystonisches Glutamathippokampales Glutamatstereotaktische ChirurgieNeurotransmitterfreisetzungRiluzol Behandlung

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