Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie

Summary

Hier beschreiben wir einen Lichtbogen-Mikroskop-Ansatz, um das Herz-CD45 ⁺ -Leukozyten-Infiltrat in einem murinen Modell der aseptischen fulminanten Myokarditis zu visualisieren, das durch die intratracheale Diphtherie-Toxin-Behandlung von CD11.DTR-Mäusen induziert wird.

Abstract

Die Lichtbogen-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) ist in Kombination mit chemischen Clearing-Protokollen zum Goldstandard für die Analyse fluoreszenzmarkierter Strukturen in großen biologischen Proben geworden und liegt in der zellulären Auflösung. Mittlerweile ermöglichen die ständige Verfeinerung der zugrunde liegenden Protokolle und die erweiterte Verfügbarkeit von spezialisierten kommerziellen Systemen die Untersuchung der Mikrostruktur ganzer Mausorgane und ermöglichen sogar die Charakterisierung des zellularen Verhaltens in verschiedenen lebenszykologischen Bildgebungsansätzen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die räumliche Vollmontage Visualisierung und Quantifizierung der CD45 ⁺ Leukozytenpopulation in entzündeten Mausherzen. Das Verfahren verwendet einen transgenen Mausstamm (CD11c.DTR), der vor kurzem als ein robustes, induzierbares Modell für die Untersuchung der Entwicklung einer fulminanten tödlichen Myokarditis, gekennzeichnet durch tödliche Herzrhythmusstörungen, gezeigt wurde. Dieses Protokoll enthält Myokarditis Induktion, intravitAl-Antikörper-vermittelte Zellfärbung, Organpräparation und LSFM mit anschließender computergestützter Bildnachbearbeitung. Obwohl es als hoch angepasstes Verfahren für unsere besondere wissenschaftliche Frage dargestellt ist, stellt das Protokoll die Blaupause eines leicht einstellbaren Systems dar, das auch ganz andere fluoreszierende Strukturen in anderen Organen und sogar in anderen Spezies ansprechen kann.

Introduction

Während der Evolution der Lichtmikroskopie erschienen viele spezialisierte Formen, die alle entwickelt wurden, um Einschränkungen im Visualisierungsprozess für bestimmte Exemplare zu minimieren. Ein solches Verfahren ist die Lichtbogen-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM). Erstmals im Jahre 1903 von Siedentopf und Zsigmondy ¹ entwickelt und Anfang der 90er Jahre ² erste biologische Grundanwendungen gefunden, ist LSFM bis heute zum leistungsstärksten mikroskopischen Werkzeug für die Visualisierung von großen Exemplaren wie intakten Mausorganen mit Fluoreszenzsignalauflösung geworden Bis auf zellulare Ebene. Aufgrund dieser Vort....

Protocol

Alle Tierversuche wurden gemäß den EU-Richtlinien durchgeführt und wurden von den zuständigen örtlichen Behörden in Essen (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Deutschland) genehmigt. Die Tiere wurden unter bestimmten pathogenfreien (SPF) Bedingungen verwendet und untergebracht.

1. Induktion der Myokarditis durch Diphtherie Toxin (DTX)

1. Bereiten Sie die DTX-Lösung für die Induktion von Myokarditis vor, indem Sie die DTX-Stammlösung mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine 1 μg / ml Arbeitslösung verdünnen.
2. Tragen Sie 100 μl dieser Lös....

Results

Der vorgestellte LSFM-Ansatz analysiert die Leukozytenverteilung und die Menge in murinen Herzen bei der Induktion einer schweren Myokarditis. Abbildung 1A erklärt das Vorbehandlungsprotokoll für die transgenen CD11c.DTR-Mäuse zur Myokarditis-Induktion. Dieser Schritt stellt den notwendigen Auslöser für die Rekrutierung von Leukozyten zum Myokard dar. Nach erfolgreicher DTX-Anwendung entwickeln die Tiere schwere Krankheitssymptome wie allgemeine Schwäche, Anorexie und Ge.......

Discussion

In der modernen Life Science spielt die mikroskopische Visualisierung biologischer Prozesse eine immer wichtigere Rolle. In diesem Zusammenhang wurden in den letzten zwei Jahrhunderten viele Entwicklungen erreicht, die helfen, Fragen zu beantworten, die bis zu diesem Punkt nicht adressierbar sind. Erstens hat es eine deutliche Tendenz gegeben, die Auflösungsfähigkeit von Lichtmikroskopen grundsätzlich zu erhöhen. Mit strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (SIM) ^{21 , 2.......}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diphtherietoxin	Sigma Aldrich	D0564
phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Biochrom	L182-10
Ketamin [50 mg/ml]	Inresa	PZN 4089014
Xylazin [2 %]	Ceva
Spritze	Braun	REF 9161502	Braun Omincan F
verweilter venöser Katheter	Becton Dickinson	REF 381923	BD Insyte Autoguard
Beatmungsgerät für Kleintiere	Harvard Apparatus	73-0044	MiniVent
anit-CD45 Antikörper (AF647)	BioLegend	103124
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Dinatriumsalzdihydrat	Carl Roth	8043.2
Katheter (21 G)	BD Biosciences	REF 387455	BD valu-set
Paraformaldehyd	Sigma Aldrich	P6148
PE Röhrchen (5 mL)	Carl Roth	EKY9.1	Rotilabo
Ethanol	Carl Roth	9065.4
Dibenzylether	Sigma-Aldrich	108014
Röhrchenrotator	Miltenyi Biotec	130-090-753	MACSmix
Agarose (niedrig gelierend)	Sigma Aldrich	A4018
Form (15 x 15 x 5 mm)	Tissue Tek	4566	Cryomold
Lichtblattmikroskop-System	LaVision Biotec		Ultramikroskop
Gehäuse für Mikroskop	Olympus		MVX10
Objektiv	Olympus		0.5  NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5  mm
sCMOS-Kamera 5,5 MP	Andor-Technologie
488 nm OPSL (50 mW) Laser	Coherent
647 nm  Diodenlaser (50 mW)	Kohärente
3D-Bildverarbeitungs- und Analysesoftware	Bitplane		IMARIS Ver. 8.3
transgener Mausstamm	Steffen Jung et al.		CD11c.DTR
wt Mausstamm	Envigo		Balb/c Ola Hsd J
Lasermodul	LaVision Biotec
MVPLAPO 2XC Objektiv