Cellular Redox Profiling mit hochauflösender Mikroskopie

Summary

Dieses Papier präsentiert einen hochauflösenden Mikroskopie-Workflow zur gleichzeitigen Quantifizierung von intrazellulären ROS-Niveaus sowie mitochondrialem Membranpotential und Morphologie - gemeinsam als mitochondriale Morphofunktion bezeichnet - in lebenden adhärenten Zellen unter Verwendung der zellpermeablen fluoreszierenden Reportermoleküle 5- (und- 6) -chlormethyl-2 ', 7'-dichlordihydrofluoresceindiacetat, Acetylester (CM-H ₂ DCFDA) und Tetramethylrhodaminmethylester (TMRM).

Abstract

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) regulieren essentielle zelluläre Prozesse einschließlich Genexpression, Migration, Differenzierung und Proliferation. Allerdings induzieren übermäßige ROS-Spiegel einen Zustand von oxidativem Stress, der von irreversiblen oxidativen Schäden an DNA, Lipiden und Proteinen begleitet wird. Somit liefert die Quantifizierung von ROS einen direkten Proxy für den zellulären Gesundheitszustand. Da Mitochondrien zu den wichtigsten zellulären Quellen und Zielen von ROS gehören, ist die gemeinsame Analyse der mitochondrialen Funktion und der ROS-Produktion in denselben Zellen entscheidend für ein besseres Verständnis der Zusammenschaltung in pathophysiologischen Bedingungen. Daher wurde für die gleichzeitige Quantifizierung von intrazellulären ROS-Niveaus, mitochondrialem Membranpotential (ΔΨ _m ) und mitochondrialer Morphologie eine hochgradige mikroskopiebasierte Strategie entwickelt. Es basiert auf automatisierte Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie und Bildanalyse von lebenden adhärenten Zellen, die in Multi-Well-Platten gewachsen sind, und staineD mit den zellpermeablen fluoreszierenden Reportermolekülen CM-H ₂ DCFDA (ROS) und TMRM (ΔΨ _m und mitochondrialer Morphologie). Im Gegensatz zur Fluorimetrie oder Durchflusszytometrie erlaubt diese Strategie die Quantifizierung von subzellulären Parametern auf der Ebene der einzelnen Zelle mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung, sowohl vor als auch nach der experimentellen Stimulation. Wichtig ist, dass die bildbasierte Natur des Verfahrens die Extraktion von morphologischen Parametern zusätzlich zu den Signalintensitäten ermöglicht. Der kombinierte Feature-Set wird für die explorative und statistische multivariate Datenanalyse verwendet, um Unterschiede zwischen Subpopulationen, Zelltypen und / oder Behandlungen zu erkennen. Hier wird eine detaillierte Beschreibung des Assays gegeben, zusammen mit einem Beispielversuch, das sein Potenzial für eine eindeutige Diskriminierung zwischen zellulären Zuständen nach chemischer Störung beweist.

Introduction

Die Konzentration des intrazellulären ROS wird durch ein dynamisches Zusammenspiel zwischen ROS-produzierenden und ROS-Entschärfungssystemen akribisch reguliert. Ungleichgewicht zwischen den beiden provoziert einen Zustand des oxidativen Stresses. Unter den Hauptquellen der ROS sind Mitochondrien ¹ . Angesichts ihrer Rolle bei der Zellatmung sind sie verantwortlich für den Großteil der intrazellulären Superoxid (O ₂ ^{• -} ) - Moleküle ² . Dies ergibt sich meist aus Elektronenleckage zu O ₂ am Komplex 1 der Elektronentransportkette unter Bedingungen eines starken negativen inneren mit....

Protocol

Das nachstehende Protokoll wird für NHDF-Zellen und unter Verwendung der in der Materialdatei angegebenen Multiwell-Platten beschrieben. Siehe Abbildung 1 für einen allgemeinen Überblick über den Workflow.

1. Vorbereitung der Reagenzien

1. Bereiten Sie das vollständige Medium vor, indem Sie Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% v / v Fetal Bovine Serum (FBS) und 100 IE / ml Penicillin und 100 IE / ml Streptomycin (PS) ergänzen. Für 500 ml vollständiges Medium werden 50 ml FBS und 5 ml PS auf 445 ml DMEM gegeben.
2. Bereiten Sie HBSS-HEPES (HH) Imaging-Puffer vor, indem Sie Hank....

Results

Der Assay wurde mit mehreren Kontrollversuchen benchmarkiert, deren Ergebnisse in Sieprath et al. ¹ In kurzer Zeit wurde die Fluoreszenzantwort von CM-H ₂ DCFDA und TMRM auf fremd induzierte Veränderungen in intrazellulärem ROS und Δψ _m quantifiziert, um den dynamischen Bereich zu bestimmen. Für CM-H ₂ DCFDA zeigte NHDF eine lineare Erhöhung des Fluoreszenzsignals bei der Behandlung mit steigenden Konzentrationen von TBHP .......

Discussion

Dieses Papier beschreibt eine hochauflösende Mikroskopie-Methode zur gleichzeitigen Quantifizierung von intrazellulären ROS-Niveaus und mitochondrialer Morphofunktion in NHDF. Seine Leistung wurde mit einer Fallstudie über SQV-behandelten NHDF nachgewiesen. Die Ergebnisse unterstützen frühere Hinweise aus der Literatur, bei denen nach der Behandlung mit HIV-Protease-Inhibitoren des Typs 1 erhöhte ROS-Spiegel oder mitochondriale Dysfunktion beobachtet wurden, wenn auch in separaten Experimenten ¹⁹.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagenzien
Tetramethylrhodamin, Methylester, Perchlorat (TMRM)	ThermoFisher Scientific	T668
CM-H2DCFDA (Allgemeiner Indikator für oxidativen Stress)	ThermoFisher Scientific	C6827
Dimethylsulfoxid	Sigma)Aldrich	D8418
MatriPlate 96-Well MicroWell Platte mit Glasboden 630 & micro; L-Schwarz 0,17 mm Low Glass Lidded	Brooks Life-Science-Systeme	MGB096-1-2-LG-L
HBSS ohne Phenolrot 500 mL	Lonza	BE10-527F
DMEM mit hohem Glukosegehalt mit L-Glutamin	Lonza	BE12-604F
Phosphat Bufered Kochsalzlösung (PBS) ohne Ca und Mg	Lonza	BE17-516F
HEPES 1 M 500 mL	Lonza	17-737F
Trypsin-Versen (EDTA) Lösung	Lonza	BE17-161E
Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson	711-166-152	Antikörper zur Aufnahme von Flat-Field-Bildern
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson	711-546-152	Antikörper zur Aufnahme von Flat-Field-Bildern
Name<	strong>Unternehmen	<>Katalognummer	>Kommentare
Ausrüstung>
Nikon Ti Eclipse Weitfeldmikroskop	Nikon
Perfect Focus System (PFS)	Nikon		hardwarebasiert Autofokus System
CFI Plan Apo Lambda 20X Objektiv	Nikon
Name	Company	Katalognummer	Comments
Software
NIS Elelements Advanced Research 4.5 mit JOBS Modul	Nikon		Diese Software dient zur Steuerung des Mikroskops und zur Programmierung/Durchführung der automatischen Bildaufnahme Protokoll
ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g
RStudio Version 1.0.44	Rstudio
R Version 3.3.2